konstitutivt uttryck av utvalda gener från pentosfosfat och aromatiska vägar ökar shikiminsyrautbytet i satskulturer med hög glukos av en Escherichia coli-stam som saknar PTS och pykF

konstruktion av stammar härledda från PB12 aroK-aroL – innehållande en plasmid utformad för konstitutivt uttryck av en syntetisk operon som används vid framställning av shikiminsyra

opublicerade bevis från vårt laboratorium indikerar att produktionen av aromatiska föreningar i den laboratorieutvecklade stammen PB12 kan uppnå högre nivåer när transkriptionsinduktion av generna som är involverade i kanalisering av kolflöde i AAA-vägen sker i början av fermentationer. Med hänsyn till denna observation utvecklades en ny strategi för att optimera produktionen av SA i PB12 som bär inaktiva Arok-och aroL-gener (Figur 1). Denna strategi inkluderade design och konstruktion av en plasmid för det starka och stabila uttrycket av sex nyckelgener arrangerade i form av en syntetisk operon, kontrollerad uteslutande av en enda Trc-promotor. För att minska metabolisk börda användes en enda plasmid härledd från pBR327 som bär par locus för ökad plasmidstabilitet som vektor, efter att ha införlivat ett fragment innehållande promotorn, polylinkeren och transkriptionsterminatorerna från pTrc99A (Figur 2).

den initiala delen av operonen konstruerades genom sekventiell amplifiering och ligering av de första 4 kodande sekvenserna (aroB, tktA, arogfbr och aroE) i polylinker av plasmid pBRINT-Ts Cm, används som kloningsställning (se metoder). Senare överfördes 4-genkonstruktionen till hybridplasmiden pTrc327par i samband med ytterligare 2 gener (aroD och zwf), vilket ledde till en 8KB operon som finns i en 12kb plasmid (Figur 2). Den resulterande plasmid, benämnd pTrcAro6, transformerades till PB12 aroK-aroL-stammen utan lacIq-genen, vilket möjliggör konstitutivt uttryck av generna av intresse (Tabell 1). För enkelhetens skull benämndes den genererade PB12 aroK-aroL – lacI-stammen AR2. Efter att pykF-genen inaktiverades i AR2 fick den resulterande stammen namnet AR3. Stammar härledda från AR2 och AR3 som bär plasmid pTrcAro6 namngavs AR26 respektive AR36 (Tabell 1).

det rumsliga arrangemanget av de kodande sekvenserna som utgör den syntetiska operonen i pTrcAro6, flankerad av Trc-promotorn och transkriptionsterminatorerna, visas i Figur 2. aroB är den första genen i operonen eftersom flera bevis tyder på att dess låga uttryck är ett av de begränsande stegen i produktionen av aromatiska föreningar . Plasmid pTrcAro6 bär också tkta-och aroGfbr-generna, vars produkter är involverade i E4P-syntes och dess kondensation med PEP för att bilda DAHP, den första aromatiska föreningen (Figur 1). Arod-och aroe-gener inkluderades också för att främja en effektiv omvandling av DHQ till SA. Dessutom bär denna plasmid zwf-genen, som kodar för det första enzymet i PPP (Figur 1). Beslutet att inkludera denna gen baserades på följande observationer: 1) överuttrycket av zwf återhämtade väsentligen tillväxthastighetsförlusten på grund av plasmidmetabolisk belastning i stam JM101 som växer på glukos som enda kolkälla ; 2) Det har rapporterats att Stam PB12 visar en särskilt låg kolflödespartition vid glukos 6-fosfat (G6P) noden mot PPP (5% av den konsumerade G6P jämfört med 22% i föräldrastammen JM101). Därför bör ett överuttryck av denna gen öka NADPH-tillgängligheten, som krävs i katalytiska mängder av enzymet shikimate dehydrogenase (AroE) och kan lindra potentiella tillväxtpåverkan genom att omdirigera mer G6P mot nukleotid och aminosyrabiosyntes i stammar härledda från PB12 . De experiment som presenterades i denna rapport syftade emellertid inte till att dissekera den specifika effekten av någon utnyttjad gen utan försökte istället karakterisera konsekvenserna av att uttrycka dem alla som en operon.

