Makrofagutarmning med Klodronatinnehållande liposomer minskar Neointimal bildning efter Ballongskada hos råttor och kaniner

inflammatoriska celler spelar en viktig roll i vaskulär reparation, rekryteras omedelbart efter skada.1,2 Makrofaginfiltration i aterektomivävnad och aktiveringsstatusen för blodmonocyter korrelerar med en ökad restenoshastighet.3,4 effekterna av makrofager vid restenos orsakas troligen av deras förmåga att uttrycka många tillväxtfaktorer, cytokiner och enzymer som bidrar till utvecklingen av restenos.5 således antog vi att systemisk inaktivering av monocyter och makrofager kan leda till dämpning av neointimal bildning och att makrofager spelar en central roll i patogenesen av restenos.

makrofagutarmning kan uppnås med systemisk injektion av liposomer innehållande klodronat.6 Klodronat tillhör familjen bisfosfonater (BPs), bensökande medel som är potenta hämmare av osteoklaster. Liksom andra BPs har klodronat dålig cellmembranpermeabilitet.7 liposomer tas lätt upp av celler i retikuloendotelialsystemet, i synnerhet makrofager. Liposommedierad leverans av klodronat inaktiverar och dödar makrofager efter effektiv fagocytos8 men är inte giftigt för icke-fagocytiska celler.6

metoder

liposomer

Klodronat (Sifavitor) och rhodamin RE (Avanti-polära lipider) inkapslades i liposomer bestående av 50 kg distearoyl-fosfatidylglycerol (DSPG) (Avanti), 100 ml/l kolesterol (Sigma-kemikalier) och 150 kg/L av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-Fosfokolin (dspc) (Avanti) genom omvänd Fasindunstningsteknik, som beskrivs någon annanstans.9 Den genomsnittliga storleken av liposomer var 190 18 nm, 24,5 mmol/l, och 20 mmol/l, klodronat och lipider, respektive.

validering av LC-biologisk aktivitet bestämdes på makrofagliknande råa 264-celler. LC men inte fritt klodronat minskade signifikant antalet och proliferationen av livskraftiga celler på ett dosberoende sätt och påverkade inte glattmuskelceller (SMC) eller endotelceller (EC) livskraft och proliferation vid koncentrationer upp till 500 kcal/L (data visas inte), i enlighet med publicerade data.8,10

Kaninmodell

Nya Zeeland vita kaniner (Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel) som väger 2,5 till 3.5 kg användes i enlighet med riktlinjerna för djurvård från Hebrew University of Jerusalem och National Institutes of Health (USA). Djur matades en aterogen diet med 2% kolesterol och 6% jordnötsolja, med början 30 dagar före angioplastik. Hyperkolesterolemi fastställdes (plasmakolesterol >1200 mg/dL). Djur bedövades av xylazin (7 mg/kg) och ketamin (40 mg/kg). Heparin (200 U/kg), atropin (0,05 mg) och norfloxacin nikotinat (70 mg) gavs. Ballongskada utfördes på den vänstra gemensamma halspulsådern med en 3 mm angioplastik ballongkateter (Cordis, 2 1-minutersbuljong vid 8 atm). Djur tilldelades slumpmässigt intravenöst liposomalt eller fritt klodronat (15 mg/kg), tomma liposomer eller buffert. En utredare blindad för typen av experimentgrupp utförde experimenten. Efter eutanasi med pentotal var artärer perfusion-fixerade in situ med 150 mL 4% formaldehydlösning (pH 7.4), bearbetas för morfometrisk analys, och färgas med Verhoeff elastin färgning, Mayer hematoxylin och eosin, och modifierad Movat pentakrom.

råttmodell

manliga Sabra-råttor (Harlan Laboratories), som väger 350 till 420 g, användes. Råttkarotidskademodellen utfördes som beskrivits tidigare.11,12 liposomalt klodronat (15 mg/kg) injicerades på dagarna -1 och +6. Organ skördades på dag 14 och bearbetades enligt beskrivningen ovan.

