raffinering av phylum Chlorobi genom att lösa fylogeni och metabolisk potential hos representanten för en djupt förgrenad, odlad härstamning

genomisk rekonstruktion av NICIL-2

mikrobiell samhällskompositionsanalys av termofila bakteriekonsortier anpassade för att växa på biomassasubstrat (cellulosa, xylan och switchgrass) som sin enda kolkälla vid 60 C-C identifierade konsekvent en allestädes närvarande OTU97 som var avlägset relaterat till odlade medlemmar av phylum Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Metagenomic sekvensering av ett konsortium anpassat för att växa på jonisk-flytande förbehandlad switchgrass, där den Klorobi-relaterade OTU97 var riklig, utfördes för att förstå fylogeni och metabolisk potential hos befolkningen som representerades av denna OTU97. Montering (se material och metoder) och automatiserad binning (Wu et al., 2014) av metagenomet i detta konsortium gav 20 genomiska fack (kompletterande tabell S3), bland vilka de vanligaste facken var en befolkning som var nära besläktad med Chitinophagaceae-stammen NYFB (61,8%), som isolerades från en relaterad anrikning odlad på cellulosa (Eichorst et al., 2013) och den Klorobi-relaterade bin (23,1%). Soptunnor närvarande vid > 1% inkluderade flera okultiverade populationer kluster med Paenibacillaceae (soptunnor 003 och 006), en odlad population kluster med Verrucomicrobia underavdelning 3 (bin 004) och en population nära besläktad med Thermobipora bispora (bin 005), en aktinobakteriell termofil.

den Klorobi-relaterade bin fick namnet NICIL-2 (för Newby Island Compost Ionic Liquid-2nd i överflöd). Analys av proteinerna som förutspåddes från NICIL – 2-genomet överensstämde med dess identifiering som en population som är avlägset relaterad till medlemmar av FCB superphylum, med Bacteroidetes (33%) och Ignavibacteria (15.7%) som har de mest närbesläktade proteinsekvenserna (Figur 1). Det återvunna NICIL-2-utkastgenomet var relativt litet (2,67 Mbps) och nästan fullständigt (95,3%; 102 av 107 enkla kopieringsmarkörgener i 152 byggnadsställningar). N50-längden för NICIL-2-utkastgenomet var 168 929 bp och den största contig var 1.1 MB, vilket tyder på att de flesta ställningarna representerade en högkvalitativ montering (Tabell 1).

fördelningen av den bäst matchade linjen för alla NICIL-2-proteiner. Procentandelar uppskattas genom att dividera proteinantal som matchade varje härstamning mot antalet alla NICIL-2-proteiner. Se material och metoder för detaljer.

fylogenetisk analys av NICIL-2

en 16S rRNA-gen (1451 bp) återhämtades från NICIL-2-utkastgenomet. Den ribotyp som är närmast relaterad till 16S rRNA-genen av NICIL-2 (>99% identisk) sekvenserades från en fosmid-klon (JFF029_06) återhämtad från en termisk ström (70 kcal C) i en japansk guldgruvsekvens (Nunoura et al., 2005). 16S rRNA-gener från odlade representanter för Bacteroidetes och Chlorobi var <85% identiska med NICIL-2-sekvensen. Ett fylogenetiskt träd konstruerat genom att anpassa 16S rRNA-gensekvenser relaterade till NICIL-2 visade att linjen innehållande NICIL-2 skilde sig från Bacteroidetes och Chlorobi (Figur 2). NICIL – 2-linjen innehöll två nedstigningslinjer baserat på temperaturen i provtagningsmiljön. Högtemperaturklustret (avbildat i rött i Figur 2) inkluderade ribotyper som främst återhämtades från högtemperaturmiljöer som sträcker sig från 55 C till 80 C, såsom klonen OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). Det andra klustret inkluderade ribotyper som främst återhämtades från måttliga temperaturmiljöer som sträcker sig från 20 C till 32 C (avbildad i grönt i Figur 2). Eftersom OPB56 var den första klonen som upptäcktes som är ansluten till detta fylogenetiska kluster, kallas linjen som innehåller NICIL-2 som OPB56-kladen. En utökad vy av 16S rRNA-genträdet avbildas i kompletterande figur S1.