för att främja en effektiv översättning av varje gen förstärktes varje kodande sekvens med hjälp av utsedda primers som introducerade en konsensus Shine-Dalgarno-sekvens belägen 8 bp uppströms om översättningsstartplatsen. Nukleotidsekvensen för den konstruerade operonen presenteras i ytterligare fil 1.

bedömning av effekterna orsakade av pykF-inaktivering i stammar som uttrycker aro6 operon

för att utvärdera effekterna orsakade av pykF-inaktivering på produktionen av SA jämfördes prestanda för produktionsstammar AR26 (pykF+) och AR36 (pykF -) med användning av skakflaskor innehållande 15 g/L Glc och 5 g/l YE. Som en kontroll inkluderades också samma stammar innehållande en tom ptrc327par-plasmid (utan Aro6-operonen), AR2e och AR3e.

även om SA ackumulerades i alla fall, som förväntat för mutanter i aroK och aroL, nådde stammarna innehållande pTrcAro6 högre sa-koncentrationer än de med en tom plasmid (figur 3b). Dessutom var SA-titern nästan två gånger högre i AR36 än i AR26 (6,1 g/L mot 3,3 g/L). En minskning av Glc-Konsumtionen observerades i stam AR26 efter ungefär 18 h odling, korrelerande med hög acetatkoncentration och ett stopp i produktionen av SA. Däremot uppvisade stam AR36 konstant Glc-konsumtion och försumbara mängder acetat producerades (figur 3C, 3D). Dessa resultat visar att generna som finns i den artificiella operonen är funktionella och främjar produktionen av SA sedan kulturens början. Deras konstitutiva uttryck minskade den specifika tillväxttakten (POV) med 25% i pykf + – bakgrunden och ökade marginellt i pykF-varianten, men orsakade inte signifikanta förändringar av den maximala producerade biomassan (Xmax) jämfört med stammar med en tom plasmid (figur 3a). Anmärkningsvärt ökade inaktiveringen av pykF-genen i de operonuttryckande stammarna under dessa tillväxtbetingelser produktionen av SA, eliminerade ackumuleringen av acetat och tillät stadig Glc-konsumtion.

beteende av stammar AR26, AR36 och deras tomma plasmidderivat, AR2e ( pykF+) och AR3e ( pykF -), med användning av skakkolvar innehållande 15 g/L Glc och 5 g/l YE (a,b,c,d) och 1 L fermentorer innehållande 100 g/L Glc och 15 g/l YE (e). a) tillväxt; b) Sa-produktion; c) Glc-konsumtion; D) acetatproduktion; e) Glc-konsumtion och SA-produktion av AR26 och AR36 i fermentorer. Felfält representerar standardavvikelse.

för att bestämma om den högre acetatproduktionen och den lägre SA-produktionen i AR26 jämfört med AR36 är en följd av den inneboende låga syretillgängligheten och försurningen av mediet i skakkolvkulturer odlades båda stammarna i 1 L batchfermentorer under kontrollerade betingelser av pH och upplöst syrespänning (DOT). Som ett tillvägagångssätt för att öka SA-titern höjdes den initiala koncentrationen av Glc i dessa experiment till 100 g/L, och YE-koncentrationen ökades samtidigt till 15 g/L för att möjliggöra högre biomassagenerering.

under dessa förhållanden producerade stam AR36 42 g/L SA i 60 h, konsumerar all Glc och ackumulerar 12 g/l acetat. Däremot producerade ar26 efter 47 h-stam maximalt 13 g/L SA, avgasade inte Glc och ackumulerade 29 g/L acetat (figur 3e och Tabell 2). Oavsett de kontrollerade betingelserna i fermentorerna, där pH hölls vid 7 och punkten var högre än 20% hela tiden, liknade produktionsprofilerna för båda stammarna beteendet som observerades i skakkolvar, med AR26 som producerar mer acetat och mindre SA. Även när den globala volymetriska Glc-konsumtionshastigheten (Qsglobal), var den uppnådda av båda stammarna lika, produktivitet, utbyte och titer var mer än dubbelt högre i AR36 än i AR26 (figur 3e och Tabell 2).

