Kromosommålning
8 Kromosomområden
i stället för att spridas genom kärnan upptar varje kromosom en distinkt volym, kallad ett kromosomområde. Detta har visats av kromosommålning-en fiskbaserad teknik där genomet hybridiseras till ett stort antal kromosomspecifika sonder för att möjliggöra visualisering av enskilda kromosomer i kärnan. Den radiella positioneringen av en kromosom påverkas starkt av dess sammansättning—genfattiga kromosomer tenderar att uppta positioner närmare kärnperiferin, medan genrika kromosomer oftare ligger mot det inre . Denna trend illustreras av mänskliga kromosomer 18 och 19, som är mycket lika i storlek men har mycket olika sekvenskomposition: kromosom 18 är genfattig, medan 19 är genrik. Bickmore lab använde kromosom territory FISH för att undersöka positionerna för de två kromosomerna i kärnan och fann att kromosom 18 var konsekvent belägen närmare kärnperiferin än kromosom 19 i både lymfoblastoid och fibroblastcellinjer . Den radiella positioneringen av kromosomer i kärnan befanns också vara vävnadsspecifik, med närmare besläktade celltyper som uppvisar mer liknande kromosompositionering . Det mänskliga genomet innehåller också fem akrocentriska kromosomer, innehållande rDNA-sekvenser-kromosomer 13, 14, 15, 21 och 22 som vanligtvis är grupperade runt kärnan—platsen för transkription och bearbetning av ribosomalt RNA.
den radiella regeln för kromosompositionering påverkar också placeringen av alternerande genrika och genfattiga segment inom kromosomer-i detta fall ligger genrika segment mer centralt, medan genfattiga regioner upptar regioner närmare periferin. Dessutom finns transkriptionellt inaktiva segment inom kromosomområden internt och transkriptionellt aktiva segment ligger på ytan av territoriet . Detta arrangemang tillåter transkriptionellt aktiva regioner redo tillgång till transkriptionsmaskiner och domäner rik på mRNA metaboliska faktorer såsom SC-35 foci . Men den fina detaljstrukturen hos kromosomområden är ännu oklar, vilket återspeglar vår brist på kunskap om kromatinstrukturerna som formar dem.
ur ett genomstabilitetsperspektiv avser en viktig konsekvens av kromosompositionsmönster translokationer, den vanligaste kromosomavvikelsen som ses inom den mänskliga befolkningen. Det är väl etablerat att den fysiska närheten av två kromosomer i kärnan påverkar sannolikheten för att en translokation uppträder mellan dem (Fig. 23.3).
figur 23.3. Föredragna positioner av kromosomer i kärnan påverkar translokationsfrekvensen.
kromosomer med samma föredragna radiella position i kärnan (t.ex. kromosomer 17 och 19) är mer benägna att vara involverade i translokationer än kromosomer med olika radiella positioner (t. ex. kromosomer 17 och 18).
en analys mellan frekvenserna för olika icke-patogena translokationer i den mänskliga befolkningen och de föredragna radiella positionerna för kromosomer i kärnan fann att kromosomer med liknande kärnpositioner bildar translokationeroftare än förväntat av en slump . En annan studie kunde visa närhet mellan BCR och ABL loci, involverad i den väl karakteriserade T(9; 22) translokation som bildar en “Philadelphia”-kromosom vid kronisk myeloid leukemi. Författarna visade att BCR-och ABL-loci var närmare i B–lymfocyter än i hematopoietiska stamceller, vilket tyder på att celltypspecifika aspekter av kärnorganisation kan bidra till föreningen av vissa translokationer med särskilda cancertyper. År 2013 publicerade misteli lab en studie som undersökte dynamiken i dubbelsträngsbrott och efterföljande translokationsbildning i ett elegant system: NIH3T3duo-celler kodar för ett litet antal SCEI-restriktionsenzymställen integrerade på olika kromosomer, med vissa platser intill en LacO-array och andra platser som gränsar till en TetO-array. Vid induktion av SCEI-enzymet var det möjligt att spåra rasterna som markerades med fluorescerande märkta Lac (LacR) och Tet (TetR)-repressorproteiner; translokationsbildning indikerades av långvarig, stabil samlokalisering av LacR-och TetR-signalerna. Författarna kunde visa att de flesta translokationer bildas av loci som ligger nära före brytinduktion (kontakt-första modellen), snarare än som ett resultat av en rörelse av dubbelsträngsbrott till proximala platser (brott-första modellen).
utöver metoder för analys av kromosomområden används två huvudsakliga komplementära metoder för att studera 3D-organisationen av genomet på nivå med högre ordningens domänstruktur: Fiskbaserade metoder och kromosombekräftelsemetoder. FISH förlitar sig på hybridisering av fluorescerande märkta sonder för att visualisera enskilda loci, definierade delar av genomet eller hela kromosomer. Det ger en ögonblicksbild av kärnstruktur på encellsnivå, men nackdelarna är att den är tidskrävande och ger en begränsad mängd information med låg upplösning. Kromatinkonformationsfångst (3C) tekniker förlitar sig på att “frysa” kärnstrukturen genom tvärbindande interaktioner i kärnan, ligera DNA-fragment som hålls i närheten av tvärbindningarna, följt av PCR eller nästa generations sekvensering för att identifiera hybrid-DNA-fragment, som indikerar kontakter. I det mest sofistikerade slutet kan dessa tekniker teoretiskt identifiera alla möjliga interaktioner genom genomet, men det finns också nackdelar. Till skillnad från fisk arbetar 3C-tekniker på populationer av celler snarare än på en enda cellnivå, vilket ger ett populationsgenomsnitt som kan återspegla ett antal olika kontaktkonfigurationer på en enda cellnivå. Trots försiktigheten har 3C-metoder varit mycket inflytelserika inom 3D-genomorganisationen, vilket bidrar till begreppet topologiskt associerande domäner (TADs). TADs definieras som regioner som mäter 900 kb, där kontaktkartor visar ökade interaktioner; Fiskbaserade studier har visat att sonder som ligger inom en TAD är fysiskt närmare än sonder som inte ligger inom samma TAD men åtskilda av ett liknande “linjärt” genomiskt avstånd . Det fullständiga mänskliga genomet är uppdelat i cirka 2000 TADs som också överlappar fördelningen av histonmärken och andra genomiska egenskaper såsom replikationstiming (beskrivs senare). De är emellertid inte celltypsspecifika och frågan om vilken nivå av strukturell organisation de reflekterar och deras funktionella betydelse är fortfarande öppen för debatt. Intressant nog kan translokationsfrekvensmönstret som ses med kromosomområden också spåras till organisationsnivån Tad—en studie utförd i B-celler fann att sannolikheten för translokation mellan två loci är starkt relaterad till kontaktfrekvensen mellan dem, enligt definitionen av kromosombekräftelsefångstgenererade kontaktkartor .
