minsta Information för rapportering om Kometanalysen (MIRCA): rekommendationer för att beskriva kometanalysförfaranden och resultat

MIRCA-riktlinjerna har utarbetats av medlemmar av hCOMET COST Action med målet att förbättra analysen och rapporteringen av kometanalysresultat (http://www.hcomet.eu/). Författarna är experter på kometanalys med minst åtta års erfarenhet av dessa analyser (15 av författarna har >20 års relevant erfarenhet). Vi har använt ett internetbaserat frågeformulär för att prova åsikter från författarna om vikten av att rapportera detaljer (Tabell 1; kompletterande Data). Varje del av informationen klassificerades av författarna som ‘väsentlig’, ‘önskvärd’ eller ‘inte viktig’, och en tröskel på 75% kongruens för klassificeringarna användes. Om antalet svar på viktig information inte nådde tröskelvärdet på 75%, kombinerades svaren på viktig information och önskvärd information, och informationen klassificerades som önskvärd information om 75% av upphovsmännen i Brasilien enades om att den var antingen nödvändig eller önskvärd. I Tabell 1 innehåller vi förklarande anmärkningar för varje rekommendation.

specifika MIRCA-rekommendationer för varje steg i kometanalysen

steg 1A: Isolering av celler och beredning av encelliga suspensioner

eftersom kometanalysen använder suspensioner av enstaka celler, måste prover som inte erhålls som enstaka celler behandlas mekaniskt eller enzymatiskt för att störa bindningen av celler till en extracellulär matris eller till varandra. Homogenisering av vävnader genom mekanisk störning kan i sig orsaka DNA-skada, medan den enzymatiska matsmältningen av vävnad kan leda till avlägsnande av DNA-lesioner på grund av aktiviteten hos endogena DNA-reparationsenzymer eller öka DNA-skadenivåerna genom att frigöra nukleaser från cellerna. Sammansättningen av homogeniseringsbufferten är ‘önskvärd’ information, särskilt när det gäller de komponenter som är nödvändiga för att bevara DNA-integritet (t.ex. etylendiamintetraättiksyra)24,25. En beskrivning av förfarandet för isolering av encelliga suspensioner, inklusive homogenisering av vävnaden, anses vara önskvärd information att rapportera i artiklar.

blodprover används ofta i humana biomonitoreringsstudier. Eftersom blod representerar en heterogen population av celler är detaljerad information om cellpopulationen ‘väsentlig’ i publikationer. Texten ska exakt beskriva om proverna är helblod (inklusive röda blodkroppar), leukocyter, mononukleära blodkroppar eller en delmängd av celler (t.ex. lymfocyter). Det kan också vara till hjälp att inkludera information om proceduren för venipunktur, typ av antikoagulant och efterföljande metod för cellisolering (dvs centrifugering och tvättsteg) för dem som upprepar experimentet, så detta klassificeras som ‘önskvärd’ information. Information om lagringsförhållandena för cellerna eller vävnaderna om de är kryokonserverade, liksom frysmetoden (t.ex. snäppfrysning på torris eller i flytande kväve, eller ett långsamt frysningsförfarande) och upptiningsförfarande anses vara väsentlig information att rapportera, eftersom dessa processer har visat sig påverka den basala nivån av DNA-migration26.

steg 1B: Beredning av substratceller för DNA-reparationsanalysen in vitro

vilken eukaryot celltyp som helst kan användas som substratcell för DNA-reparationsanalysen in vitro, och celltyp och densitet är ‘önskvärd’ information att rapportera. Det är viktigt att rapportera metoden och typen av genotoxisk förening som används för att inducera DNA-lesioner i substratcellerna och efterföljande celllagringsförhållanden, medan den totala nivån av DNA-lesioner som kan detekteras i substratcellerna (t. ex., antalet formamidopyrimidin-DNA-glykosylaskänsliga platser i celler behandlade med Ro19-8022 plus ljus) anses endast vara ‘önskvärd’ information.

