Infektiös nekrotisk hepatit orsakad av Clostridiumnovyi Typ B i en häst: fallrapport och granskning avlitteratur | Jiotower

infektiös nekrotisk hepatit (INH) orsakas av Clostridium novyitype B. sjukdomen drabbar vanligtvis får, där den också kallas”svart sjukdom” med tanke på den mörka missfärgningen av den subkutana vävnaden orsakad avintensiv venös trängsel som ses i slaktkropparna hos djur som dör av denna sjukdom.6 även om INH också tros förekomma hos andra arter,inklusive nötkreatur, getter och hästar, finns mycket begränsad information tillgänglig om denna sjukdom i andra djur än får.2,3,19,15 dessutom,på grund av dess strikta anaerob natur, isolering och identifiering av C. novyi Typ B uppnås sällan.15 av denna anledning är rapporter om INH vanligtvis begränsade till presumptivediagnos baserad på histopatologi, fluorescerande antikroppstest (fett) och/orimmunohistokemi (IHC). Typen av C. novyi är sällanbestämd. Här presenterar vi ett bekräftat fall av häst INH orsakad av C.novyi typ B, och även granska litteraturen om sjukdomen.

en 14-y-gammal, 511-kg bay Quarter häst valack lämnades till San Bernardinobranch av California Animal Health and Food Safety Laboratory System forpostmortem undersökning och diagnostisk workup. Djuret hade en 3-D-historia avprogressiva neurologiska tecken, rektaltemperatur på 38,8-40,5 kcal C och hade behandlats utan framgång med icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel före döden.En fullständig obduktion utfördes ~6 h efter döden.

vid obduktion var hästen i gott näringsförhållande, med tillräcklig mängd fettreserver och i måttligt tillstånd av postmortem sönderdelning. Det var gult missfärgning av sclera, subkutan och fettvävnad och artikulärbrosk. Multifokala ekchymotiska-till-suffusiva blödningar var närvarande i de flestamuskler, serosa i tarmkanalen, mesenteri, mjälte, pleura och inpapillära muskler i hjärtat. Venöst blod var djupt rött-svart. Perikardialsac distenderades med en stor mängd serosanguineös vätska, och det fanns ~5L av en liknande vätska innehållande rikliga fibrinsträngar i bukhålan.Levern var markant förstorad och hade rundade kanter; den vänstra loben var fast,mörkröd till svart och hade många subkapsulära och djupa parenkymala gasbubblor och rikligt fibrin över kapseln (Fig. 1A). På den skurna delen av denna lob fanns en ~15 cm diameter, blekt område omgivet av en tunn hemorragisk kant (Fig. 1B). Meningesoverlya hjärnan och ryggmärgen var diffust överbelastade, och det fanns petechiala blödningar i hela hjärnbarken. Inga andra signifikanta bruttoresioner observerades i resten av slaktkroppen.

prover av hjärnan, lunga, hjärta, membran, lever, mjälte, mage,tarm, bukspottkörtel, binjure, tarmkäxet, njure, och urinblåsan samlades andfixed i 10% buffrad formalin (pH 7,2) för 48 h och behandlas rutinmässigt för theproduction av 4 MICR-tjock hematoxylin och eosin (H&E)-färgade sektioner. Leveroch njursektioner färgades också med Gram-respektive Okajima-fläckar.

leverprover samlades aseptiskt och utsattes för aerob och anaerobicculture på 5% får agarplattor för 48 h. PCR utfördes för West Nile virus (WNV)på centrala nervsystemet poolade prover och för equid herpesvirus 1 (EHV-1) på en nasal swab. En tungmetallskärm inklusive bly, mangan, järn,kvicksilver, arsenik, molybden, zink, koppar och kadmium utfördes på leverprover.Cerebrospinalvätska testades för antikroppar mot Sarcocystisneurona med användning av ett indirekt fett. Leverutstryk bearbetades av Fettför Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli och C. novyi med hjälp av kommersiella konjugat (VMRD, Pullman, WA). Dessutom bearbetades formalinfixerade,paraffininbäddade delar av levern av en indirekt immunoperoxidasetechnique för C. novyi, med användning av ett kommersiellt kit (RTU VECTASTAINElite ABC-system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroxidasaktivitet släcktes med en 3% väteperoxidlösning, följt av pepsintreatment för antigenåtervinning. Proverna inkuberades sedan med BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) för att blockera icke–specifik bindning, föreinkubation med get anti-C. novyi polyklonal antikropp (VMRD) vid37 2CB C för 60 min. Vektor NovaRED kromogen användes för visualisering (Vektorlaboratorier). Sektioner av lever inkuberade med normalt getserum istället förprimära antikroppar användes som negativ kontroll. Lever från en ko därc. novyi hade identifierats av kultur och PCR användessom en positiv kontroll.

