omvandling av det motstridiga bekämpningsmedlet klordekon av Desulfovibrio sp.86 med en övergång från ringöppnande deklorering till reduktiv sulfideringsaktivitet

isolering av Desulfovibrio sp.86

isolering av desulfovibrio sp.86 uppnåddes från klordekonnedbrytande konsortium 865 med användning av sulfatreducerande förhållanden. Eftersom bakteriekonsortium 86, som kunde omvandla klordekon, erhölls från ett berikat mineralmedium (MM) med namnet MM + 5, kompletterat med klordekon, hölls den huvudsakliga kemiska sammansättningen men elektrondonatorer och acceptorer modifierades. Flera medieformuleringar som används för att berika sulfatreducerande bakterier använder organiska syror, t.ex. laktat,som kol-och energikällor (elektrondonator) och sulfat som används som eletron-acceptor för tillväxt15,16,17, 18. I detta sammanhang ersattes pyruvat i MM + flytande medium med laktat och sulfat tillsattes (MMD flytande medium, se avsnittet “metoder”). Anrikningen spreds på MMD-agar och de bruna Vibrio-liknande bakteriekolonierna (observerade under optiskt mikroskop) renades ytterligare genom ytterligare två plattstreck (Fig. S1). En isolerad bakteriestam visade sig vara identisk med Desulfovibrio sp.86 Från konsortium 86 baserat på 100% identiteter av deras 16s rRNA-gener (1538 bp vardera).

genomanalys av Desulfovibrio sp.86

hela genomet består av en enda 3 464 070 BP cirkulär kromosom. CheckM-analys19 utförd med 61 genom och 284 linjer indikerar att genomet tillhör Deltaproteobakterierna och CheckM-fullständigheten är 100% (noll viktig markör saknas). Det genomsnittliga G + C-innehållet för DNA är 58,06%. Totalt 3 342 kodande DNA-sekvenser (CDSs) förutspåddes för kromosomen, 4 pseudogener och 10 Diverse rna (misc-RNA), 3 rRNA-operoner och 54 tRNA-gener.

de tre 16S rRNA-generna av Desulfovibrio sp.86 är identiska. Deras bästa BLAST hits (NCBI) var från odlad Desulfovibrio sp. kloner från mikrobiella bränsleceller såsom MFC63A04 (genbank anslutningsnummer: FJ823865; täckning 98%; identitet 99,87%) 20. Ett fylogenetiskt träd med hjälp av tillgängliga 16S rRNA av odlingsbara bakterier bekräftade likheterna mellan Desulfovibrio sp.86 och Desulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16s rRNA anslutningsnummer: NR_117110; täckning 99%; identitet 99, 22%; genomisk sekvens otillgänglig) (Fig. S2) 21. På genomisk nivå, desulfovibrio sp.86 rankas först med desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27,774 genom (GenBank: NC_011883). Ändå, Desulfovibrio sp.86 delar endast 1 408 gener (43%) Med D. desulfuricans (över 80% aminosyror identitet och 80% anpassning täckning). Dessutom är den genomsnittliga nukleotid identiteter (ANI) mellan Desulfovibrio sp.86 och sekvenserade Desulfovibrio-genom är lägre än det 95% ANI-gränsvärde som allmänt accepteras för artavgränsning (Fig. S3) 22. Dessa resultat indikerar att desulfovibrio sp.86 är troligen en ny art av desulfovibrio phylum. Närvaron av två superoxiddismutaser och en katalasgen står för dess relativa syretolerans. Som förväntat, desulfovibrio sp.86 genomet uppvisar ett omfattande genkomplement för svavelmetabolism, som omfattar svavelandningsvägarna med oorganiska källor som sulfat, sulfit, bisulfit och tetrationat som elektronacceptorer. Organiska svavelkällor kan tillhandahållas genom fermenteringsprodukter av svavelbiomassa (sulfokinovos av sulfokinovosyl lipider) sulfoacetat, svavel icke-proteogen aminosyra taurin via sulfoacetaldehyd, eller alkansulfonat23.