steg 1C: Analyskontroller

i den här artikeln hänvisar analyskontroller till prover som ingår i varje kometanalysexperiment; dessa kallas ibland referensstandarder, interna kontroller eller tekniska kontroller16, 27. Analyskontrollerna är vanligtvis kryokonserverade alikvoter från en enda sats av celler som har exponerats för ett DNA-strängbrytande medel (t. ex. eller metylmetansulfonat) eller en behandling som orsakar en specifik typ av DNA-lesion (t.ex. fotosensibiliseraren Ro19-8022 plus ljus eller kaliumbromatbehandling för att inducera DNA-oxidation). Det finns olika analyskontroller för standard alkalisk kometanalys och enzymmodifierad kometanalys. Föreningen som används för den enzymmodifierade analysen bör inte generera DNA-strängbrott, eftersom dessa minskar det dynamiska området för de enzymkänsliga ställena. I biomonitoreringsstudier, såväl som tvärsnitts -, interventionella och kliniska studier, kan oexponerade celler användas som analyskontroller. Det är viktigt att rapportera skadenivåer i analyskontroller och analysvariation (standardavvikelse) i både standard-och enzymmodifierad kometanalys.

in vitro-DNA-reparationsanalysen använder interna experimentella kontroller, som också används vid beräkningen av reparationsaktiviteten, snarare än analyskontroller i sig. Det är väsentlig information för att rapportera nivån på DNA-reparationsinsnitt i nukleoider från i) icke-exponerade substratceller som inkuberats med reaktionsbuffert, för att bestämma den basala nivån på DNA-skador i substratdnaet (dvs. bakgrundskontrollen), ii) exponerade celler som inkuberats med reaktionsbufferten, för att avslöja nivån på eventuella icke-specifika DNA-strängbrott eller abasiska ställen som härrör från behandlingen med det skadliga medlet (dvs. behandlingskontrollen); iii) icke-exponerade substratceller som inkuberats med proteinextrakt från provet, för att kontrollera ospecifik snitt-eller klyvningsaktivitet (dvs. specificitetskontrollen), och iv) exponerade substratceller som inkuberats med lesionsspecifikt enzym, liknande analyskontroller för den enzymmodifierade kometanalysen (dvs. inkubationsreaktionskontrollen).

steg 1D: negativa och positiva kontroller

i denna artikel hänvisar negativa och positiva kontroller till experimentgrupperna, som beskrivs i OECD-riktlinjen (TG 489) för in vivo kometanalys i djurvävnader18. Således avser negativa och positiva kontroller hela experimentet. En positiv kontroll avser en direkt-eller indirekt verkande genotoxisk förening som producerar DNA-strängbrott eller enzymkänsliga platser som detekteras med kometanalysen. För den enzymmodifierade kometanalysen finns det ingen lista över positiva kontroller tillgängliga som motsvarar de föreningar som OECD listar som positiva kontroller för alkalisk kometanalys (för att inducera DNA-strängbrott) i specifika djurvävnader. Dessutom finns det ingen positiv kontroll för mänskliga biomonitoreringsstudier, eftersom friska människor inte medvetet kan utsättas för ett genotoxiskt medel. Positiva kontroller anses redan vara obligatoriska i cellodlingsexperiment inom genetisk toxikologi och kommer de facto att vara ‘väsentlig’ information i artiklar som använder kometanalysen. I djurstudier, men för praktiska ändamål kometdata om analyskontroller (dvs., prover som nämns i avsnittet ovan med titeln ‘steg 1C, Analyskontroller’) är tillräckliga, medan resultaten från verkliga negativa och positiva kontroller anses vara ‘önskvärd’ information.

steg 2: inbäddning av cellerna i agaros

kometanalysen utvecklades ursprungligen med tre lager agaros på glasskivor, med Mellanskiktet innehållande cellerna. Emellertid är det översta lagret av agaros inte nödvändigt, och vissa förfaranden inte använder ett Bottenskikt (t ex, Gelbond film analyser). Det är ‘önskvärt’ att rapportera typ av bilder och storlek (dvs. gelens yta), eftersom andelen celler nära gelens kant ökar när gelstorleken minskar och DNA i nukleoider vid gelens kant kan migrera annorlunda än i nukleoider mot gelens mitt22. Den slutliga koncentrationen av agaros (med cellerna inbäddade däri) är ‘väsentlig’ att rapportera, eftersom migrationen av DNA beror på gelens densitet.

steg 3: lys av cellerna

det finns flera procedurer för Lysering av celler i kometanalysen. Information om sammansättningen av lyslösningen är ‘väsentlig’. Ett extra enzyminkubationssteg (t.ex. med proteinas K) kan krävas för vissa typer av celler, och detaljer om inkubationen bör också rapporteras som väsentlig information. Vissa rapporter tyder på att lysens varaktighet kan påverka stabiliteten hos vissa typer av DNA-lesioner28,29,30, så lysens varaktighet och temperaturen hos lyslösningen är ‘önskvärd’ information att rapportera.