leverprover behandlades för DNA-extraktion (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Det extraherade DNA användes som mall för en multiplex PCR-analys för att förstärka segment av flagellingenerna (fliC) av C. septicum, C. novyi typ A, C. novyi Typ B, C. chauvoei och Clostridium haemolyticum, sombeskrivs tidigare.17 dessutom utvecklade vi en konventionell PCR för att förstärka ett segment av theC. novyi typ B alfa-toxin (tcna) gen (GenBank anslutning JENV01000127. 1), den viktigaste virulensfaktorn för dettamikroorganism. Följande oligonukleotidsekvenser utformades: 5 ‘- TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′(CNtBaF) och 5’-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3 ‘ (CNtBaR),som förstärker ett ~342-bp DNA-fragment av målgenen. Konventionell PCR varutförd i en total volym av 25 kg innehållande 5 kg extraherat DNA, 0.25 oktvarje primer(10 okt), 7 okt nukleasfritt vatten och 12,5 okt PCR Master Mix (2x, Promega, Madison, WI), innehållande Taq DNA-polymeras(pH 8,5, 50 U/mL), dNTPs (400 okt) och MgCl2 (3 mM). Termocykelprofilerna var följande: 94 CCB i 5 min, 30 cykler av 94 CCB i 1 min, 55 CCB i 1 min och 72 CCB i 1,5 min, följt av ett sista förlängningssteg vid 72 CCB i 7 min. Proverna hölls vid 4 msk Cuntil PCR-reaktionerna visualiserades under ultraviolett ljus i etidiumbromid (Amresco, Solon, OH)-färgade 1% agarosgeler (agarose SFR, Amresco). DNAextracted från C. novyi typ B (ATCC 25758), C. novyi Typ A, C. septicum, C. chauvoei och C. haemolyticum kulturer användes som positiva kontroller. Vatten istället för DNA användes i negativ kontrollreaktioner.

mikroskopiskt täcktes leverkapseln av rikligt fibrin blandat med celldebris, och det fanns subkapsulär och djup parenkymal emfysematös bullae avolika storlekar. Det mest slående fyndet var multifokal till fokalt omfattandekoagulativ nekros, omgiven av en kant av ett stort antal livskraftiga ochdegenerera neutrofiler, blödning, fibrin, cellskräp och stora aggregat avgram-positiva bakteriestavar, av vilka några hade subterminala sporer (Fig. 1C,, D).G). Vid ingripandeparenchyma och i den mindre drabbade levern var det gallstasis, multifokalhemorrhages och segment-till-diffus fibrinoid nekros av blodkärl, många avsom också innehöll fibrintrombi. Det renala tubulära epitelet hade mildcytoplasmatisk vakuolering, och protein och granulära gjutningar var närvarande i lumenav njurtubuli. Gjutningarna färgades positivt med Okajima-fläck (Fig. 1E). I hjärnan var det diffus trängsel, multifokal och slumpmässigt spridd perivaskulärblödningar och måttlig till markerad expansion av Virchow-Robin-rymden medacidofil ödem. Det viscerala bukhinnan täcktes av rikligt fibrin blandat med ett stort antal livskraftiga och degenererade neutrofiler; de flesta peritoneala blodkärl var överbelastade och/eller innehöll fibrintrombi. Några små artärer ochvener i binjurens cortex och medulla hade också fibrintrombi. Denmjälte hade vaskulär trängsel och multifokal parenkymal och kapslarblödningar. Lungorna var diffust överbelastade och hade multifokala blödningar ochödem, förutom några få blodkärl som innehöll fibrintrombi. Multiplesubendokardiella, subepikardiella och subpleurala blödningar sågs.