Desulfovibrio sp.86 bryter ned klordekon till kända transformationsprodukter samt en oväntad svavelinnehållande förening

klordekonnedbrytande förmåga hos den isolerade Desulfovibrio sp.86 stam undersöktes med användning av GC–MS (gaskromatografi masspektrometri) och LC-HRMS (vätskekromatografi högupplöst masspektrometri) tekniker i tillväxtbetingelser framgångsrikt tillämpas för Desulfovibrio sp.86 isolering (MMD flytande medium). Na2S användes som reduktant och en anaerob N2/H2 (98/2; V/V) atmosfär applicerades med användning av ett handskfacksystem. Dessa inkubationsförhållanden ledde till fullständigt försvinnande av klordekonsignalen i GC-MS och LC-HRMS, och resulterade i liknande GC–MS-och LC-HRMS TP-profiler som de erhållna med Citrobacter sp.866: monohydroklordekon A1, pentaklorinden B1, tetraklorindener B3-B4 och polyklorindenkarboxylsyror C1-C2 och C3-C4 (Fig. 1a, b). I handskfackssystemet utfördes bakteriekulturer med användning av 100 mL glasflaskor med en hydrofob porös film för att möjliggöra gasutbyte och undvika kontaminering. Detta inkubationstillstånd betraktades som” förnyad atmosfär ” – tillstånd (RA). I detta system förnyades atmosfären regelbundet med N2/H2 (98/2; V / V) och lådan kontrollerades inte termostatstyrd så temperaturen varierade mellan 25 och 33 kcal C. För att bättre kontrollera tillväxt och nedbrytningsförhållanden, desulfovibrio sp.86 kulturer placerades i MMD-medium med användning av 100 mL glasflaskor, förseglade med butylgummisepta, i en ugn vid 30 C. förseglade flaskor rensades initialt med N2/H2 (98/2; V/V) gas för att försäkra anaerobios. Detta inkubationstillstånd betraktades som” begränsad atmosfär ” – förhållanden (CA).

GC-MS och LC-HRMS övervakning, i fullskanningsläge (godtycklig enhet), av klordekontransformation av Desulfovibrio sp.86 under RA-förhållanden (i handskfack, anaerobios (N2/H2, 98/2, V/V), rumstemperatur, öppna injektionsflaskor med en porös film, i MMD-medium kompletterat med 40 mg/L klordekon) och CA-förhållanden (i ugn, anaerobios (initialt rensad med N2/H2, 98/2, V/V), 30 msk C, förseglade injektionsflaskor, i MMD-medium kompletterat med 40 mg/L klordekon); och identifiering av TP F1. a) GC-MS-övervakning av klordekontransformation genom Desulfovibrio sp.86 i RA-förhållanden. B) LC-HRMS-övervakning av klordekontransformation genom Desulfovibrio sp.86 i RA-förhållanden. C) GC-MS-övervakning av klordekontransformation genom Desulfovibrio sp.86 i CA-förhållanden. D) LC-HRMS-övervakning av klordekontransformation genom Desulfovibrio sp.86 i CA-förhållanden. In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.

efter sex veckors inkubation med klordekon kunde bekämpningsmedlet inte längre detekteras med samma analytiska tekniker. Samtidigt uppträdde en enda okänd klorerad förening med namnet F1. Det var detekterbart endast genom GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Liksom i de tidigare rapporterade klordekonnedbrytningskulturerna5, 6 uppträdde den huvudsakliga klordekontransformationen under den stationära fasen (Fig. 1e). Eftersom ingen synlig klorerad topp kunde observeras i LC-HRMS (Fig. 1d) baserade vi den strukturella belysningen av F1 på tolkningen av GC–MS-data (Fig. 1f). Förutsatt att det högre isotopmönstret centrerat vid m/z 507.8 innehöll molekyljonen, antog vi två möjliga neutrala formler för F1, C10Cl10O2H2 och C10Cl10SH2. Fragment i källan liknade i hög grad de som observerades i polyklorerade bishomokubanbaserade strukturer inklusive klordekon, hydroklordekoner, klordekol och mirex5,6,24. Faktum är att isotopmönstren vid m / z 201.0, 235.9 och 271.9 förmodligen uppstod från den kända källan bishomocubane retrocyklodimerisering och motsvarade positivt laddade C5-fragment. Jämförelse med isotopsimuleringar begränsade möjligheten till följande radikala joner: +· +· och +·, med n = 0,1. Den senare bis-oxygenerade generiska formeln visade sig vara mycket osannolik eftersom den krävde närvaron av en gem-diol-funktion eller en gem-klorhydrindel på cyklopentenylringen som var tvungen att motstå de hårda GC-kromatografiska förhållandena (> 200 CCC). Istället drog vi slutsatsen att en svaveldel, dvs. en tiolfunktion var förmodligen närvarande på bishomocubane polycycle. Vi föreslog för F1 strukturen avbildad i Fig. 2a och föreslog namnet klordektiol, svavelanalogen av klordekol (klordekonalkohol).