morfometrisk analys

åtta till 10 sektioner i varje bild analyserades med hjälp av datoriserad morfometrisk analys (NIH-bild) av en utredare blindad för typen av experimentgruppen. Sektionen med den största luminala förträngningen av neointima analyserades som tidigare beskrivits.11 den återstående lumen, området avgränsat av den inre elastiska lamina (original lumen) och området avgränsat av den yttre elastiska lamina (totalt arteriellt område) mättes direkt. Graden av neointimal förtjockning uttrycktes som förhållandet mellan området för neointima och den ursprungliga lumen (% stenos) och som förhållandet mellan det neointimala området till mediaområdet (N/M). Graden av ombyggnad, konstriktiv (negativ) och expansiv (positiv) och ombyggnadsförhållande (RR) uppskattades genom att jämföra förhållandet mellan det totala arteriella området för det ballongskadade segmentet med det för ett intilliggande, icke-skadat referenssegment.

flödescytometri

Antikoagulationsblod (200 oc) inkuberades i 30 minuter (4 oc C, i mörkret) med mus anti-human RPE-konjugerad Anti-CD14 (DAKO). FACS lysing lösning (1: 20 utspädning) tillsattes i 15 minuter. Resterande celler tvättades (1500 rpm, 5 minuter, 4 C) i FACS-medium (PBS, 1% BSA, 0,02% natriumazid) och suspenderades i 1 mL FACS-medium för flödescytometri. Monocyter identifierades enligt deras relativa storlek, sidospridning och fluorescens.

Distribution av liposomer

kaniner injicerades med rhodaminmärkta liposomer (0,4 mg/kg) och LC eller buffert vid dag -1 och euthaniserades vid dagarna +1 och +6. Blodmonocyter separerades med användning av en Ficoll-gradient (Sigma) och centrifugering (1500 varv per minut, 5 minuter). Skördade vävnader sköljdes i saltlösning; sektioner monterades på glidbanor och observerades med konfokalmikroskopi (Zeiss LSM 410).

immunohistokemi

Explanterade prover skars ut efter kort saltlösning perfusion och omedelbart frystes i OCT-förening för kryosektionering (Ted Pella, Inc). Slides deparaffiniserades, inkuberades med 1% H2O2 i metanol (10 minuter) för att blockera endogent peroxidas och sedan med 10% hästserum PBS i (20 minuter). Primära antikroppar för kanin RAM-11 (DAKO) eller PCNA (PC10, DAKO) applicerades i 1 timme vid 37 C. Sektioner tvättades sedan med PBS följt av biotinylerad sekundär antikropp (häst anti-mus IgG, Vektorlaboratorium) och ett avidin-biotin-peroxidasekomplex (ABC Elite kit, Vector Laboratory) i 30 minuter vardera. Utveckling av färg uppnåddes genom 5-minuters exponering för 3,3 ‘ – diaminobenzidintetrahydroklorid (dab-peroxidasubstrat, Sigma Chemical Co) i närvaro av peroxidasubstrat (Sigma). Slides var något motfärgade med Gill nr 3 hematoxylin (Sigma). Positiv färgning utvärderades under ett mikroskop (Olympus, BX40) vid 2 kg/0,25 10 kg/0.25 förstoring och digitaliserade videoramar. Förekomsten av makrofager bedömdes som den genomsnittliga procentuella arean som upptas av positivt färgade celler i 5 till 6 högeffektfält.

produktion och transkription av IL-1 iu / i

separata djurgrupper användes för dessa studier. Arterier och lever homogeniserades i kollagenasbuffert och extraherades IL-1 msk mättes med användning av kommersiella ELISA-Kit (r&D-System).

för analys av omvänd transkription–polymeraskedjereaktion (RT-PCR) extraherades RNA från halspulsåderna med användning av ett RNA-isoleringssats (Life Technologies). Kvalitet, storlek, och kvantitet av RNA undersöktes, och värdena för banden normaliserades till mRNA-uttryck för bronkialaktin.13

