stabilisering av heterochromatin med klocka främjar stamcellsföryngring och broskregenerering

antikroppar

för western blotting: anti-CLOCK (#5157, 1:1000), anti-HP1a (#2616s, 1:1000) och anti-HP1y (#2619, 1:3,000) från cellsignaleringsteknik; Anti-kap1 (Ab22553, 1:2,000), Anti-Lamin B1 (ab16048, 1:1,000) och anti-LBR (Ab32535, 1:1,000) från abcam; anti-bisexuell-aktin (SC-69879, 1:3,000) från Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) Från r&D-System.

för flödescytometri: Anti-CD73 (550257, 1:200), Anti-CD90 (555595, 1:200), Anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), Anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) och anti-CD19 (555415, 1:200) från BD Biosciences; Anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) och anti-pDPN (17-9381-42, 1:200) från eBioscience (San Diego, CA, USA); Anti-CD29 (303004, 1:200) och anti-CD13 (301705, 1:200), Anti-CD166 (343903, 1:200) och anti-CD164 (324805, 1:200) från BIOLEGEND (San Diego, CA, USA).

cellodling

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, line H9, WiCell Research Institute) och CLOCK−/− hESCs bibehölls på matarlager som bestod av mitomycin C-inaktiverade musembryonala fibroblaster (MEF) i hESC-odlingsmedium. HESC – odlingsmediet innehöll DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut-Serumbyte (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM nonessential aminosyror (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 oc corim oc-merkaptoetanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) och 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Alternativt odlades hESCs på Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-belagda plattor i mtesr medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada).

både hESC-härledda hmsc och primära hmsc bibehölls i MSC-medium innehållande MEMa (Thermo Fisher Scientific) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific) och 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR/Cas9-medierad genredigering i hESCs

CRISPR/Cas9-medierad genredigering utfördes via tidigare beskrivna metoder med vissa modifieringar.33,34,65 i korthet, en guide RNA inriktning exon 5 av klocka (CLOCK-gRNA) klonades till en gRNA kloning vektor (#41824, Addgene) (Kompletterande information, tabell S1). Vid behandling med en BERGHÄMMARE Y-27632 (S1049, Selleck) under 24 timmar omblandades hESCs (5 106 kcal) i 100 kg Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) innehållande plasmidcocktailen, som bestod av donatorplasmiden innehållande homologiarmarna, CLOCK-gRNA och hCas9 (#41815, Addgene) och elektroporerades i ett 4D-Nukleofektorsystem (Lonza). Celler såddes sedan på MEF-matarceller. G418 (100 occurg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) tillsattes för att initiera positivt urval 2-4 dagar efter elektroporation. Efter 2 veckors urval plockades G418-resistenta kloner och överfördes till en 96-brunnsplatta för ytterligare karakterisering och expansion. Genomisk PCR och western blotting användes för genomisk redigering identifiering. Dessutom tog vi bort neomycinresistenskassetten I klocka – / – hESCs via elektroporation med pCAG-FLpo-2a-puro-vektorn. Tre dagar efter transfektion användes 1 kg/mL putromycin (Thermo Fisher Scientific) för att berika put-resistenta celler i 48 timmar. efter 8-12 dagars urval plockades de framväxande kolonierna och utvidgades för efterföljande studie.

hmsc generation och karakterisering

hMSCs differentierades från hESCs efter ett tidigare publicerat protokoll.25,86,87 i korthet dissocierades hESCs i embryoidkroppar (EBs) och behandlades med differentieringsmedium (MEMa (Invitrogen) kompletterat med 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGF 2G och 1% penicillin/streptomycin (Gibco)) på Matrigelbelagda plattor i 10 dagar tills 95% sammanflöde. Därefter smältes de sammanflytande MSC-liknande cellerna och pläterades på Matrigelbelagda plattor behandlade med MSC-odlingsmedium innehållande MEMa (Invitrogen) kompletterat med 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng/mL bFGF och 1% penicillin/streptomycin (Gibco). Därefter passerades de sammanflytande MSC-liknande cellerna till gelatinbelagda plattor. Hmsc renades med olika antikroppar motsvarande hMSC-specifika markörer (CD73, CD90 och CD105) av FACS. CD73 -, CD90-och CD105-trippelpositiva celler karakteriserades vidare av ytantigenmarkörer, inklusive positiva markörer, såsom CD44, CD166, CD29, HLA-ABC och CD13, och negativa markörer, såsom CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 och PDPN. Funktionaliteten hos hMSCs verifierades ytterligare genom differentiering mot kondrocyter, adipocyter och osteoblaster. Osteoblasterna, kondrocyterna och adipocyterna härledda från hmsc kännetecknades av von Kossa-färgning (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc.(Indikerar osteogenes), toluidinblå (T3260, Sigma) och aggrecan-färgning (indikerar kondrogenes) och Oljeröd o (O1391, Sigma) färgning (indikerar adipogenes) enligt tillverkarens instruktioner.