syntes av den kemiska standarden klordektiol och dess fullständiga karakterisering. (a) kemisk reaktionsschema för klordektiolsyntes och NMR-skift i CD2Cl2: 1H NMR-skift, i kursiv och understruken och 13C NMR-skift, i fetstil; liknande färgade cirklar indikerar ekvivalenta kolatomer. (b) M/z-simulering av C10Cl10O2H -, (c) m / z-simulering av C10Cl10SH -, (d) extraherat högupplöst masspektrum av syntetisk klordektiol i negativt läge (LC-HRMS).

syntes av klordektiolstandarden och bekräftelse på att transformationsprodukten F1 är identisk med klordektiol

för att bekräfta strukturen för F1 syntetiserades standardklordektiol kemiskt och karakteriserades fullständigt. För att uppnå kemisk reduktiv sulfidering av klordekon behövdes två steg. Den första bestod i omvandlingen av gem-diolfunktionen hos klordekon i jämvikt med motsvarande ketonform20,25 till svavelanalogen, dvs gem-tiol/tiokarbonyldel. För att utföra detta steg appliceras fosforinnehållande svavelreagens i allmänhet26, 27. Här använde vi fosfordekasulfid (P4S10) även kallad Berzelius-reagens27,28 enligt protokollet från Zaidi och medarbetare som framgångsrikt syntetiserade camphortiol29 (Fig. 2a). Det andra steget bestod i minskningen av gem-tiol-mellanprodukten med användning av NaBH4. Efter rening erhölls ett vitt fast ämne i ett totalt utbyte av 73% (Fig. 2a). 1D – och 2D-NMR-analyser bekräftade chlordecthiol-strukturen: (i) två 1H-signaler som integrerar var och en för en proton och kopplas ihop (3,78 ppm, d, j = 5,5 Hz och 2,01 ppm, d, j = 5,5 Hz), med den vid 3,78 ppm för 23c korrelerad till en 13C-signal skiftad nedfält (55,1 ppm) i hsqc-experiment som perfekt redogör för ch-delen bredvid tiolfunktionen och (ii) en totalt sex synliga 13C-signaler som återspeglar symmetriplanet bevarat i föreliggande bishomocubanstruktur (Fig. 2a, fikon. S19-23). Även om i mikrobiell transformation kunde F1 inte detekteras med användning av LC-HRMS-verktyg under de utvecklade förhållandena, gav ett koncentrerat prov av den syntetiska standarden klordektiol en signifikant signal. Närvaron av en svavelatom och den förväntade neutrala formeln C10Cl10SH2 bekräftades (Fig. 2c, d) och de råa formlerna C10Cl10O2H2 uteslöts (Fig. 2b). Slutligen visade GC-MS-analys den perfekta matchningen (dvs samma retentionstid på 25,6 min och samma masspektra i källan Fig. S6) mellan den syntetiska standarden och TP F1, vilket definitivt tilldelar den som klordektiol. Faktum är att F1 representerar den första medlemmen i en ny familj av klordekon TPs som för första gången har en svavelatom.

förmågan hos Desulfovibrio sp.86 att bryta ned klordekontransformationsprodukter

föreningarna A1, B1, C1-C2 och F1 som är representativa för de fyra familjerna av TPs som eventuellt bildas i närvaro av Desulfovibrio sp.86 syntetiserades enligt kemiska protokoll som tidigare rapporterats6 och här utvecklades för F1. Var och en av dem inkuberades i närvaro av desulfovibrio sp.86 kulturer under förhållanden som visade sig främja reduktiv sulfidering (förseglad injektionsflaska; CA-förhållanden) eller deklorering med ringöppning (öppen injektionsflaska; RA-förhållanden). Dubbel GC-MS och LC-HRMS övervakning av alla prover utfördes.

efter en månads inkubation under ca-betingelser omvandlades 10-monohydroklordekon A1 fullständigt till två okända klorerade föreningar som knappt separerades med GC–MS (retentionstider: 24,3 min F2 och 24,5 min F3, Fig. 3, fikon. S7-S11). De visade ett identiskt masspektrum i källan som mycket liknade F1-fragmenteringsmönstret (Fig. S8). Alla upptäckta fragment i källan visade sig ha en kloratom mindre än deras analoger i F1-masspektrum. Föreningarna F2 och F3 antogs således vara diastereoisomerer av 10-monohydroklordektiol (Fig. 3c). Detta bekräftades av den kemiska syntesen av de två 10-monohydrochlordecthiol-standarderna från 10-monohydrochlordecone A1 med användning av det förfarande som tidigare tillämpats för syntesen av klordecthiol F1 (Fig. S24-27). Dessa kemiska standarder hade samma retentionstider (24,3 och 24,5 min) och samma masspektra jämfört med biologiska F2 och F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 och F1 förblev oförändrade även efter sex månaders inkubation med Desulfovibrio sp.86 under CA-förhållanden.