Matrismetalloproteinas-2-aktivitet

supernatanten av artärhomogenat i kollagenasbuffert analyserades för kollagenasaktivitet. Prover separerades på gelatinimpregnerade (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyakrylamidgeler under icke-reducerande betingelser, skakas 30 minuter i 2,5% Triton X-100 (BDH), inkuberas i kollagenasbuffert (16 timmar, 37 kcal C) och färgas med 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) i metanol/ättiksyra/H2O (30:10:60). Bandintensiteten bestämdes genom datoriserad densitometri (molekyldynamik typ 300A).

statistik

Data uttrycks som medelvärde för SD-värdet i genomsnitt. Jämförelser av histologiska fynd mellan kontroll-och behandlingsgruppen gjordes av den oparade Studentens t-test. Jämförelser av blodmonocyter och cytokiner över tid gjordes med 2-vägs ANOVA-analys. Skillnader benämndes statistiskt signifikanta vid P< 0,05.

resultat

förebyggande av Postangioplastik hyperplasi

massiv proliferation av SMCs och extracellulär matrisbildning sågs hos kontrolldjur efter ballongskada (Figur 1, a och b). Inga signifikanta skillnader hittades mellan behandling med tomma liposomer, saltlösning eller fritt klodronat i lösning (resultat poolade som kontroller). N / m-förhållandet var 1,4 0,44 (figur 1e) och luminal stenos var 75 8%. LC (15 mg/kg, dagar -1 och +6) minskade n/m-förhållandet till 0,66 0,2 0,2 (Figur 1,c, d och e) och luminal stenos till 41 8%. Mild expansiv ombyggnad inträffade i båda kontrollerna (RR=1. 22 0,24 (0,24) och LC-behandlade djur(RR=1,29 0,25 (0,25). Medialområdet, benmorfologin och mineralkompositionen påverkades inte av LC-behandling (data visas inte). Ingen öppen infektion och inga detekterbara systemiska biverkningar observerades.

för att fastställa effekten av makrofagutarmning i en icke-hyperkolesterolemisk djurmodell (inga skumceller) användes råtthalsskademodellen.11 den markerade neointima undertrycktes av LC-behandling, utan någon signifikant förändring i medial och total arteriell yta (tabell).

verkningsmekanism

reduktion av blodmonocyter och vävnadsmakrofager

monocytnivån vid baslinjen var 2, 8 0, 5% av vita blodkroppar (WBC). Före operationen, 24 timmar efter LC-injektion, reducerades monocyter kraftigt till <0,2% av den totala WBC (Figur 2,a och b), medan WBC-antalet förblev oförändrat. Tre dagar efter operationen ökade blodmonocyterna lätt till 3,5 0,4% i kontrolldjur och 0,7 0,7% i LC-behandlade djur, vilket återvände till baslinjenivåerna efter 6 dagar (figur 2C).

lever-och mjältmakrofager reducerades genom LC (RAM 11-färgning) 6 dagar efter skada (Figur 3). Det positivt färgade området i levern reducerades signifikant från 21,5 4% till 14,7 2,9% och i mjälten från 33,3 1,5% till 11,4 3% i kontroll och LC-behandlade kaniner. På liknande sätt observerades minskad arteriell RAM-11-färgning för makrofager hos LC-behandlade kaniner 3 och 6 dagar efter skada (Figur 4).

reduktion av monocyter och makrofager detekterades också genom injektion av fluorescerande liposomer (FL). Markant reduktion av den fluorescerande signalen observerades i blodmonocyter (såväl som minskat antal) och i lever och mjälte hos LC-behandlade djur (figur 5). FL upptäcktes i skadade men inte i intakta artärer. FL samtidigt med LC minskade signifikant den fluorescerande signalen i den skadade artärväggen (Figur 5).