isolering och odling av primära hmsc

primära Hmsc isolerades från gingiva hos olika individer.23,33,34,65 vävnaderna separerade från gingiva skars i små (1 mm2) bitar med sax i TrypLE Expressenzymet för Expressexpress (1 kg) plus Dispase IV och inkuberades ytterligare vid 37 kg C i 30 minuter. De digererade vävnadssuspensionerna neutraliserades av MSC-odlingsmedium och centrifugerades vid 200 kg i 5 minuter vid rumstemperatur. De resulterande pelletsna resuspenderades i MSC-odlingsmedium innehållande MEMa (Invitrogen) kompletterat med 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF och 1% penicillin/streptomycin (Gibco) och pläterades på gelatinbelagda plattor för tillväxt av primära hmsc.

Luciferase reporter assay

per2-dLuc plasmid var en snäll gåva från E. E. Zhang.88-celler som hyser PER2-dLuc odlades till sammanflöde i 24-brunnskulturplattor och synkroniserades med 20 occurm forskolin (S2449, Selleck) för 2 h. mediet ersattes sedan med MSC odlingsmedium innehållande 0.25 mM luciferin (LUCK-1g, GoldBio). Celler övervakades i en LumiCycle-luminometer vid 37 kcal C i 5-7 dagar; de genererade data analyserades med LumiCycle Analysis software (Actimetrics). Uppgifterna från den första 24-timmarscykeln utesluts från vår statistiska analys.

in vitro hmsc-synkronisering och cirkadisk analys

hmsc pläterades på gelatinbelagda plattor med MSC-medium tills 95% sammanflöde. För synkronisering, celler behandlades sedan med 20 occurm forskolin för 2 h och åter lagras i MSC medium efter tvättning två gånger med PBS. Celler samlades in från och med 24 h eftersynkronisering vid 3-h-intervaller för 9-tidpunkter, följt av RNA-extraktion och RT-qPCR-detektering. Det icke-parametriska testet JTK_CYCLE användes för att verifiera cirkadiska svängningar som tidigare beskrivits.89 Tidskurstrådar av hmsc med både p-och q-värden < 0,05 ansågs rytmiska.

Western blotting

celler lyserades i SDS-buffert innehållande 4% SDS och 100 mm Tris-HCl. Proteinkoncentrationen kvantifierades med användning av ett BCA-kvantifieringssats (Thermo Fisher Scientific), och ~20 kg protein per prov utsattes för SDS-sida och elektroöverfördes till PVDF-membran (Millipore). Därefter blockerades membran med 5% mjölk och inkuberades med primära antikroppar och sedan med pepparrotperoxidas (HRP)-konjugerade sekundära antikroppar. Immunoreaktiva band visualiserades i ett ChemiDoc XRS+-system (Bio-Rad). Statistiska analyser kvantifierades av Image J software (NIH). Varje grupp hade tre oberoende experiment. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

transmissionselektronmikroskopi

Late-passage (P9) klocka+/+ och klocka−/− hMSCs skördades enzymatiskt med TrypLE (Thermo Fisher Scientific) och centrifugerades vid 500 kcal g för 5 min vid rumstemperatur. De resulterande pelletsna fixerades med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 7.4) på is över natten. Celler dehydrerades därefter i en graderad serie etanoler, permeabiliserades och inbäddades i Lowicrylharts HM20. Sektioner (200 nm) erhölls och avbildades med ett Spritöverföringselektronmikroskop (FEI-företag) som arbetar vid 100 kV.