den maximala sannolikheten fylogenetiska träd byggd för den nya härstamning NICIL-2 med användning av 16S ribosomala RNA-genen. Kladen närmast arten NICIL-2 var från en fosmid isolerad från en japansk guldgruva (Nunoura et al., 2005). Arttemperaturintervall bestämdes från litteraturen associerad med varje NCBI-anslutningsnummer. Invånartemperaturen för arter markerades med rött (>55 CCB), grönt (20-32 CCB) eller svart (obestämt). Skala bar betecknar 0,05 förändringar per nukleotid plats. Detaljer för trädbyggnad finns i material och metoder. Det expanderade fylogenetiska trädet som visar alla noder finns i Tilläggsfigur S1. En fullfärgsversion av denna figur finns tillgänglig på ISME Journal online.

för att fastställa den fylogenetiska anslutningen av NICIL-2 och OPB56-kladen mer fullständigt erhölls ytterligare ribosomala proteinsekvenser från data som utvanns från naturliga prover. Homologer av 22 konserverade ribosomala gener i NICIL-2 hittades i två japanska termiska fjäderfosmidkloner (JFF029_C06 och JFF027_B02). Denna uppsättning av 22 ribosomala proteiner användes för att söka metagenomic datamängder från miljöer med hög temperatur. Kompletta uppsättningar av dessa konserverade ribosomala gener identifierades i fyra metagenomiska datamängder erhållna från miljöer med hög temperatur. Automatiserad binning av dessa datamängder återhämtade sex nästan fullständiga (>90% fullständiga) utkast till genom som innehöll sekvenser för de konserverade 22 ribosomala proteinerna i NICIL-2-genomet och den japanska guldgruvan fosmid-kloner (kompletterande tabell S4). Fem av de sex sammanfogade proteinsekvenserna grupperade med i OPB56-linjen med NICIL-2, medan en av sekvenserna från Yellowstone Fairy Falls grupperade med Ignavibacteria (figur 3a). Detta fylogenetiska träd visade att Chlorobea, Ignavibacteria och OPB56 bildade en monofyletisk klad med högt förtroende (97%). Bacteroidetes bildade ett distinkt kluster och familjen Rhodothermaceae, vars anknytning till Bacteroidetes har ifrågasatts (Nolan et al., 2009), var anslutna till Bacteroidetes med högt förtroende (>80%). Ett andra fylogenetiskt träd konstruerades genom att sammanfoga en inriktning av 86 enstaka kopieringsgener delade mellan Bacteroidetes, Chlorobi och Fibrobacter (figur 3b). Detta träd reproducerade topologin som observerades för genen byggd från de 22 ribosomala generna, vilket ytterligare stödde anslutningen av Chlorobea, Ignavibacteria och OPB56.

den maximala sannolikheten fylogenetiska träd byggd för den nya härstamning NICIL-2 med användning av (a) 22 ribosomala proteiner och (b) 86 enda kopia proteiner delas mellan Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 och Fibrobacter kluster. Skala bar betecknar 0,1 förändringar per aminosyra plats. Detaljer för trädbyggnad finns i material och metoder.

ett kompletterande tillvägagångssätt för att förstå evolutionära relationer mellan Bakteriodeter och Klorobi har varit att identifiera indels i konserverade proteiner (Gupta och Lorenzini, 2007). Infogningar i DNA-polymeras III (28 aa) och alanyl-tRNA-syntetas (12-14 aa) som är konserverade bland GSB och frånvarande bland Bakteriodeterna tillskrivades som karakteristiska för phylum Chlorobi. Inriktningar av dessa två proteiner (kompletterande figurer S2 och S3) indikerar att DNA-polymeras III-insättningen i GSB-proteinsekvenserna inte finns i de förutsagda proteinerna från Ignavibacteriae-och NICIL-2-genomen, medan 2-3 aminosyror av insättningen i GSB alanyl-tRNA-syntetassekvenserna bevaras i Ignavibacteria-och NICIL-2-proteinsekvenserna.