den stora majoriteten av intralesionala grampositiva stavar observerade i levern varpositiv för C. novyi IHC (Fig. 1F). Fett var positivt för C.novyi, men negativt för de andra testade klostridiala arterna. Leverprover var positiva för C. novyi typ B fliCand tcna-gener och negativa för fliC-generna av de andra testade clostridierna (Fig. 2). Prover av cerebrospinalvätska var negativa för S. neurona immunofluorescerande antikroppsanalys. PCR för WNV och EHV-1 varnegativ. Ingen signifikant bakterietillväxt uppnåddes genom aerob eller anaerobkultur. Tungmetallskärmen avslöjade en förhöjd koncentration av järn ileverprover (1500 ppm; referensintervall: 100-300 ppm).

Vi gjorde en presumtiv diagnos av INH baserat på grova och mikroskopiska förändringar,i kombination med resultat av fett och IHC för C. novyi. Diagnosen av INH producerad av C. novyi Typ B bekräftades genom PCR-detektionav fliC-och TcnA-generna av dettamikroorganism. Så vitt vi vet har endast 6 fall av misstänkt IHN rapporteratstidigare hos hästar. Tre fall inträffade i Australien,8,9,11 och en vardera i Nya Zeeland, 23 Skottland, 19 och USA (Montana).16 i dessa fall baserades en presumptiv diagnos på brutto-och mikroskopisklesioner i kombination med detektion av C. novyi med fett,9,16,19 IHC,23 och/eller kultur.9,19 typen av C. novyiinvolved fastställdes emellertid inte i något av dessa fall.

C. novyi är en gram-positiv, sporbildande, anaerob bacillus, som vanligtvis finns i jord och avföring hos djur.15 Det klassificeras i typ A, B och C baserat på det antal toxiner som produceras.4C. novyi Typ A producerar huvudsakligen det dödliga, ödeminducerande alfatoxinet (TcnA) och det icke-dödliga fosfolipas, gamma-toxinet; denna bakterie ärassocierad med gasgangren hos människor och djur, som vanligtvis verkar tillsammans medandra clostridier. C. novyi Typ B producerar också TcnA, dessutomtill det nekrotiserande och hemolytiska beta-toxinet, även om det förstnämnda anses vara denviktigaste virulensfaktorn för patogenesen av INH. C. novyi typ C anses vara icke-toxigenisk ochicke-patogen.13,15 C. haemolyticum var tidigare känd som C. novyitype D, och det kallas fortfarande av detta namn av vissa författare; därför vidiskutera också denna mikroorganism här. C. haemolyticum ocksåproducerar betatoxin,men i mycket större kvantiteter än C. novyitype B; detta toxin anses vara den huvudsakliga virulensfaktorn för denna mikroorganism, och den är ansvarig för bacillär hemoglobinuri (BH), en sjukdom som påverkarfrämst nötkreatur som är kliniskt och patologiskt mycket lik INH.11,10,14