det är anmärkningsvärt att sådana stora skillnader i acetat-och SA-produktion observerades genom att endast störa en gen, vilket visar fördelarna med den kombinerade inaktiveringen av PTS och pykF vid användning av ett konstitutivt uttryckssystem i en utvecklad E. coli-stam. För att redogöra för de observerade förbättringarna i SA-produktion föreslår vi att det tidiga och konstanta uttrycket av enzymer som kodas i operonen kan upprätthålla en stadig konsumtion av glykolytiska intermediärer genom kulturerna, vilket förhindrar höga fluktuationer i deras intracellulära koncentrationer. Vi antar att kombinationen av detta stabila metaboliska tillstånd med ett reducerat flöde från PEP till pyruvat orsakat av inaktiveringen av pykF-genen kan öka tillgängligheten av PEP och andra glykolytiska prekursorer för SA-produktion utan att minska Glc-konsumtionshastigheten. Vi erkänner emellertid att i frånvaro av uppmätta intracellulära metabolit koncentrationer är dessa anmärkningar spekulativa.

Fermentationsprofiler av AR36 i batchkulturer

med hänsyn till tidigare resultat valdes AR36 för ytterligare karakterisering av dess kinetiska och stökiometriska prestanda i 1 L fermentorer. För att uppnå ett sådant syfte testades produktionen av SA med tre olika odlingsförhållanden med hög substrat. Tillväxt, Glc och biprodukter mättes för varje fall, vilket i sin tur möjliggjorde en jämförelse av produktiviteterna och avkastningen.

först användes 50 g/L Glc och 15 g/l YE (figur 4a). Tillväxten inträffade under de första 10 h, vilket genererade 6,3 g/L torrcellvikt med en 0,53 H-1-0,53 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx h. Under detta tillstånd producerades 24 g/L SA i 32 h. Glc-konsumtion och SA-produktion inträffade sedan början av jäsningen och varade fram till Glc-utmattning, även om den specifika Glc-konsumtionshastigheten (qs) och specifik SA-produktivitet (qp) var högre i exponentiell fas (tabell 3). Det resulterande utbytet av SA på Glc (YSA/Glc) var 0.47 mol/mol och den globala volymetriska SA-produktiviteten (Qpglobal) var 0.74 gSA / l * h (tabell 3). Med avseende på ackumulering av biprodukter i SA-vägen var koncentrationer av 2,4 g/L DAHP, 2,1 g/L DHS, 1,4 g/l QA, 0,4 g/l GA och 0,3 g/l DHQ närvarande i supernatanten vid slutet av jäsningen (figur 5a). Under dessa förhållanden producerades praktiskt taget inget acetat under jäsningens gång och nådde en maximal koncentration av 1,5 g/L efter 32 h (figur 4a).

Fermentationsprofil av stam AR36 odlad i 1 L bioreaktorer med tre olika substratkoncentrationer. a) 50 g/l Glc och 15 g/l YE; b) 100 g/l Glc och 15 g/l YE; c) 100 g/l Glc och 30 g/l YE. Glc: cirklar; SA: kvadrater; acetat: öppna trianglar; biomassa koncentration: inverterade trianglar. Felfält representerar standardavvikelse.

aromatiska biprodukter av SA-vägen detekteras i 1 L fermentorkulturer av stam AR36 med användning av tre olika substratkoncentrationer. a) 50 g/l Glc och 15 g/l YE; b) 100 g/l Glc och 15 g/l YE; c) 100 g/l Glc och 30 g/l YE. Ruter: DAHP (3-deoxi-d-arabinoheptulosonat 7-fosfat); kvadrater: DHQ (3-dehydrokinsyra); cirklar: DHS (3-dehydroshikiminsyra); trianglar: QA (kininsyra); inverterade trianglar: GA (gallinsyra). Felfält representerar standardavvikelse.