Immunofluorescensfärgning

celler som frös på täckglas (Thermo Fisher Scientific) tvättades två gånger med PBS. Därefter fixerades celler med 4% PFA i 30 min, permeabiliserades med 0,4% Triton X-100 i PBS i 30 min och blockerades med 10% donkey serum i PBS (Jackson Immuno Research) i 1 h vid rumstemperatur. Efter blockeringen inkuberades cellerna med primära antikroppar vid 4 C. C. över natten. Därefter tvättades cellerna tre gånger med PBS, inkuberades med sekundära antikroppar vid rumstemperatur i 1 h och tvättades tre gånger med PBS. Kärnor färgades med Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Bildbehandling utfördes med ett Konfokalt Leica SP5-system. Statistisk analys av antal, intensitet och område av fluorescenssignaler kvantifierades med bild J-programvara (NIH). Celler samlades in från tre biologiska replikat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test. 3D-rekonstruktionen av h3k9me3-färgning som visas i Fig. 2f utfördes av seriell Z-stack-snittning med 50 nm-intervall vid ett konventionellt läge för upp till 50 bilder med ett Leica SP5-konfokalt system och bearbetas vidare för 3D-rekonstruktion av Imaris-programvara (version 7.4.2) som tidigare beskrivits.90

sa-Baccarat-gal färgningsanalys

sa-Baccarat-gal färgning utfördes som beskrivits i tidigare studier.33,34 i korthet fixerades celler med fixeringsbuffert (2% formaldehyd och 0.2% glutaraldehyd) i 5 minuter vid rumstemperatur. Därefter färgades fixerade celler med färsk färgningslösning vid 37 kcal C över natten. Synfält valdes slumpmässigt i varje brunn, och procentandelen av SA-Macau-gal-positiva celler bestämdes med hjälp av ImageJ-programvara. Varje grupp hade tre biologiska replikat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

klonal expansionsanalys

en klonal expansionsanalys utfördes som tidigare rapporterats.34,65 i korthet såddes 6000 celler per brunn i 6-brunnsplattor och odlades i 9-12 dagar. Celler tvättades två gånger med PBS, fixerades med 4% PFA och färgades med 0,2% kristallviolett i 1 h vid rumstemperatur. Synfält skannades av en skanner och mättes vidare med ImageJ software (NIH). Varje grupp hade tre biologiska replikat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

Co-IP

HEK293T-celler transfekterade med plasmider som uttrycker Flaggluc eller Flaggklocka och hmsc lyserades i CHAPS lysbuffert (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) och fullständig proteashämmare cocktail (Roche)) vid 4 C i 4 timmar och centrifugerades sedan vid 14 500 g i 4 C i 40 minuter. För Co-IP med exogena proteiner blandades supernatanterna med anti-Flaggantikroppskopplade pärlor (A2220, Sigma) och roterades över natten vid 4 kg C. För Co-IP med endogena proteiner blandades supernatanterna med de angivna antikropparna över natten vid 4 kg C med rotation och inkuberades sedan med Protein A/G-PLUS Agarospärlor (sc-2003, Santa Cruz) för ytterligare 4 timmar vid 4 kg C med rotation. Pärlorna tvättades sex gånger med CHAPS buffert och eluerades sedan med Flaggpeptider eller genom att koka i 1 SDS-laddningsbuffert i 10 min för western blotting.

LC-MS/MS-analys och proteinidentifiering

de eluerade proteinerna erhållna genom immunutfällning utsattes för 10% SDS-sida och färgades med Coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Gelbanden innehållande proteinproverna skars ut, skars i små pluggar, dehydratiserades (100% acetonitril), reducerades (10 mM DTT i 25 mM NH4HCO3 för 45 min vid 56 kcal C) och alkylerades (40 mM iodoacetamid i 25 mM NH4HCO3 för 45 min vid rumstemperatur i mörkret). Därefter torkades gelpluggarna och digererades med sekvenseringsgrad modifierat trypsin (40 ng per band) i 25 mM NH4HCO3 över natten vid 37 kcal C. slutligen användes myrsyra till en 1% slutlig koncentration för att avsluta den enzymatiska reaktionen. Den resulterande lösningen överfördes sedan till en provflaska för LC-MS/MS-analys.

nanolc-MS/MS-experimenten utfördes på en Q-exakt masspektrometer (Thermo Scientific) i databeroende läge, vilket möjliggjorde ms-datainsamling med en hög upplösning på 70 000 (m/z 200) över ett m/z-intervall på 300-1 600. Rådata från Q Exaktanalys analyserades med Proteome Discovery (version 1.4) med hjälp av Sequest ht-sökmotorn för proteinidentifiering och perkolator för FDR-analys (false discovery rate). Uppgifterna sökte mot UniProt human protein database (uppdaterad 06-2013). FDR-analys utfördes med perkolator och FDR < 1% sattes som tröskelvärde för proteinidentifiering. Peptidförtroendet sattes till högt för peptidfiltrering.