öden för klordekontransformationsprodukter med Desulfovibrio sp.86 beroende på inkubationsförhållanden. A) omvandling av klordekon under RA-förhållanden och b) under CA-förhållanden. Omvandling av c) A1, d) F1, e) B1 och f) C1–C2.

efter sex månaders inkubation under RA-förhållanden omvandlades klordektiol F1 delvis till 10–monohydroklordektioler F2 och F3, och två andra okända klorerade arter detekterades med GC-MS, med namnet F4 (retentionstid: 17,9 min) och F5 (retentionstid: 26,6 min) (Fig. 3D, Fig. S12). Ingen av dessa två föreningar gav någon detekterbar signal i LC-HRMS. GC-MS-analys aktiverad för att föreslå C10Cl6SH4 som rå formel för F4 (Fig. S14) och C11Cl10SH4 för F5 (Fig. S15). Metylklordeksulfid syntetiserades kemiskt och karakteriserades fullständigt av NMR (Fig. S28-31). Den perfekta korrespondensen mellan GC-retentionstider och GC-masspektra av metylklordeksulfid och biologisk F5 (Fig. S13) bekräftar sin postulerade identitet. Anmärkningsvärt, strukturen av F5 (Fig. 3D) representerar en S-metylerad form av F1. Den exakta karaktären av F4 återstår att rensa (se si-kompletterande Text). Alla andra TPs förblev oförändrade under RA-förhållanden.

Sammanfattningsvis genomgick A1 (bildad under RA-förhållanden) en reduktiv sulfidering precis som klordekon; under båda inkubationsförhållandena verkade polyklorindener (B1 och C1-C2) inte vara nedbrytbara av Desulfovibrio sp.86, medan F1 (producerad under CA-förhållanden) kunde transformeras under RA-förhållanden (Fig. 3).

undersökning av inkubationsförhållanden som leder till bakteriell reduktiv sulfidering

för att ifrågasätta de fysikalisk-kemiska eller fysiologiska parametrarna som påverkar omvandlingsvägarna för klordekon i kulturerna av Desulfovibrio sp.86, GC-MS-övervakning (B1 och F1 närvaro som bevis på RA respektive CA-förhållanden) valdes.

två svavelhaltiga oorganiska föreningar, reduktanten Na2S och elektronacceptorn Na2SO4, var närvarande i det ursprungliga MMD-flytande mediet. En första serie experiment i förseglade flaskor med substitution av Na2S med andra reduktionsmedel, sulfured eller inte, dvs cystein och Titan(III) citrat (TiCi) ledde till en jämförbar nivå av klordektiol F1 (Tabell 1). Spår av TP B1 observerades också i alla experiment, inklusive Na2S, den positiva kontrollen (Tabell 1).

en andra uppsättning experiment utformades med användning av Na2S som reduktionsmedel och alternativa svavelbaserade elektronacceptorer i förseglade flaskor (Tabell 2). Användning av 90% 34s-berikat oorganiskt sulfat resulterade i en klordektiolprodukt som visade liknande 34s-anrikningsnivå (90% 34s-F1/10% F1, Fig. S16). GC-MS-analys av kulturhuvudutrymme avslöjade också närvaron av H234S och H3C34SH (Fig. S16), vilket visar att Desulfovbibrio sp.86 producerade H2S från sulfat. Dessa gaser detekterades i odlingshuvudet under CA-förhållanden, med användning av MMD-medium, medan de var frånvarande från odlingshuvudet i RA-tillstånd som motsvarade handskfackets atmosfär (Fig. S17). Frånvaro av sulfat inhiberade inte Desulfovibrio sp.86 tillväxt, men det resulterade i bildandet av B1 (Tabell 2) 5. Remplaceringen av sulfat med sulfit, bisulfit eller tiosulfat ledde i alla fall till bildandet av klordektiol F1.