steg 4A: Reparationsenzymbehandling i den enzymmodifierade kometanalysen

eftersom lyslösningen kan hämma aktiviteten hos reparationsenzymet är det ‘önskvärt’ att fastställa om ett tvättsteg utfördes mellan lyssteget och enzymbehandlingen (dvs. tvättbuffertens sammansättning, antal tvättar och varaktighet). Det är viktigt att vidarebefordra information om källan till reparationsenzymer, eftersom enzymer från olika tillverkare har visat sig skilja sig åt i både sin aktivitet och sin specificitet mot nukleobaslesioner16. I de flesta kometstudier utförs titreringskurvaexperiment för att identifiera optimala betingelser för enzymbehandling31; resultaten av enzymtitreringskurvor rapporteras dock sällan och klassificeras här som ‘önskvärd’ information (hänvisning till en tidigare studie kunde göras istället), även om vi betraktar det som ‘nödvändigt’ att rapportera behandlingens varaktighet och temperatur. Koncentrationen av enzym som appliceras på gelen är’ väsentlig ‘ information; det är att föredra att rapportera koncentrationen i enzymenheter (U/ml), även om proteinkoncentrationen (mg/ml) också är användbar. Typ av inkubationsenhet (t.ex. inkubator, glidgrav eller 12-gelsystem) och inkubationssätt är ‘önskvärd’ information att rapportera. Det bör anges om inkubationen utfördes (i) i ett enzymbad eller med en droppe och täckglas på bilden, (ii) i en standard 2-gelversion, 12-gel eller multipelbrunnssystem eller (iii) i en fuktad låda i en inkubator, på en värmeplatta eller i en uppvärmd glidgrav.

steg 4B: Extraktberedning och inkubation för DNA-reparationsanalysen in vitro

är det önskvärt att rapportera antalet celler eller vävnadsmassa som används för att bereda proteinextrakten, medan det är väsentligt att rapportera den slutliga proteinkoncentrationen av cell-eller vävnadsextrakt som tillsätts till substratets DNA. Extraktionsbuffertens sammansättning (‘önskvärd’ information) är mindre avgörande än inkubationsbuffertens sammansättning (‘väsentlig’ information), eftersom den senare kan påverka bakgrundsnivån för DNA-migration. I enlighet med informationen för den enzymmodifierade kometanalysen är det önskvärt att rapportera resultaten från titreringsexperiment eller referera till tidigare studier från samma laboratorium där dessa har utförts. Volymen av extrakt tillsatt till de gelinbäddade substratcellerna är ‘önskvärd’ information. Det är viktigt att rapportera inkubationsperiodens varaktighet och temperatur eftersom dessa påverkar antalet reparationsinsnitt. När det gäller den enzymmodifierade kometanalysen är inkubationssättet ‘önskvärd’ information att rapportera för in vitro-reparationsanalysen. Information om identiteten på det enzym som används som inkubationsreaktionskontroll (som anger mängden DNA-lesioner i substratcellerna) och sammansättningen av bufferten som används för bakgrundsnivån för DNA-reparationsinsnitt i oexponerade substratceller är ‘väsentliga’, eftersom de är viktiga för att visa tillförlitligheten hos DNA-reparationsinsnittsaktiviteten.

Steg 5: alkalisk behandling

den höga alkaliska pH-lösningen stör vätebindningen som håller DNA-strängarna ihop och omvandlar också vissa nukleobasskador till DNA-strängbrott. Således kan varaktigheten av alkalisk behandling påverka nivån av DNA-migration i efterföljande elektrofores32,33,34. Specifik information om den alkaliska lösningens sammansättning, pH, temperatur och behandlingens varaktighet är således väsentlig information att rapportera.

steg 6: elektrofores

de viktigaste drivkrafterna för DNA-migration är varaktigheten av elektrofores och den elektriska potentialen (spänningsfall över elektroforestankplattformen)35. Det är viktigt att sammansättningen av elektroforesbufferten, styrkan hos elektrofores (spänningsgradient (V/cm) över elektroforestankplattformen) och elektroforesens varaktighet rapporteras. Hög temperatur under elektrofores kan påverka DNA-migrationen36; således är information om temperaturen hos elektroforeslösningen ‘väsentlig’, och detta kan åtföljas av beskrivningar av åtgärder som vidtagits för att hålla temperaturen konstant (t.ex. kyla plattformen eller cirkulera bufferten).