metabolisk rekonstruktion av NICIL-2

fysiologin för NICIL-2 härleddes av metabolisk rekonstruktion och dess metaboliska potential jämfört med representanter för GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodotermus marinus och Salinbacter ruber) och Ignavibacteria (Ignavibacterium album och Meliobacter roseus). Gener som kodar för fotosyntesrelaterade proteiner, inklusive homologer av C. tepidums fotosyntetiska reaktionscentralunderenheter (CT1020, pscB, psC, pscD), klorosomhöljeproteiner (Csmabcdefhijx) och bakterioklorofyll a-proteiner (fmoA) saknas i alla andra genomer, vilket skiljer GSB i denna jämförande uppsättning (Eisen et al., 2002). En visuell sammanfattning av den metaboliska rekonstruktionen presenteras i Figur 4. För fullständig geninformation, boxnummer och förkortningar, se Tilläggstabeller S5 och S6.

rekonstruerad metabolism av NICIL – 2 härledd från det återmonterade genomet. För fullständig geninformation, boxnummer och förkortningar, se Tilläggstabeller S5 och S6. Röd text representerar enzymer eller biosyntetiska vägar som saknas i genomet. Blå, gröna och lila pilar indikerar ATP, NADH respektive NADPH-flöde.

kolmetabolism

NICIL-2-genomet kodar för en komplett uppsättning gener för glykolys, TCA-cykeln och glukoneogenes (Figur 4). Gener för rTCA-cykeln, som är närvarande och uttrycks för autotrofisk kolfixering i GSB, är frånvarande. Vidare antyder närvaron av gener som kodar för liposyrainnehållande kofaktorer i pyruvatdehydrogenas-och Kazaki-ketoglutaratdehydrogenas-komplexen att TCA-cykeln fungerar i oxidativ riktning. Det mesta av rTCA-cykeln har rekonstruerats i R. marinus och I. album, inklusive flera pyruvat-ferredoxinoxidoreduktaser och chubbi-ketoglutarat-ferredoxinoxidoreduktaser, två nödvändiga enzymer för rTCA-cykeln. I. album och R. marinus genomer saknar ATP-beroende citratlyas, ett kritiskt enzym för att slutföra rTCA-cykeln (Buchanan och Arnon, 1990). Det har föreslagits att I. album kan använda ett ATP-oberoende citratlyas för att fungera i rTCA-cykeln istället, även om detta påstående är oprövat experimentellt och varken I. album eller R. marinus har visat sig växa autotrofiskt (Liu et al., 2012a).

trots sin höga relativa överflöd i anpassade kulturer som växer på växtbiomassa hade NICIL-2 en överraskande begränsad enzymatisk kapacitet att dekonstruera komplex biomassa. Jämförelsen av den metaboliska potentialen för polysackaridhydrolys bland de 20 facken extraherade från metagenomet från förbehandlad switchgrassanrikning visade att NICIL-2 har relativt färre gener för cellulosa och hemicellulosadekonstruktion jämfört med andra medlemmar i det mikrobiella samhället (kompletterande figur S4). I synnerhet har stam NYFB, verrucomicrobialpopulationen och flera Gram-positiva Firmicutes mer omfattande repertoarer av gener för polysackaridhydrolys. Ytterligare inspektion av de rekonstruerade OPB56-anslutna genomerna från naturliga prover med hög temperatur visade att bristen på gener för polysackaridhydrolys var vanligt för denna klad. Bland genomerna kluster med Bacteroidetes och Chlorobi, R. marinus, M. roseus och Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, som kluster med Ignavibacteria, hade en omfattande repertoar av glykosidhydrolaser för att dekonstruera växtbiomassa. Dessa analyser tyder på att NICIL-2 och relaterade medlemmar av OPB56-kladen förmodligen inte är involverade i den primära dekonstruktionen av biomassa i det anpassade samhället och naturliga miljöer. Det är tänkbart att NICIL-2 kan växa på sockermonomerer eller oligomerer; emellertid identifierades endast en förutsagd disackaridtransportörgen i genomet.