en tredje serie experiment med burkar undersökte effekten av gasfasens natur i kontakt med kulturen. Mellan RA-tillståndet med öppna flaskor i handskfacket och CA-tillståndet med förseglade flaskor i ugnen skilde sig flera parametrar (atmosfärens natur och volym, temperatur). Med hjälp av ett burksystem inklusive flera flaskor studerar vi selektivt effekten av atmosfärsförnyelse på klordekontransformation av Desulfovibrio sp.86 i MMD medium. I varje fall placerades öppna flaskor med hydrofoba porösa filmer i burkar som ursprungligen rensades med en vald gas. Alla burkar inkuberades vid 30 C. några av dem spolades flera gånger för att efterlikna handskfackssystemet, medan andra hölls stängda.

burkar 1-4 innehöll två identiska öppna injektionsflaskor fyllda med MMD, klordekon och desulfovibrio sp.86 inokulum, och en negativ abiotisk kontroll. Bland dem spolades två burkar två gånger i veckan, burk 1 med (N2/H2 (98/2; V/V)), burk 2 med N2 (Fig. 4A), medan burkar 3 och 4, initialt rensas med N2 och (N2 / H2 (98/2; V / V)) respektive lämnades unflushed (Fig. 4b).

Schematisk representation av gasstyrda experiment. a) tvättade burkar, b) ofyllda burkar, c) ofyllda burkar med sulfatfri desulfovibrio sp.86 kulturer.

de två sista burkarna (burk 5 och 6) innehöll tre öppna flaskor fyllda med MMD, klordekon och desulfovibrio sp.86, plus en kultur utan sulfat. Dessa burkar spolades ursprungligen med (N2/H2 (98/2; V / V)) och lämnades unflushed i 2 månader (Fig. 4c).

parallellt med burkarna, två förseglade flaskor fyllda med MMD utan sulfat, klordekon och desulfovibrio sp.86 spolades med extemporärt syntetiserade H2S (Fig. S4).

efter två månaders inkubation vid 30 CCG detekterades TP B1 i injektionsflaskor placerade i de spolade burkarna 1 och 2 (Tabell 3a), medan TP F1 endast hittades i injektionsflaskor placerade i oflusade burkar 3 och 4 (tabell 3b). Ingen TP fanns i de abiotiska kontrollerna. I burkarna 5 och 6 var F1 närvarande i både sulfat och sulfatfri desulfovibrio sp.86 öppna kulturer (tabell 3c). På samma sätt, desulfovibrio sp.86 sulfatfria kulturer, spolade med H2S visade signifikanta nivåer av F1 TP, medan ingen transformation observerades i den negativa kontrollen (tabell 3D).

ett ytterligare kemiskt experiment utfördes för att bedöma påverkan av H2S på klordekontransformation. Klassiskt kemiskt protokoll som möjliggör B-och C-TPS-bildning, applicerades (klordekon, titancitrat, vitamin B12, vatten). Under N2-atmosfären erhölls B och C TPs, men under H2S-atmosfären producerades endast A1 (Fig. S18).

dessa resultat visar tydligt att bildandet av klordektiol F1 kräver ett slutet inkubationssystem med en reducerande atmosfär. Men H2 som den ursprungliga gasatmosfären är inte obligatorisk medan närvaron av H2S krävs. Kemiskt förhindrar närvaron av H2S från ringöppnande dekloreringsprocess.

miljörelevans av klordekonreduktiv sulfidering

vi undersökte vår tidigare samling av Martinique Island klordekon-förorenade miljöprover (åtta jordar och tvåbädds sediment) där olika nivåer av klordekon TPs hade rapporterats6. Bland de nya svavelinnehållande TP: erna som rapporterats här fann vi märkbara nivåer av F1 i de två bäddsedimentproverna (927 och 928) vid en koncentration uppskattad runt 50 kg/kg respektive 20 kg/kg vått sediment (tabell S1). Parallellt, bakteriepopulationsdiversitetsdata utfärdade från metabarkodningsanalys av dessa prover (Fig. 5, Fig. S5) bearbetades för att återvinna en hierarkisk gruppering av miljöprover enligt deras taxonomiska sammansättning6. Det märktes att sulfatreducerande bakterier var mycket mer närvarande i sängsediment än i de andra facken, som tidigare rapporterat30,31,32.

Dendrogram genererat från hierarkisk kluster av miljöprover enligt bakteriepopulationens mångfald (från R-paketet pvclust v.1.3-2, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117). 200 000 sekvenser togs för varje miljöprov och normaliserades. Andelen detekterade phyla representerades här med fokus på sulfatreducerande bakterier från Deltaproteobacteria-klassen, Firmicutes och Nitrospirae phyla. I rött representeras det objektiva (au) p-värdet och i grönt bootstrap-sannolikhetsvärdet (bp). SRB = Sulfatreducerande bakterier.