Arabidopsis cmt3 kromometylas mutationer blockerar icke-CG metylering och tysta av en endogen gen | Jiotower

resultat och diskussion

för att identifiera faktorer som styr metylering och tysta av ws PAI-generna, isolerade vi en mutant variant av ws, pai1C251Y, i vilken tysta av den metylerade singlet PAI2-genen kan visualiseras av intensiteten av en blå fluorescerande växtfenotyp under ultra-violett (UV) ljus (bartee och Bender 2001). I pai1C251Y-stammen är de enda potentiella källorna till Pai-enzymaktivitet PAI1-genen, som är förlamad av en missense-mutation, och PAI2-genen, som tystas. På grund av denna Pai-brist ackumulerar stammen fluorescerande tryptofanvägsintermediärer, såväl som att visa gulgrön bladpigmentering, minskad storlek, ökad bushiness och minskad fertilitet. Mutationer på andra plats som lindrar PAI2-tystnad kommer emellertid att undertrycka de PAI-bristfälliga fenotyperna (Bartee and Bender 2001). Således mutageniserade vi pai1C251Y-stammen och screenades för plantor med undertryckta svaga fluorescerande fenotyper. Som en sekundär skärm testade vi PAI-metylering genom Southern blot-analys med metyleringskänsliga restriktionsenzymer. Specifikt analyserade vi metylering med isoschizomererna HpaII och MspI, som känner igen sekvensen 5′-CCGG-3′. HpaII är känslig för metylering av både de inre (CG) och de yttre (CNG) cytosinerna, medan MspI endast är känslig för metylering av de yttre cytosinerna. Dessa enzymer klyver en gång i varje WS PAI-locus och avslöjar både densiteten och mönstret för metylering för varje gen (Bender och Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

från denna screeningstrategi isolerade vi 11 alleler av funktionsförlust i cmt3-genen (se nedan och material och metoder). Cmt3-mutanterna i pai1C251Y-bakgrunden visade starkt reducerad fluorescens vid tidig plantutveckling och delvis minskad fluorescens hos vuxna växter, med ökad storlek, minskad bushiness och ökad fertilitet (Fig. (Fig.1).1). Dessa mellanliggande fluorescerande cmt3-isolat återvände inte till nonfluorescens, vilket är diagnostiskt för förlust av kvarvarande PAI2-metylering (Bender och Fink 1995), vid en detekterbar frekvens. De visade delvis ökad klyvning med HpaII och starkt ökad klyvning med MspI för PAI-generna i förhållande till föräldra pai1C251Y (Fig. (Fig.2A).2A). Klyvningsmönstret föreslog att cmt3-mutanterna påverkades mest vid underhåll av CNG-metylering av PAI-generna. För att avgöra om cmt3-mutanterna också påverkade metylering av en mycket upprepad genomisk sekvens, förebrådde vi Hpaii/Mspi Southern blot med en sond till 180-bp centromere-associated repeat (CEN) sekvenser (Vongs et al. 1993). Denna sond avslöjade liten effekt på hpaii-klyvning men ökade mspi-klyvning, i överensstämmelse med det mönster som observerats för PAI-generna (Fig. (Fig.2B).2B). Ett liknande mönster av ökad mspi-klyvning observerades också vid upprepad rDNA (data visas inte). Alla testade 11 cmt3-alleler hade identiska metyleringsmönster i dessa analyser. Dessutom, när cmt3-allelerna segregerades bort från pai1C251Y-allelen till en vildtyp ws-bakgrund, visade de också identiska metyleringsmönster i dessa analyser (Fig. (Fig.2).2). Pai-och CEN-metyleringsmönstren skilde sig från de mönster som inducerades av de karakteriserade ddm1-och met1-metyleringsbristande mutationerna (Fig. (Fig.2; 2; Bartee och Bender 2001).

för att mer exakt bestämma metyleringsmönster i cmt3-mutantbakgrunden utförde vi genomisk sekvensering av metyleringsmönster i PAI1-och PAI2-promotorregionerna i en representativ cmt3-allel genom att använda natriumbisulfitmutagenes (Frommer et al. 1992). Denna analys avslöjade att majoriteten av metylerade cytosiner (87% i PAI1 och 70% i PAI2) inträffade vid CG-rester (Fig. (Fig.3; 3; Tabell Tabell1).1). Jämfört med den vilda typen WS PAI1-promotorn (Luff et al. 1999; tabell Tabell1), 1), reducerades CG-metylering 34%, CNG-metylering eliminerades och asymmetrisk metylering reducerades 93%; i PAI2-promotorn reducerades CG-metylering 8%, CNG-metylering reducerades 92% och icke-CG-metylering reducerades 75%. Således har förlust av cmt3-funktion en stark effekt på underhåll av CNG och asymmetrisk metylering och en svagare effekt på underhåll av CG-metylering. Dessa resultat överensstämmer med rapporter om att Arabidopsis CMT3 och majs ZMET2 är viktiga för underhåll av CNG-metylering vid olika genomiska platser (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), men de visar vidare att CMT3 också är viktigt för underhåll av asymmetrisk metylering för PAI-generna. Detta resultat innebär antingen att CMT3 direkt kontrollerar både symmetrisk och asymmetrisk metylering eller att minskningen av symmetrisk metylering i cmt3-mutantbakgrunden orsakar minskad asymmetrisk metylering som en sekundär konsekvens. Eftersom de metylerade sekvenserna i promotorn och den första exonen av PAI2-reportergenen (270 BP) innehåller endast 16 dispergerade CG-motiv, hypometylerar förlusten av icke-CG-metylering signifikant denna region av genen (Fig. (Fig.3), 3), Redovisning för förbättrad PAI2 uttryck i suppressor mutant.