PCNA, IL-1 kg och Matrismetalloproteinas-2

området som färgades positivt för PCNA 6 dagar efter skada reducerades signifikant från 5,6 kg 2,6% hos kontrolldjur till 1,7 kg 1,3% hos LC-behandlade kaniner (Figur 6, a och b). Neointima observerades knappast vid denna tidiga tidpunkt då SMC-proliferation är maximal.

analys av IL-1-nivåer i arteriell vävnad efter skada avslöjade ett klockformat mönster som toppade 6 dagar efter skada och återvände till basala nivåer efter 30 dagar (figur 7a), och en signifikant minskning av IL-1-nivåer observerades efter 3 och 6 dagar hos LC-behandlade djur. Hos kontrolldjur var IL-1-mRNA-transkription starkare på dag 3 än det svagare uttrycket 1 dag efter skada, men båda reducerades signifikant genom LC-behandling (figur 7b). IL-1-nivån i levern reducerades också efter en enda injektion av LC på dag -1, lutning till basala nivåer vid 30-dagar (data visas inte).

arteriell matrismetalloproteinas (MMP-2) aktivitet ökade efter skada, uppvisade ett klockformat mönster som toppade vid 6 dagar (292 26 oc) och återvände till basala nivåer vid 14 dagar (figur 7c). LC lindrade signifikant MMP-2-aktivitet, och på dag 6 var det bara 52 17-17.

diskussion

denna studie visar för första gången att inaktivering av makrofager genom systemisk administrering av liposominkapslat klodronat hämmar luminal förlust efter ballongskada hos både råttor och hyperkolesterolema kaniner. Dessa resultat validerar vår hypotes att makrofager spelar en central roll i patogenesen av accelererade arteriopatier. Den observerade ökningen av luminalområdet uppnåddes huvudsakligen genom minskning av neointimal hyperplasi. En mild ökning av expansiv ombyggnad demonstrerades också, men dess bidrag till skillnaden i luminalområdet var minimal.

Klodronat tillhör familjen BPs, läkemedel som används kliniskt vid benrelaterade störningar inklusive osteoporos. Eftersom de är mycket hydrofila och negativt laddade är fria BPs nästan oförmögna att korsa cellmembran.7 BP-upptag genom benresorberande osteoklaster (med ursprung i makrofager från blodmonocyter) inträffar när cellerna uppslukar läkemedelsbelagd ben.7 varken fritt klodronat eller LC hämmade SMC-eller EG-proliferation eller neointimal bildning. Effektiv och selektiv endocytos av klodronat i makrofager uppnås genom inkapsling av klodronat i liposomer.9,10,14 efter fagocytos stör lysosomal verkan liposomens feta dubbelskikt och fri klodronat frigörs i cellen, vilket orsakar irreversibel funktionell skada och apoptos.8,15

LC-administrering avbröt troligen det tidiga fasresponset på skada, vilket medieras av makrofagmigration som svar på MCP-1-uttryck.16 injektion av LC före skada kraftigt utarmad blodmonocyt (Figur 2) och makrofagnummer och aktivitet i levern, mjälten och skadad artärvägg (Figur 3, 4 och 5). Minskningen av monocyter som var tillgängliga vid tidpunkten för skadan minskade intimal hyperplasi, kanske liknar effekterna med deaktivering av blodmonocyter genom IL-10.17 som blockerar monocyt/makrofagmigration till det skadade kärlet från lumen och/eller adventitia (Figur 5) förhindrade effekterna av dessa celler på SMC-migration och proliferation.

IL-1 msk och MMP-2 nivåer reducerades i skadade arteriella segment efter LC-behandling. Dessa huvudprodukter av aktiverade makrofager, utsöndrade efter artärskada, bidrar till processen med neointimal proliferation.18-20 minskad SMC-proliferation kan också bidra till minskningen av IL-1 kg och MMP-2.21 eftersom LC inte påverkar SMC och ECs och inte har någon effekt på fibroblaster, 9 makrofagen är förmodligen det primära målet för LC. Inhiberingen av intimal hyperplasi i råttmodellen, utan skumceller i artären, stöder ytterligare systemisk utarmning av makrofager eftersom mekanismen Driver minskad SMC-proliferation och neointimal bildning. Sammantaget minskade denna övergående systemiska immunmodulerande och antiinflammatoriska effekt SMC-migration och proliferation och arteriell restenos.