med tanke på att 50 g/L Glc förbrukades fullständigt initierades ett andra satsexperiment med 100 g/L Glc och 15 g/l YE. Som framgår av jämförelsen med AR26 i föregående avsnitt producerade AR36 som odlades under dessa förhållanden cirka 42 g/L SA i 60 h (figur 4b). I detta fall, efter att ha konsumerat ca 100 g/L glukos och uppnått maximal koncentration av SA, producerade stammen 12 g/l acetat. De värden som erhölls för YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax, och augiri, liknade de som erhölls med 50 g/L Glc och 15 g/l YE (tabell 3). Dessa experiment visar att när man använder samma ye-koncentration konsumeras dubbelt så mycket Glc på nästan dubbelt så mycket tid, vilket indikerar att den genomsnittliga glukosförbrukningshastigheten bibehålls mellan båda odlingsförhållandena. Koncentrationer av 4,8 g/l DAHP, 2,8 g/L DHS, 3,4 g/l QA, 0.7 g / l GA och 0,9 g / l DHQ var närvarande i supernatanten efter 60 h (figur 5b). Intressant, när man fördubblade Glc-koncentrationen ökade mellanprodukterna i AAA-vägen på ett ganska proportionellt sätt med SA, vilket indikerar att förbrukningen av 100 g/L Glc inte uppenbarligen genererade nya kolflödesflaskhalsar. Som ett resultat var mängden sa bildad med avseende på de totala producerade aromatiska föreningarna nära 80% i båda experimenten (Figur 6).

Molar procentandel av varje aromatisk förening som produceras i stam AR36 med avseende på summan i batchkulturer som börjar med: A) 50 g/l Glc och 15 g/l YE; b) 100 g/l Glc och 15 g/l YE; c) 100 g/l Glc och 30 g/l YE. Beräknade utbyten och molförhållanden för de producerade aromatiska föreningarna visas under varje stapel. Jämförelserna gjordes med koncentrationerna uppmätta i supernatanten i slutet av fermentationerna. YSA / Glc = utbyte av SA från Glc; YTAC / Glc = utbyte av totala aromatiska föreningar från Glc; Ymax = maximalt teoretiskt utbyte av aromatiska föreningar.

effekten av att öka YE på sa-produktiviteten undersöktes med en tredje uppsättning experiment med 100 g/L Glc och 30 g/l YE. Även om biomassan fördubblades vid användning av dubbelt så mycket koncentration av YE, var SA-titern, 6B och YSA/Glc mycket lik de som erhölls i kulturen med 100 g/L Glc och 15 g/l YE (figur 4B och figur 4c). I samband med data som erhållits från de andra två förhållandena tyder dessa resultat på att mängden YE I första hand bestämmer den maximala biomassa som kan uppnås. Dessutom förändrade en ökning av den initiala ye-koncentrationen inte SA-titern och stöder observationen att SA huvudsakligen produceras från glukos. Det direkta förhållandet mellan den initiala ye-koncentrationen och den maximala biomassa som genereras, oavsett den initiala Glc-koncentrationen som testats under dessa tillväxtförhållanden, antyder att ett eller flera begränsande näringsämnen levereras av YE. Det verkar också som om sådana näringsämnen inte kan syntetiseras från Glc, varför deras utarmning från YE begränsar tillväxten långt innan Glc är uttömd. Det förväntas att de aromatiska aminosyrorna och vitaminerna som finns i YE som behövs för att motverka AR36 auxotrofi kommer att bli begränsande; emellertid kan andra föreningar i detta komplexa medium också spela en roll i tillväxtbegränsning över tiden.