även om valet för NICIL-2 inträffade under aeroba förhållanden kan det ha kapacitet för jäsning. Gener för fermentativ produktion av etanol är närvarande (via alkoholdehydrogenas, EC 1.1.1.1), medan gener för formiat (via pyruvatformiatlyas, EC 2.3.1.54), laktat (via laktatdehydrogenas, EC 1.1.1.27) och propionat (via metylmalonyl-CoA-karboxyltransferas, 2.1.3.1) saknas. NICIL – 2-genomet kodar för en gen för fosfotransacetylas (EC 2.3.1.8), men inte acetatkinas (EC 2.7.2.1), vilka båda krävs för fermentativ acetatproduktion. Både I. album och M. roseus innehåller gener för produktion av laktat och acetat, medan C. tepidum inte gör det.

kväve-och svavelmetabolism

gener för ammoniumassimilering, glutaminsyntas (EC 6.3.1.2) och glutamatsyntas (EC 1.4.1.13) detekterades i NICIL-2-genomet. Inga gener identifierades emellertid för dissimilatorisk nitratreduktion, assimilerande nitratreduktion, denitrifikation, kvävefixering och nitrifikation. C. tepidum kodar NIF-gener som krävs för N2-fixering, medan M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012A) och R. marinus (Nolan et al., 2009) gör det inte. C. tepidum är en obligatorisk svaveloxiderare och kan därför oxidera sulfid, tiosulfat, sulfit och elementärt svavel. C. tepidum oxiderar företrädesvis sulfid till elementärt svavel, sedan elementärt svavel och tiosulfat till sulfat (Chan et al., 2008). Dessutom kan sulfit oxideras när den levereras i tillväxtmediet, men det kan inte upprätthålla C. tepidum som den enda elektrondonatorn (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus och R. marinus saknar alla gener som krävs för oxidation av reducerade svavelföreningar.

Aminosyrabiosyntes

NICIL-2-genomet saknar många nyckelgener för biosyntes av aminosyror. Kompletta vägar är kodade för alanin, arginin, asparagin, aspartat, Aci-alanin, glutamat, glycin, lysin och metionin. NICIL-2 saknar ilvC och leuABCD och har därför ofullständiga vägar för valin, leucin och isoleucinbiosyntes. På samma sätt, I. album genome saknade alla gener som krävs för valin, leucin och isoleucin biosyntes från pyruvat med undantag för grenad kedja aminotransferas (ilvE), medan M. roseus och C. tepidum innehåller kompletta vägar. Varken NICIL – 2 eller I. album kodar gener som krävs för prolinbiosyntes från glutamat (proBAC), medan både C. tepidum och M. roseus gör. Den serbiska genen för biosyntes av serin saknas i NICIL-2, I. album, M. roseus, och finns i vissa GSB, inklusive C. tepidum. NICIL – 2 kan också använda aminosyror som tillväxtsubstrat. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Istället ordnas majoriteten av generna oberoende genom det största nicil-2-ställningen (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE och nuoMN), och de återstående generna finns på tre mindre ställningar (nuoAB, nuoL och nuoC), vilket indikerar att frånvaron av en operonstruktur inte är en artefakt för montering. C. tepidum innehåller en uppsättning gener som kodar för NADH: ubikinonoxidoreduktas som saknar nuoEFG (11 subenheter). I. album och M. roseus innehåller två uppsättningar nuoABCDHIJKLMN och en uppsättning nuoEFG vardera (kompletterande figur S6). Intressant är komplex i från NICIL-2 närmast relaterad till Rhodotermus marinus och Salinibacter ruber av Bacteroidetes, som båda innehåller en komplett uppsättning gener för NADH:ubiquinonoxidoreduktas (figur 5a). Homologer för de 11 komplexa i-underenheterna identifierades också i alla sex NICIL-2-relaterade fack som återhämtades från Yellowstone och Great Boiling Spring, och en sammanfogad sammansättning av dessa proteinsekvenser grupperade med sekvenserna från NICIL-2.

granne som förenar orotade sammanfogade proteinträd av komplex i (a) och alternativt komplex III (b). Siffror inom parentes anger antalet underenheter som används för att bygga trädet. Skala bar betecknar X förändringar per aminosyra plats.