RT-qPCR och RNA-Seq

totalt RNA extraherades från odlade humana celler eller musfogar med användning av TRIzol (Thermo Fisher Scientific) och genomiskt DNA avlägsnades med användning av ett DNA-fritt kit (Thermo Fisher Scientific). cDNA genererades med Go Script Reverse Transcription System (Promega). RT-qPCR utfördes med användning av qPCR Mix (Toyobo) i en CFX384 realtidssystem (Bio-Rad). Varje grupp hade fyra bra replikat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test. Alla RT-qPCR-experiment utfördes med minst tre experimentella replikat och upprepades oberoende i minst två gånger. För musfog RNA-seq blandades knäled RNA-prover från samma behandlingsgrupp av åldrade möss injicerade med lentivirus som uttryckte Luc (n = 12 möss) eller klocka (n = 12 möss) lika i Massa och RNA-seq utfördes med två tekniska replikat. För HMSC RNA-seq undersöktes två biologiska replikat. Ett sekvenseringsbibliotek konstruerades med hjälp av ett Prep-Kit för Nebnext Ultra RNA-bibliotek för Illumina efter tillverkarens protokoll. De genererade biblioteken sekvenserades på Illumina HiSeq X-Ten-plattformar med parad sekvensering med 150-bp läslängder. Kvalitetskontroll och sekvensering utfördes av NoVo gen bioinformatik teknik. Primers som används för qPCR visades i Kompletterande information, tabell S2.

RNA-seq-databehandling

RNA-seq-databehandlingsrörledningen har rapporterats tidigare.34 Raw-Parade läsningar trimmades i Trim Galore-programvara (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Rena läsningar mappades till UCSC human hg19 genom eller mus mm10 genom med hisat2 (version 2.0.4).91 Sam-filerna konverterades till bam-filer av SAMtools med parametern “- S-b-q 10”.92 sedan beräknades läsantal av HTSeq (version 0.11.0), och endast högkvalitativa mappade läsningar (kartläggningskvalitet > 20) behölls.93 fragmenten per Kilobase per Million (FPKM) värde för varje gen beräknades med användning av StringTie (version 1.2.3).94 differentiellt uttryckta gener (DEGs) beräknades med DESeq2-paketet (version 1.22.2) med cutoff “q-värde (justerat p-värde, padj) < 0,05 och |log2 (vikbyte)| > 1 för hMSCs eller |log2 (vikbyte)| > 0,5 för musfogar”. Gen ontologi (GO) anrikningsanalys utfördes med ToppGene.95 genuppsättningsanrikningsanalys utfördes av GSEA (version 2.2.4). SASP-genuppsättning erhölls från en tidigare studie.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam och pLgw EcoDam-V5-EMD var gåvor från Prof.Bas van Steensel (Nederländska CancerInstitutet (NKI)). DamID-seq utfördes som beskrivet, 58 med modifieringar. I korthet koncentrerades Dam-och Dam-EMD-lentivirus som genererades från HEK293T-celler genom ultracentrifugering vid 19,400 xnumx kg för 2,5 h. viruspelletsna resuspenderades i PBS. CLOCK + / + och CLOCK− / − hMSCs såddes i sex-brunnsrätter vid 2 msk 105 celler per brunn. Varje grupp hade tre biologiska replikat. Nästa dag ersattes odlingsmediet med 2 mL färskt odlingsmedium innehållande antingen Dam eller Dam-EMD lentivirus. Vid 72 h efter transduktion skördades celler och genomiskt DNA isolerades med användning av ett Dneasy-blod & Vävnadssats (69504, Qiagen). Dpni (R0176S, New England Biolabs) digestion, adapterligering, dpnii (R0543S, New England Biolabs) digestion, PCR-förstärkning och rening utfördes som tidigare beskrivits.58 för adapter trimning, förstärkta DNA sonicated och digererades med AlwI (R0513S, New England Biolabs). DNA-biblioteket konstruerades med hjälp av en Nebnext Ultra DNA Library Prep Kit för Illumina (E7370s, New England Biolabs). Biblioteken poolades och utsattes för parad sekvensering med 150-bp läslängder på Illumina NovaSeq sequencers.