sporerna av C. novyi är mycket motståndskraftiga mot miljöförhållanden och, med tanke på att sporerna ofta finns i jord, betande djurkan inta dem ofta.6,19 även om det inte är helt bevisat, är den nuvarande dogmen att efter intag absorberas sporerna av C. novyi Typ B fråntarmen och når levern via portalcirkulationen, varefter de ärspridas till andra organ. Sporerna fagocytiseras och förblir latenta i Kupfferceller i levern och i makrofager i mjälten och benmärgen.2,6 INH harvanligen ansetts vara motsvarigheten till BH eftersom båda sjukdomarna tros inträffa efter leverskada, vilket orsakar nekros och de associerade anaerobiska tillstånd som krävs för spiring av latenta sporer och produktion av toxiner.14 Migration av omogna former av Fasciola hepatica genomlevern anses vara den viktigaste predisponeringsfaktorn för både BH och INHin idisslare, och båda sjukdomarna är vanligare i områden med hög förekomst av fascioliasis.1 tum idisslare har också associerats med Cysticercustenuicollis och andra parasiter, inklusive Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum ochthysanosoma actinoides, 2,6,15,21 Även om dessa parasiters roll i patogenesen av sjukdomen inte har visats.Emellertid kan varje leverskada som leder till generering av anaeroba tillstånd vara enpredisponeringsfaktor för INH. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, leverabscesses, biopsier, fettförändring, telangiectasia och giftiga ämnen. När TcnA ärproduceras och frigörs av de vegetativa formerna av C. novyi Typ B, dess monoglykosyltransferas aktivitet inaktiverar flera guanosin5 ‘ – trifosfat (GTP)-bindande proteiner i celler i värden, vilket resulterar iförändring och omfördelning av aktincytoskelettet.3 tcna stör också vimentin-och tubulinsystemet.7,18 dessa förändringar verkar vara mer dramatiska i kapillärendotel, vilket leder tillutbredd vätskeextravasation sett i INH15 och förmodligen den multisystemiska trombos som observerats i hästen i vår rapport. Hos får gör sjukdomens mycket akuta natur upptäckten avKliniska tecken svåra, med djur som vanligtvis hittas döda. I fall där teckenobserveras, de är ospecifika och inkluderar svaghet, slöhet, anorexi, hypertermi,tachypnea, hyperpnea och slutligen liggande. Clinicopathologicförändringar kan inkludera neutrofili med vänster skift, azotemi,metabolisk acidos och förhöjda lever-och muskelenzymaktiviteter.15,19

med tanke på att endast 6 fall av presumtiv INH har beskrivits tidigare hos hästar,är tillgänglig epidemiologisk, klinisk och patologiinformation knapp. Baserat på detta begränsade antal fall, det finns ingen uppenbar kön eller ras predisposition Incase av häst INH, och både unga och vuxna djur kan påverkas. Denklinisk kurs är vanligtvis längre hos hästar än hos idisslare, varar 12-72 timmar,och resultatet har alltid varit dödligt. Kliniska tecken varierar från mild till svårdepression och motvilja mot rörelse, neurologiska tecken inklusive ataxi och headtilt, hyperemiska och/eller icteric slemhinnor och okulär sclera, buksmärta och liggande.20,23 i ett fall där abdominocentes utfördes, erhölls en ökad mängd grumlig vätska med förhöjd proteinkoncentration ochspecifik gravitation.9

Clinicopathologic profiler av hästar med INH är mycket varierande, och de kanrepresentera olika stadier av förgiftning och leverskada. Dessa förändringar kaninkludera neutrofili med vänster skift, förhöjd leverenzymaktivitet, trombocytopeni, hyperfibrinogenemi, hyperbilirubinemi och minskadkoncentration av elektrolyter.9,16,19 dessutom ökadeaktiverad partiell tromboplastin, protrombin och trombintider har rapporterats.23 dessa förändringar, i kombination med den observerade kapillärmikrotrombi, ärföreslår disseminerad intravaskulär koagulering, en process som sannolikt kommer att uppståunder toxemi och hemolys hos stora djur.22,23 Denden resulterande konsumtionen av koagulationsfaktorer, deras minskade syntes på grund avhepatiskt misslyckande och den synergistiska verkan av TcnA på vaskulärt endotel ärförmodligen ansvarig för de utbredda blödningarna som observerats i fall avinh.

även om ikterus inte beskrivs hos idisslare kan hästar ibland uppvisa detta tecken associerat med INH.19,23 Icterus verkar vara relaterad till svårighetsgraden avhepatisk skada och till viss del till hemolys, som i vårt fall, i vilkethemoglobin visualiserades i njurtubulerna av Okajima-fläcken. Hästen i vår studie hade måttligt ökad järnkoncentration i levern, vilket tyder på ahemolytisk process.5 Denna nivå av järn i levern är emellertid ett vanligt fynd hos hästdykning av olika orsaker och det anses ofta vara en tillfällig upptäckt i samband med trängsel och postmortem autolys (författarnas opublicerade observation).

