Typ III kollagen är avgörande för kollagen i fibrillogenes och för normal kardiovaskulär utveckling

resultat och diskussion

ES (J-1) celler (22) transfekterades med en målvektor innehållande ett Col3a1-gengenomiskt DNA-fragment i vilket promotorområdet för genen och den första exon som kodar för signalpeptiden raderades (Fig. 1A). Riktade ES – cellkloner identifierades genom Southern blot-analys och användes för blastocystinjektion (Fig. 1b övre). Mutanta möss härleddes från två oberoende riktade ES – cellkloner och identifierades genom Southern blot-analys (Fig. 1b lägre). Proteinanalys av svans-och hudkollagen visade att heterozygota mutanta möss har ungefär en 50% reduktion av typ III-kollagen medan inget typ III-kollagen detekterades i homozygota mutanta djur (Fig. 1C).

mutanta djur var fertila men endast heterozygota möss var fenotypiskt normala. Homozygota mutanta möss visade en genomsnittlig överlevnadsgrad på 5% vid avvänjningsåldern, med de flesta dödsfall som inträffade inom den första 48 timmen efter födseln (Tabell 1). Den exakta orsaken till neonatal dödlighet är inte klar eftersom de döda valparna kannibaliserades innan de kunde undersökas, och lätt mikroskopisk histologisk analys av levande nyfödda homozygota mutanter upptäckte inte någon grov abnormitet. Vuxna homozygota mutanta möss verkade normala förutom att de var cirka 15% mindre än deras vilda kullkamrater av samma kön (data visas inte). Den genomsnittliga livslängden för de homozygota mutanta mössen var emellertid cirka 6 månader eller en femtedel av den normala livslängden. Obduktion visade att blodkärlsbrott var den främsta orsaken till den förkortade livslängden hos dessa möss (Tabell 2). Bristningsställena var sporadiska och mest förknippade med stora blodkärl. Histokemisk analys utfördes för att hitta den defekt som orsakade bräckligheten hos blodkärlsväggen. Fig. 2 A och B visar ett tvärsnitt av normal abdominal aorta. Aortas vägg består av intima och media (Fig. 2A, pil) och adventitia (Fig. 2 A och B, pilspetsar). Mediet består av elastiska fibrer (Fig. 2B, stora pilar) och glatta muskelceller (Fig. 2B, små pilar) och ger elasticiteten hos aortan medan adventitia består mestadels av typ i-kollagenfibriller och begränsar dilatationen av aortan. Fig. 2C visar ett tvärsnitt av en dissekerande aneurysm i buken aorta från en homozygot mutantmus. Brottet korsade mediet (pilen), vilket ledde till en blodfylld kanal (stjärna) mellan media och adventitia (pilhuvud) och kollapsade delvis aortas lumen. Adventitia bröt så småningom någon annanstans, och blod läckte in i bukhålan som är fallet hos människor med dödlig aortaaneurysm (20). Det övergripande arrangemanget av de elastiska fibrerna och de glatta muskelcellerna (Fig. 2D) liknade kontrollerna (Fig. 2B). Intensiteten och fördelningen av extracellulärt matrismaterial och den mörkare färgningen i adventitia och mellan elastiska fibrer och glatta muskelceller i intima hos mutanta möss (Fig. 2D) var jämförbara med kontroller av vildtyp (Fig. 2B). Inga uppenbara defekter i hjärtat och medelstora och små artärer hos mutanta djur observerades under ljusmikroskopet (data visas inte).

förutom aneurysm visade mutanta möss frekvent tarmförstoring och tillfällig tarmbrott som resulterade i död (Tabell 2). Cirka 60% av homozygota mutanta möss visade hudskador, den allvarligaste av dessa presenteras som ett öppet sår av 1 cm längd i axelområdet, som helt trängt in i huden och exponerade subdermal vävnad (Fig. 3). Såren berodde inte på att slåss mellan djur, eftersom de observerades hos djur som kastades separat. Lätt mikroskopisk analys av hud, tarm och andra inre organ inklusive lever och lunga upptäckte inte någon uppenbar abnormitet hos mutanta djur (data visas inte).

för att definiera de strukturella defekterna hos mutanta djur utfördes elektronmikroskopiska analyser av aorta och hjärta. Fig. 4 visar att kollagenfibrillerna ligger mellan glatta muskelceller eller mellan glatta muskelceller och elastiska fibrer (Fig. 4A, Pilar) var frånvarande eller kraftigt reducerade i media av mutant aorta (Fig. 4B, pilar). Mest slående, i adventitia där majoriteten av kollagen är typ i, var diametern av kollagenfibriller i den mutanta aortan mycket variabel (jämför Fig. 4 D till C). När fibrillerna räknades och diametern på dessa fibriller mättes i ett givet område av adventitia fann vi att antalet fibriller i mutanter reducerades till ungefär en tredjedel av den för vildtyp medan medeldiametern för fibrillerna i mutanter var ungefär dubbelt så stor som hos vildtypsmöss (Fig. 5). I likhet med aortan reducerades eller saknades kollagenfibrillerna mellan epikardium och myokardium och mikrovilli i epikardiet underutvecklades i hjärtat av mutanta möss (data visas inte).

förutom det kardiovaskulära systemet undersöktes hud, tarm, lever och lunga hos mutanta möss genom elektronmikroskopi. Som med adventitia av aorta, kollagen i fibriller i mutant hud (Fig. 4F, pilar och pilspetsar) var oorganiserade och var mycket varierande i diameter jämfört med möss av vildtyp (Fig. 4e, pilar). Denna förändring sågs också i lever och lunga hos mutanta möss (data visas inte). Dessutom saknades eller reducerades kollagenfibriller kraftigt i submukosa och serosa i mutanta tarmar (data visas inte) vilket tyder på att kollagenfibriller i dessa områden mestadels är typ III kollagenfibriller.

tidigare studier som introducerar riktade mutationer i Col1a1 -, Col2a1 -, Col5a2-och Col9a1-gener har fört viktiga insikter i funktionen hos dessa kollagener (24-27). Här visar vi att kollagen av typ III har en kritisk roll i fibrillogenes, vilket är en viktig del av utvecklingen av sådana organ som hjärt-kärlsystemet, tarmen och huden. Brist på kollagen av typ III störd fibrillogenes och resulterade i defekt utveckling och funktionsfel hos dessa organ. Under fysiologiska förhållanden är typ III-kollagen inte bara en väsentlig komponent av fibriller i vävnader såsom media av aorta utan också ett viktigt reglerande element i typ i-kollagenfibrillogenes. Våra resultat tyder på att typ III-kollagen reglerar diametern på typ i-kollagenfibriller, som fungerar som en mekanism för att uppfylla de fysiologiska kraven hos olika vävnader eller av en vävnad i olika utvecklingsstadier. Fenotypen av typ III-kollagenbristande möss liknar de kliniska manifestationerna av Ehlers-Danlos syndrom typ IV-patienter i vilka döden är resultatet av blodkärl eller tarmbrott (20). Dessa mutanta möss bör därför visa sig vara bra djurmodeller för att förstå denna sjukdom och eventuellt testa terapeutiska metoder.