Steg 7: Neutralisering

detta steg innebär att man tar bort överskott av alkalisk lösning från objektglasen för att säkerställa effektiv färgning. Det är önskvärt att beskriva sammansättningen av neutraliseringslösningen.

steg 8: färgning och visualisering

DNA-bindande färgämnen har olika bindningsaffiniteter till DNA och kan därför påverka beräkningen av de primära kometanalysbeskrivarna i bildanalysprogramvara differently36,37,38. Typen av färgämne är ‘väsentlig’ information, medan koncentrationen är’ önskvärd ‘ information, liksom tiden mellan färgning och visualisering. Ljusets intensitet från olika typer av mikroskoplampor skiljer sig åt. Dessutom varierar det beroende på lampans ålder och den tid den har slagits på under scoring av kometer. Det finns emellertid inget standardförfarande för att mäta ljusintensiteten och korrigera nivån av DNA-migration i enlighet därmed. Dessutom kan samma komet tyckas ha olika nivåer av DNA-migration vid olika mikroskopförstoringar. Således är det ‘önskvärt’ att rapportera mikroskopförstoringen som används för poängsättningen. Det är ‘önskvärt’ att visa representativa bilder av kometer (t. ex., kontroll med liten eller ingen migration, måttlig och omfattande DNA-migration) tillsammans med de rapporterade nivåerna av DNA-migration.

steg 9A: Scoring och dataanalys

detta steg kräver rapportering av ‘väsentlig’ information för den primära kometanalysbeskrivaren (t. ex.. %DNA i svans, svanslängd, svansmoment eller visuell poäng), antalet kometer som analyseras per prov och hur den totala nivån av DNA-migration uttrycks (t.ex. median eller medelvärde för kometpoäng). Det är ‘inte viktigt’ att rapportera det individuella resultatet av varje komet i varje gel; de kombineras för att beräkna den totala skadenivån. Eftersom det inte kan uteslutas att olika programvarupaket för bildanalys kan ha olika sätt att beräkna den primära prediktorn för kometanalys, är det viktigt att rapportera vilken programvara som används (programvarunamn, tillverkare, version). Alla primära deskriptorer delar begränsningen att det är nödvändigt att ha expertis i kometanalysen för att förstå vad de menar, medan om en kalibreringskurva skapas (med joniserande strålning, som inducerar raster vid en känd frekvens) kan resultaten omvandlas till relativ lesionsfrekvens jämfört med oförändrade nukleotider eller nukleobaspar; sådana data är entydiga och förmedlar information som alla forskare kan förstå39. Förfarandet för att erhålla en kalibreringskurva med joniserande strålning och omvandla DNA-migrationsnivåer till lesionsfrekvensen i förhållande till oförändrade nukleotider eller nukleobaspar har rapporterats tidigare40. Således är det önskvärt att rapportera resultaten som nivåer av lesioner per 109 oförändrade nukleotider eller 106 nukleobaspar.

steg 9B: Beräkning av enzymkänsliga ställen eller nettoantal snitt i substrat-DNA för DNA-reparationsanalysen in vitro

inkubationen med DNA-reparationsenzymer ökar nivån av DNA-migration, eftersom både basalnivån för DNA-strängbrott och enzymspecifika lesioner bidrar till det totala antalet DNA-strängbrott. Eftersom den DNA-migration som tillskrivs den basala nivån av DNA-skador och enzymspecifika lesioner kan härröra från olika mekanismer för Genotoxicitet är det inte tillräckligt att rapportera endast den totala nivån av DNA-skador efter enzymbehandling. I stället är det viktigt att rapportera genotoxiciteten som enzymkänsliga ställen, där den basala nivån av DNA-migration har subtraherats från DNA-migrationen i de enzymbehandlade objektglasen.

eftersom DNA-reparationsanalysen in vitro använder samma substratceller med alla cell-eller vävnadsextraktprover, är det onödigt att ha samtidig Bakgrunds-och behandlingskontroller för varje prov i samma experiment (dvs. analyskörning). Det kan finnas mer än ett substrat (t. ex., vid analys av både bas-och nukleotid-excisionsreparationsaktivitet), och därför behövs separata kontroller för varje typ av DNA-reparationsanalys. Det är viktigt att rapportera nettoinskärningarna genom reparationsextraktet i substratets DNA.

steg 9C: statistisk analys av resultaten

statistiska analyser är ‘väsentliga’. Typen av statistisk analys beror på studiens utformning och följer de allmänna antagandena i statistisk testning inom genetisk toxikologi och biomonitoring41,42.