även om det kan antas att hästar är mer mottagliga än andra artertill verkan av det hemolytiska beta-toxinet som produceras av C. novyitype B, har hemoglobinuriska förändringar inte beskrivits i presumtiva fall avinh.16,23 jämfört med C. haemolyticum producerar C. novyi Typ B lägre nivåer av betatoxin;15 därför antas dess bidrag till patogenesen av INH vara mindre, vilket orsakar viss grad av hemolys hos hästar, men inte tillräckligt för att inducera betydande hemoglobinuriassocierade förändringar. Dessutom utesluter ingen av de tidigarefallen rollen som C. haemolyticum som orsakssambandav sjukdom, så slutliga slutsatser kan inte dras av dessa fall. C. haemolyticum har varit inblandad i ett fall av septisk peritonit ina sto genom identifiering med MALDI-TOF; emellertid försöktes inte PCR-eller toxinidentifiering i det specifika fallet.11

den predisponerande faktorn för INH hos hästar har inte alltid fastställts, även om de hepatiska migrationerna av F. hepatica och besläktade trematoder, liksom medlemmar av familjen Strongylidae, har föreslagits.9,12,19 dessutom har anthelminthic behandling föreuppsättning av kliniska tecken föreslagits som en potentiell utlösare av sjukdomen,9,16,23 förmodligen genom att orsaka en viss grad av hepatisk nekrosassocierad med förstörelsen av migrerande parasiter. Men ingen vetenskapligbevis finns för att stödja denna hypotes. Tyvärr är ingen kändpredisponeringsfaktorer bestämdes i vårt fall.

som i vårt fall beskrev de flesta tidigare rapporter en enda (multipel i ett fall19) fokus på nekros som påverkar levern, konsekvent belägen i vänsterloben. Detta står i kontrast till Inh av får där slumpmässigt fördelade, smånekrotiska foci är vanligare.6,15 anledningen till dettavariation i distribution är okänd. Det är möjligt att övervägande avlesioner på vänster lob är relaterad till så kallad portalströmning, som äransvarig för differentiellt flöde av portalblod till särskilda lober avlever. Eftersom C. novyi förmodligen absorberas från den lillatarmen, och blodet från detta organ följer portalströmning till vänsterloben, kan detta leda till att denna lob huvudsakligen påverkas.6 frånvaron av förändringar i samband med hepatisk encefalopati (t. ex., Alzheimers typ II astrocytos associerad med hyperammonemi) 6 kan föreslå att neurologiska tecken i detta och tidigare fall varföljd av blödningar, trängsel och perivaskulärt ödem noterat i hjärnan, relaterat till toxemi och verkan av TcnA på kapillärendotelet.

INH bör finnas i listan över differentiella diagnoser av hästar med neurologiskkliniska tecken, toxemi, akut leversvikt och peritonit. Även ombehandling med höga doser penicillin och tetracykliner kan vara effektiv motc. novyi resulterar den avancerade produktionen av toxiner vanligtvisi en dålig prognos.19 i områden där sjukdomen är tydligt förknippad med leverfläckoroch/eller andra parasiter kan man försöka minska parasitbelastningen och begränsa tillgången till djur till dåligt dränerade betesmarker som förebyggande åtgärder.15

med tanke på att flera klostridiala sjukdomar antas vara associerade med accelereradpostmortem sönderdelning, är ett viktigt övervägande för korrekt diagnos avinh behovet av snabb utvärdering och bevarande av vävnader efter dödsfallet av djuret.6,23 klinisk historia, rutin obduktion, histopatologi och immunfärgning av C. novyi i leverskador är väsentliga för att ge en presumtiv diagnos av INH. Eftersom isolering inte alltid ärframgångsrik, med tanke på mikroorganismens strikta anaeroba krav,är molekylär identifiering med PCR ett värdefullt verktyg för att tillhandahålla en etiologiskdiagnos och att skilja C. novyi Typ B från andraklostridiala patogener.