för en startkoncentration av 30 g/L konsumerades och producerades totalt 106 g/l Glc respektive 43 g/L SA på ungefär hälften av tiden än jäsningen med 15 g / l YE. Med 30 g/l YE ökade Qsglobal och Qpglobal dubbelt jämfört med fermentationerna med 15 g/l YE, även om SA-titern förblev oförändrad (tabell 3). Eftersom biomassan också ökade dubbelt var den beräknade qp och qs likartade mellan de tre experimenten, både i exponentiella och stationära faser, vilket uppvisade den metaboliska robustheten hos den konstruerade stammen under de testade betingelserna.

dessutom visade resultaten att en ökning av ye-koncentrationen inte ökade avsevärt koncentrationen av SA-vägintermediärer (figur 5c). I detta avseende har det erkänts att förekomsten av stora mängder mellanprodukter för vägar kan påverka återvinningen av SA från jäsningsbuljongen negativt . Denna oro har riktat några ansträngningar in i ämnet, vilket leder till testning av odlingsförhållanden, genetiska bakgrunder och användning av icke-metaboliserbara glukosanaloger, som försök att minimera biproduktgenerering .

i dessa experiment detekterades en hög andel SA i förhållande till biprodukter utan att tillämpa någon ytterligare modifiering av stammen eller processen. Koncentrationen av varje mellanväg jämfördes med summan av alla aromatiska mellanprodukter, och deras procentsatser användes för att beräkna det molära förhållandet mellan SA och Varje biprodukt vid slutet av jäsningarna (Figur 6). Förhållandet mellan SA visade sig vara högre än 10 för DHS, QA eller DAHP och högre än 40 för GA eller DHQ för alla testade substratkoncentrationer. Anmärkningsvärt var de erhållna SA-utbytena under alla förhållanden nära 50% av det teoretiska maximumet och utbytet av totala aromatiska föreningar (TAC) var över 60% av det teoretiska maximumet, uppskattat som 0.86 molTAC / molGlc (se metoder och figur 6). Detta återspeglar den effektiva omdirigeringen av glukos mot AAA-vägen i stam AR36, även vid användning av satskulturer med hög glukos. Förhållandet mellan SA och biprodukter, liksom de erhållna sa-och TAC-utbytena är ganska konstanta för alla utvärderade förhållanden och representerar enligt vår kunskap de högsta rapporterade värdena för en sa-Produktions fermenteringsprocess. Dessa förbättringar kan motiveras genom att ta hänsyn till att plattformen som finns i den konstruerade stammen möjliggör ett mer homogent uttryck av nödvändiga enzymer på en effektiv genetisk bakgrund. Detta, i motsats till andra uttryckssystem där de nödvändiga generna uttrycks från separata plasmider, under olika promotorer eller i stammar som inte är optimerade för effektiv användning av höga nivåer av Glc. Förutom fördelarna med genuttryckets dynamik är det faktum att IPTG inte behövs för att inducera aro6-operonen en viktig ekonomisk fördel för produktionsprocessen, eftersom det höga priset på IPTG begränsar dess användning i storskaliga fermentationer.

insikter om glykolytiska och acetatmetabolismer av stam AR36 av RT-qPCR

för att få en djupare inblick i de metaboliska förändringar som induceras av det konstitutiva uttrycket av aro6 syntetisk operon i stam AR36 mättes transkriptnivåer av flera gener vid tre olika tillväxtstadier i kulturer med 50 g/L Glc och 15 g/l YE. Som beskrivs i metoder, data erhållna från tidig exponentiell fas (EE), sen exponentiell fas (LE) och stationär fas (ST) normaliserades mot värdena uppmätta från stam AR3e vid EE, odlade under samma odlingsförhållanden.

resultaten indikerar att närvaron och uttrycket av operonen i stam AR36 ökar transkriptionsnivåerna för flera gener som kodar för glykolytiska enzymer under EE-och LE-faserna (Figur 1 och figur 7a). Ökningen i uttryck av gener galP och glk är särskilt intressant eftersom det har rapporterats att deras produkter kontrollerar import och fosforylering av glukos i PB12, föräldrastammen av AR36 . Dessutom finns det en signifikant ökning av transkriptionsnivåerna för SGB och ENO, men inte pykA. Dessa förändringar kan översättas till högre tillgänglighet av PEP och fruktos 6-P (som direkt kan omvandlas till E4P av plasmid-kodat transketolas), vilket ökar utbytet av aromatiska föreningar. Vi teoretiserar att den observerade uppregleringen av glykolytiska gener i stam AR36 kan vara en av konsekvenserna för låga nivåer av vissa glykolytiska mellanprodukter (glukos 6-fosfat, fruktos 6-fosfat och PEP), orsakad av det starka och konstitutiva uttrycket av de operonkodade enzymerna som konsumerar dessa metaboliter.