cmt3 mutant locus i pai1C251Y cmt3 suppressorisolat kartlades av kors med den polymorfa stammen Nd-0, som har ett liknande arrangemang av tätt metylerade PAI-gener som finns i WS (Melquist et al. 1999). F2 avkomma med svagt fluorescerande fenotyper som diagnostiserar homozygositet för både pai1C251Y och cmt3 identifierades genom visuell inspektion under UV-ljus och bekräftades av Mspi Southern blot för stark Pai-klyvning liknande den som observerades i föräldrasuppressorisolaten. En kartläggningspopulation av F2-växter som uppfyllde dessa kriterier användes sedan för att göra poäng för genomiska loci kopplade till den undertryckta fenotypen. Kartläggningsanalysen avslöjade koppling till ett enda locus på underarmen av kromosom 1. Eftersom cmt3 förmodade cytosinmetyltransferasgen kartor till denna plats, vi fokuserade på denna gen som kandidat. Inom varje kartläggningspopulation fann vi fullständig koppling till en polymorf markör som ligger inom 100 kb av cmt3-genen. För att bekräfta att cmt3-genen faktiskt var platsen för metyleringsundertryckningsmutationerna klonade och sekvenserade vi genen från de 11 mutanta isolaten. Sekvensering avslöjade en enda basförändring i cmt3-kodningssekvensen i varje isolat. Tre av de mutanta allelerna påverkade absolut konserverade aminosyror i metyltransferasskatalytiska domänen, inklusive den representativa cmt3g456d-allelen som användes för bisulfitsekvensering. En annan allel förutspåddes att för tidigt avsluta proteinet. Två alleler skapade skarvkorsningsmutationer. De återstående fem allelerna påverkade aminosyror mellan metyltransferas motiv IV och C-änden av proteinet som är mycket konserverade bland CMT-generna (Fig. (Fig.4).4).

för att ytterligare bekräfta att cmt3-genen var mutant locus, transformerade vi pai1C251Y cmt3-isolaten med en vildtyp WS genomisk klon av cmt3-genen. Transformerande plantor var starkt fluorescerande, på samma sätt som pai1C251Y-stammen (Fig. (Fig.1).1). Transformantlinjer analyserade av Southern blot-analys i T2-generationen visade remetylering av PAI2-genen till de nivåer som observerades i den ursprungliga pai1C251Y-stammen (data visas inte). Således kan den klonade cmt3-genen komplettera de mutanta metyleringsdefekterna. Som en kontroll transformerades också den representativa pai1C251Y cmt3g456d-mutanten med en vildtyp WS genomisk klon av CMT2-genen. CMT2 transformerande plantor var svagt fluorescerande, på samma sätt som de hos den otransformerade föräldrastammen (Fig. (Fig.1), 1) och visade inte detekterbar remetylering av PAI2. Denna analys visar att CMT2 inte kan ersätta cmt3-funktionen. I detta avseende är det intressant att notera att CMT2 skiljer sig från CMT3 främst i sin N-terminala sekvens (Fig. (Fig.44).

tidigare karakteriserade metyleringsbristande Arabidopsis-stammar med defekter i antingen SWI2/SNF2-kromatinremodelleringsfaktorrelaterad gen DDM1 (Jeddeloh et al. 1999) eller DNMT1-relaterad MET1 cytosinmetyltransferasgen visar progressiva utvecklingsavvikelser (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Vår preliminära analys av sex generationens inavlade pai1C251Y cmt3 och två generationens inavlade cmt3-stammar avslöjade ingen uppenbar segregering av morfologiska förändringar. Denna skillnad mellan cmt3 och andra metyleringsbristande mutanter kommer sannolikt att återspegla det faktum att CG-metylering behålls i högre grad i cmt3 än i ddm1 eller met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee och Bender 2001). Eftersom många av de endogena metylerade platserna i Arabidopsis-genomet, såsom CEN-upprepningarna (Fig. (Fig.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), och promotorn för fwa homeo-domain-genen (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), bär främst CG-metylering, cmt3-mutationer förväntas inte starkt påverka dessa loci. Istället fungerar cmt3 troligen som ett förstärkande metylas som lägger till ett extra lager av metylering till specifika genomiska regioner såsom PAI-generna, där den ökade metyleringstätheten leder till ökad tystnad. En specifik modell är att basalskiktet av CG-metylering som tillhandahålls av andra funktioner såsom MET1 kan fungera som en guide för CMT3, som sedan skulle dekorera basalskiktet med extra CG och icke-CG-metylering. Cmt3-rekrytering till riktade regioner kan involvera kromatinproteininteraktioner med kromodomainmotivet (Henikoff och Comai 1998), tillsammans med interaktioner medierade av de unika N-terminala sekvenserna.

eftersom svampar som Neurospora crassa och Ascobolus immersus kan upprätthålla metylering utan kg (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994) kan dessa organismer koda CMT-gener. Omvänt, eftersom djur som människor och möss saknar icke-CG-metylering, förutspås dessa organismer sakna CMT-gener, vilket är fallet från analyser av nuvarande sekvensdatabaser. Den uppenbara bristen på CMT-liknande metylaser i djurgenom (Finnegan och Kovac 2000) antyder att djur har utvecklat alternativa mekanismer för förstärkning av kromatintillstånd.