våra resultat är samtidigt med de fördelaktiga effekterna som observerats efter modulering av makrofagfunktionen med olika metoder. Minskad neointima-bildning efter skada uppnåddes hos kaniner genom blockad av Mac-122 och hos Mac-1–bristfälliga möss.23 således, i enlighet med de senaste rapporterna, 9,17,22,23 den inflammatoriska processen spelar en central roll i kaskaden av neointima bildning. Makrofagutarmning minskar också hyperplasi av ventransplantat.24 trots den olika patologin i termer av utlösare, påverkat kärl, den underliggande placken i den angioplastierade artären, sammansättningen av den stenotiska vävnaden och processens varaktighet, antyder den positiva effekten i ventransplantatmodellen en gemensam roll för makrofager för att stimulera vaskulär intimal hyperplasi.

implikationer och begränsningar

fritt klodronat genomsyrar inte celler och har en kort halveringstid i den systemiska cirkulationen.6 Klodronat som läcker från döda makrofager och liposomer ackumuleras inte i betydande utsträckning i andra vävnader än ben. Ingen effekt sågs på somatisk tillväxt eller på serummineralinnehåll efter LC-behandling, eftersom resultatet av den liposomala formuleringen, som med de flesta andra liposomer och partikelformiga läkemedelsleveranssystem, var i retikuloendoteliala systemet. Dessutom bör två injektioner av 15 mg/kg fritt klodronat inte ha någon effekt på normalt ben.25

inaktivering av makrofager medför risk för immunsuppression och infektion. Men som i studier på Mac-1-bristande mice26 och råttor observerades 24 ingen öppen infektion i vår studie med övergående makrofagutarmning. Blodmonocyter återhämtade sig fullständigt i denna studie 6 dagar efter injektion och IL-1 kg-koncentrationerna återvände till basala nivåer. Andra har visat att återvinning av makrofagfunktion 4 till 6 dagar efter LC-inducerad utarmning inducerar inga långsiktiga toxiska effekter.6,14 de kliniska konsekvenserna av övergående, partiell utarmning av lever-och mjältmakrofager med systemisk LC bör undersökas ytterligare i humana studier.

ett stort antal rapporter om farmakologiska försök att hämma intimal hyperplasi hos djur översattes inte till efterföljande hämning av restenos hos människor. Den aktuella studien använder LC som ett undersökande verktyg för att belysa inflammationens roll i vaskulär reparation och det möjliga värdet av modulerande medfödd immunitet vid reduktion av postinjury intimal hyperplasi. Att fördelen observerades i två djurmodeller, råttan och den hyperkolesterolemiska kaninen, med olika skador och olika grader av inflammation, stöder monocyternas och makrofagernas stora roll i vaskulär reparation och ökar det prediktiva värdet för hämning av restenos hos människor.

Makrofagrika områden är vanliga i aterosklerotiska lesioner hos patienter med instabil angina och akut hjärtinfarkt,3 och makrofager förmedlar förmodligen bristning av den aterosklerotiska placken och plötslig uppkomst av akuta koronarsyndrom.27 ytterligare studier är motiverade för att undersöka om makrofagutarmning av liposomala bisfosfonater kan ge en strategi för att stabilisera andra inflammatoriska medierade vaskulopatier och kardiomyopatier, inklusive akuta koronarsyndrom.

Sammanfattningsvis hämmade administrering av LC neointimal proliferation efter ballongskada hos råtta och i hyperkolesterolemiska kaninmodeller. Den föreslagna mekanismen är systemisk selektiv, övergående modulering av monocyt/makrofagaktivitet. Makrofager, även om de är relativt magra i neointimal vävnad, spelar en viktig roll i processen med neointimal proliferation. Därför minskar tidig modulering och inaktivering av makrofager i 1 vecka efter skada signifikant postangioplastisk arteriell förträngning vid ett senare tillfälle.

fotnoter