ACIII är en ny klass av bakteriella membranoxidoreduktaser som finns i organismer som ofta saknar BC1-komplexet (Yanyushin et al., 2005). ACIII från R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) och filamentös anoxygen fototrofisk bakterie Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) har renats och studerats. Nyligen hittades ett stort antal genkluster som kodar för ACIII-underenheter, med variationer i konstitution och organisation, i en rad bakteriella genom (Refojo et al., 2013). Till exempel innehåller R. marinus generna actABCDEF i en operon som kodar för sex ACIII-subenheter; homologer av detta genkluster har identifierats i flera medlemmar av Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Ett fylogenetiskt träd visar förhållandet mellan ACIII från NICIL – 2 och dess närmaste släktingar (figur 5b). GSB har inte ACIII och därför är de inte representerade i detta träd. Men ‘ Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, som inte är medlem i GSB, kodar för en ACIII som sannolikt fungerar vid aerob andning (Liu et al., 2012b). Det är viktigt att notera att både I. album och M. roseus är unika bland denna uppsättning ACIII eftersom de innehåller fem underenheter, med actDE-underenheterna identifierade som ett fusionsprotein. Ett komplett komplement av gener som kodar för alla ACIII-underenheter, som utvanns från två NICIL-2-relaterade genomfack från Yellowstone-metagenomerna, befanns innehålla actDE-fusionen och klustrade med I. album och M. roseus. NICIL – 2 innehåller inte denna fusion och generna för dess ACIII-komplex är närmare besläktade med R. marinus och S. ruber.

NICIL-2 terminala elektronacceptorer inkluderar en typ-AA3 cytokrom C-oxidas (komplex IV) och möjliga alternativa cytokrom C-oxidaser, annoterade som CoxMOP. NICIL – 2 är osannolikt att vara mikroaerofil eftersom typ cbb3-oxidaser inte detekterades i genomet. Dessutom var cytokrom bd oupptäckt. Som jämförelse innehåller både I. album och M. roseus-genomer gener för cbb3-typ cytokrom C-oxidas och ett cytokrom bd-komplex.

NICIL-2-genomet innehåller en ofullständig uppsättning mängener för syntes av menakinon. En komplett menakinonbiosyntetisk väg innehåller Menfdhcebag (Bentley och Meganathan, 1982) och NICIL-2-genomet inkluderar endast menBAG. Som jämförelse, C. tepidum och I. album innehåller kompletta män vägar, medan M. roseus och R. marinus Genom har anteckningar för alla nödvändiga gener utom menB och menH, respektive. Homologer av gener som kodar för enzymer av den alternativa menakinonbiosyntetiska vägen, futalosinvägen (Arakawa et al., 2011), upptäcktes inte i NICIL-2. Ubiquinon biosyntetiska gener är också frånvarande. NICIL – 2-genomet kan ha ofullständig täckning i detta område och ytterligare mängener kan hittas med ett helt monterat genom. Alternativt kan NICIL-2 delta i kinonutbyte med andra medlemmar i samhället, vilket observerats för det fototrofa konsortiet ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu et al., 2013).

Flagella och kemotaxi

gener som kodar för proteiner för basalkroppen, kroken och filamentaggregatet finns i NICIL-2-genomet. NICIL-2 saknar emellertid gener som kodar för kemotaxismaskiner, bortsett från ett reglerande protein, CheY. GSB anses vara icke-rörliga och saknar kemotaxi och flagella, medan I. album, M. roseus och R. marinus har flagellära och kemotaxismaskiner.