DamID-seq databehandling

Raw läser av Dam och Dam-EMD data för klocka+/+ och klocka−/− hMSCs trimmades i Trim Galore programvara (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmade läsningar kartlades till UCSC human hg19-genomet med Bowtie 2 (version 2.2.9).96 PCR-dubbletter avlägsnades med Markeringenduplikat.jar program i Picard verktyg. Därefter sorterades läsningar med SAMtools (version 1.6). För att minimera effekten av sekvenseringsförspänning och djup slogs bearbetade läsningar från tre replikat för varje prov samman. Sedan valdes samma antal (110 miljoner) av högkvalitativa läsningar för varje celltyp slumpmässigt för nedströmsanalys. För att visualisera DamID-signalerna beräknade vi log2-förhållandet mellan avläsningarna per Kilobase per miljon mappade läsningar (RPKM) av Dam-EMD och Dam− signalerna (log2 (Dam− EMD/Dam)) i CLOCK+/+ och CLOCK-/-hMSCs för varje 10-bp-bin med bamCompare-programmet i deepTools (version 2.5.4-2-5ee467f) programvara.

för identifiering av LAD− regioner i CLOCK+/+ och CLOCK−/-hMSCs beräknade vi först DamID-signalerna (log2− förhållandet mellan Rpkm för Dam− EMD och Dam-signalerna (log2 (Dam-EMD/Dam)) i CLOCK+/+ och CLOCK-/ – hmscs för varje 2-kb-bin med bamCompare-programmet i deepTools (version 2.5.4-2-5ee467f) programvara. Sedan implementerade vi r-paketet för dolda Markov-modeller med t-utsläpp (hmmt) (version 0.1) för att identifiera Pojkar (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

för att jämföra DamID-signalerna i LAD-regioner mellan klocka+/+ och klocka−/− hMSCs slog vi samman LAD− regioner identifierade i Klocka+/+ och klocka−/− hMSCs i fackliga och beräknade den relativa DamID− signalen (DamID-signal i klocka – / – hMSCs minus DamID-signal i klocka+ / + hMSCs) för varje union LAD-region. Därefter plottades de relativa DamID-signalerna för LAD-regioner med R-paketrideogram (version 0.2.2), som visas i Kompletterande information, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR och ChIP-seq

i korthet, 1 106 106 klocka+/+ och klocka−/− HMSCS tvärbundna i 1% (vol/vol) formaldehyd i PBS för 8 min vid rumstemperatur, och reaktionen avslutades genom inkubation med 125 mM glycin för 5 min vid rumstemperatur. Prover lyserades sedan på IS i ytterligare 10 minuter. Efter ultraljudsbehandling i Covaris S220 fokuserad-ultrasonicator (Covaris) och centrifugering i 10 min på en 12 000 × g vid 4 °C, överstående inkuberades över natt vid 4 °C med Protein En Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) konjugerad med en anti-KLOCKA-antikropp, ett anti-H3K9me3 antikropp eller kanin IgG. Därefter utfördes eluering och omvänd tvärbindning vid 68 C i 2 timmar i en termomixer. Därefter isolerades DNA via extraktion av fenol-kloroform-isoamylalkohol och etanolutfällning. Det renade DNA utsattes för qPCR för utvärdering av klocka eller h3k9me3 ockupation vid repetitiva sekvenser. De berikade fragmenten konstruerades i bibliotek utan införlivande av spike-in-kontroller via KAPA Hyper Prep-kit med PCR Library Amplification/Illumina-serien (KK8504, New England Biolabs) enligt tillverkarens instruktioner. Alla experiment utfördes minst två gånger med liknande resultat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

ChIP – SEQ databehandling

för bearbetning av H3k9me3 ChIP-seq data, rå läser trimmades med Trim Galore programvara (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmade läsningar kartlades till UCSC human hg19-genomet med Bowtie 2 (version 2.2.9).96 duplicerade läsningar togs bort med Markeringenduplikat.jar program i Picard verktyg. Därefter sorterades läsningar med SAMtools (version 1.6). För att minimera effekten av sekvenseringsförspänning och djup slogs bearbetade läsningar från tre replikat för varje prov samman. Sedan valdes samma antal (130 miljoner) av högkvalitativa läsningar för varje celltyp slumpmässigt för nedströmsanalys. För att visualisera ChIP – SEQ-signalerna beräknade vi de normaliserade läsantalet genom att bestämma RPKM-värdena för varje 10-bp-bin. För h3k9me3 toppsamtal användes SICER (version V1.1) med parametern “-w 200-g 3”.98 endast kallade h3k9me3-toppar med en cutoff FDR på 1% eller högre behölls.