Transkriptionsförändringar till följd av uttrycket av aro6 syntetisk operon i stam AR36. Som jämförelse bestämdes transkriptionsnivån för varje gen vid tre olika punkter i tillväxtkurvan för stam AR36, odlad med 50 g/L Glc och 15 g/l YE (se figur 4a). Alla data normaliserades mot värdena erhållna från stam AR3e vid tidig exponentiell tillväxtfas. a) gener som kodar för glykolytiska enzymer; b) gener som är involverade i acetatassimilering och biosyntes; c) gener som ingår i den syntetiska aro6-operonen (se Figur 1 och figur 2). Svarta staplar: tidig exponentiell fas; grå staplar: sen exponentiell fas; vita staplar: stationär fas. Felfält representerar standardavvikelse.

på andra sidan modifierades inte transkriptionsnivåerna av gener som kodar för enzymer involverade i acetatbiosyntes (poxB, ackA och pta) genom närvaron av syntetisk operon, medan actP och acs, som kodar för enzymer involverade i acetatassimilering, kraftigt uppreglerades i EE-och LE-faserna (figur 7b). Uppreglering av actP-och acs-gener har också detekterats i den exponentiella tillväxtfasen i föräldrastammen PB12 som kan samanvända Glc och acetat i minimalt medium . Dessa fynd korrelerar med de låga nivåerna av acetat i det analyserade tillväxtförhållandet (figur 4a). Viktigt är att transkriptionsvärdena för dessa gener involverade i acetatassimilering var låga i ST-fas (figur 7b). Om detta svar är representativt för de andra tillväxtbetingelserna som används, kan det delvis förklara acetatackumuleringen observerad i fermentationer med 100 g/L Glc, som förbrukar högre mängder Glc under stationär fas (figur 4B och figur 4c). Dessa resultat belyser actP och acs som potentiella genmål för att artificiellt öka deras uttryck i sena odlingsstadier, dra nytta av de förväntade egenskaperna hos stam AR36 för att utnyttja samtidigt Glc och acetat, närvarande i dess föräldrastam PB12 .

generna som finns i den syntetiska operonen visade mycket starka uttrycksnivåer (även i stationär fas), vilket återspeglar promotorns konstitutiva natur och plasmidens höga kopiantal (figur 7c). Dessa resultat korrelerar med den oavbrutna Glc-konsumtionen och SA-produktionen som observerats under hela jäsningen (figur 4a), vilket tyder på att enzymerna kodade av generna i operonen är närvarande under hela odlingstiden. Det kan ses i Figur 7c att transkriptionsnivåerna för aroD och zwf är jämförelsevis högre respektive lägre än de andra fyra generna i operonen. Denna observation bör tas med försiktighet eftersom de sex generna i operonen jämförs med de som finns i kromosomen för referensstam AR3e. Eftersom de värden som erhållits för de sex generna inte normaliseras mellan dem kan variationer mellan deras kromosomala uttryck i stam AR3e förändra de relativa jämförelserna med stam AR36. Icke desto mindre överensstämmer de transkriptomiska data med det höga förhållandet mellan SA och aromatiska intermediärer erhållna under de testade betingelserna, vilket kan förväntas om alla gener i operonen uttrycktes tillräckligt. Tillsammans med kinetiska och stökiometriska data belyser dessa resultat fördelarna med att använda en konstitutivt uttryckt syntetisk operon som en alternativ strategi för att öka utbytet av SA från Glc i en utvecklad stam som saknar PTS och pykF.