för identifiering av” h3k9me3-berg ” beräknades h3k9me3-signalen i antal per miljon (CPM) i varje h3k9me3-topp. Vi rankade sedan h3k9me3-topparna i storleksordningen att öka h3k9me3-signalen och ritade h3k9me3-ChIP− SEQ− beläggningen i CLOCK+/+ och CLOCK – / – hMSCs, som visas i Kompletterande information, Fig. S4F. dessa tomter visade en tydlig punkt där h3k9me3 beläggningssignalen började öka snabbt. Därefter bestämdes böjningspunkterna för dessa kurvor. Vi definierade vidare h3k9me3 toppar ovanför böjningspunkterna som” h3k9me3 berg ” och H3K9me3 toppar under dessa punkter som typiska h3k9me3 toppar.

ATAC-seq

ATAC-seq utfördes som beskrivits tidigare.99 i korthet tvättades totalt 50,000-celler två gånger med PBS och resuspenderades i 50 oc-l lysbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.1% (v/v) nonidet P40 substitut). Upphävandet av kärnor var sedan centrifugeras på 500 × g i 10 min vid 4 °C, följt av tillägg av 50 µL av införlivandet reaktionsmix (10 µL av 5 × TTBL buffert, 4 µL av TTE-mix och 36 µL av nuclease-gratis H2O) från en TruePrep DNA-Bibliotek Prep Kit V2 för Illumina (Vazyme Biotech). Proverna inkuberades sedan vid 37 C i 30 minuter. Biblioteken förstärktes sedan och renades med TruePrep DNA Library Prep Kit V2 för Illumina (Vazyme Biotech). Bibliotekets kvalitet bedömdes med hjälp av en fragmentanalysator. Slutligen sekvenserades bibliotek på Illumina HiSeq X-Ten-plattformar med parad sekvensering med 150-bp läslängder.

ATAC-SEQ databehandling

för behandling av ATAC-seq data, rå läser trimmades med Trim Galore programvara (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmade läsningar kartlades till UCSC human hg19 genomet med Bowtie 2 (version 2.2.9) med parametern “-X 2000-N 1-L 25 –no-mixed –no-discordant-t”.96 dubbla läsningar togs bort med Markeringenduplikat.jar program i Picard verktyg. Sedan, läser sorterades med samtools (version 1.6) programvara. Därefter sammanfogades bearbetade läsningar från tre replikat för varje prov. För att visualisera ATAC-signalerna förlängde vi varje läsning med 250 bp och normaliserade läsantalet med RPKM-värdet för varje 10-bp-bin. För ATAC peak–samtal användes MACS2 (version 2.1.1.20160309) med parametern “–nomodel –shift 0 –extsize 250-call-summits”.100 endast kallade ATAC-toppar med q-värden < 0.01 behölls. ATAC-toppar identifierade i klocka + / + men inte I klocka−/− hmsc definierades som “Stängda” ATAC− toppar; ATAC− toppar identifierade i klocka – / – men inte I klocka+/+ hmsc definierades som “öppnade” ATAC-toppar. Uppskattning av den genomiska fördelningen av ATAC-toppar som används annotatePeaks.pl program i homer programvara.101

bedömning av reproducerbarheten av sekvenseringsdata

för att utvärdera reproducerbarheten av H3k9me3-ChIP-seq-och ATAC-seq-data beräknades det euklidiska avståndet mellan replikaten enligt följande: läsningar räknades och normaliserades av RPKM vid en 2-kb bin storlek. Därefter beräknades det euklidiska avståndet I R (version 3.5.1) för att utvärdera reproducerbarheten. Lägre euklidiska avstånd betyder högre korrelationer. För att utvärdera reproducerbarheten av DamID-seq-data genomfördes principal component analysis (PCA) i R (version 3.5.1). För att utvärdera reproducerbarheten av RNA-seq-data ritades scatter-tomter baserat på den regulariserade logaritmen (rlog)-normaliserade läsantalet med DESeq2, och Pearson-korrelationskoefficienten mellan replikat beräknades.

djurförsök

för teratombildningsanalys, NOD/SCID-möss (6-8 veckor gamla, köpta från Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) injicerades med 3 msk 106 klocka + / + eller klocka – / – hESCs i en Matrigel: mtesr (1: 4) lösning. Teratom skördades 8-12 veckor efter injektion för vidare analys.

för hmsc-transplantationsanalyser injicerades 1 msk 106 klocka+/+ eller klocka−/− HMSCS transducerade med lentivirus som uttryckte Luc i Ta-muskeln hos nakna möss (6-8 veckor gamla). Möss behandlades sedan med D-luciferin (LUCK-1g, GoldBio) och avbildades med ett Ivis-spektrumbildningssystem (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Bioluminescensbilder förvärvades i” auto ” – läge. Varje grupp hade sex biologiska replikat. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

för den åldrande associerade Klocknivådetektering, möss i olika åldrar (unga, 1 månad, n = 5 möss; gamla, 15 månader, n = 10 möss) euthaniserades och lederna samlades in för RT-qPCR-analys. Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

för att utvärdera om lentiviral administrering av CLOCK kunde lindra åldringsrelaterade syndrom injicerades lentivirus som uttryckte Luc (n = 14 möss) eller CLOCK (n = 13 möss) i ledhålorna hos 18 månader gamla möss (köpt från SPF (Peking) bioteknik) och fylldes på efter 8 veckors injektion. Löpbandsexperiment utfördes vid 15 veckor efter den första injektionen av lentivirus som uttryckte Luc eller CLOCK. I detalj tränades möss på en löpband (SA101, SANS) med en lutning på 5 kcal över 3 dagar i 20 min varje dag, med hastigheten accelererad från 0 till 20 m/min. På testdagen sprang mössen på löpbandet med en initialhastighet på 0 m/min, och sedan ökades hastigheten med 2 m/min till 20 m/min. Hela körtiden var inställd på 20 min. Frekvensen av mild elektrisk stötstimulans registrerades och analyserades (Luc, n = 14 möss; klocka, n = 13 möss). Mikro-CT-skanning utfördes vid 16 veckor efter den första injektionen (Luc, n = 14 möss; klocka, n = 13 möss). Möss euthaniserades sedan och lederna samlades in för histologisk bedömning (Luc, n = 14 möss; klocka, n = 13 Möss) och mRNA-kvantifiering (Luc, n = 12 möss; klocka, n = 12 möss). Statistiska signifikanser bedömdes av en två-tailed unpaired Studentens t-test.

histologi och immunhistokemi

för histologisk analys fixerades skördade musfogar med 4% PFA i 2 dagar och inbäddades i paraffin efter avkalkning i 14-21 dagar. Sektioner (5 occurm) färgades med snabb grön FCF (0.02%) och safranin O (0.1%) enligt tillverkarens anvisningar.

immunohistokemisk färgning utfördes med användning av DAB-färgningsmetoden som tidigare beskrivits, med vissa modifieringar.33,34,102 först avlägsnades glidbanorna och rehydrerades med användning av xylen och olika koncentrationer av alkohol. Antigenhämtning utfördes med användning av Trypsin (ZLI-9010, ZSGB-BIO) digestion i 20 minuter vid rumstemperatur. Väteperoxid (3%) användes för att blockera endogen peroxidasaktivitet genom inkubering i 10 minuter vid rumstemperatur. Slides blockerades sedan med 10% donkey serum för 1 h vid rumstemperatur och inkuberades med en anti-P16-antikropp (Ab54210, Abcam, 1:200) vid 4 c c över natten och med en sekundär antikropp (PV-6002, ZSGB-BIO) för 1 h vid rumstemperatur före DAB-färgning (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

etiska deklarationer

experimenten som deltog i denna studie följde principerna för Ansökningsformatet för etiskt godkännande för forskning med djur och godkändes i förväg av Institutional Animal care and Use Committee vid Institute of Zoology (Chinese Academy of Sciences). Anestesi av möss utfördes med isofluran och euthanisering utfördes med CO2 följt av cervikal dislokation.

statistisk analys

statistiska analyser utfördes med hjälp av Graph-Pad Prism-programvara. Data presenteras som medel för sem eller SD. Jämförelser utfördes med två-tailed unpaired Studentens t-test. P-värde (p) < 0,05 definierades som statistiskt signifikant.