Umwandlung des widerspenstigen Pestizids Chlordecon durch Desulfovibrio sp.86 mit einem Wechsel von ringöffnender Entchlorung zu reduktiver Sulfidierungsaktivität / Wissenschaftliche Berichte

Isolierung von Desulfovibrio sp.86
Genomanalyse von Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 baut Chlordecon zu bekannten Transformationsprodukten ab sowie eine unerwartete schwefelhaltige Verbindung
Synthese des Chlordecthiol-Standards und Bestätigung, dass das Transformationsprodukt F1 identisch mit Chlordecthiol ist
Die Fähigkeit von Desulfovibrio sp.86 zum Abbau von Chlordecontransformationsprodukten
Untersuchung der Inkubationsbedingungen, die zur bakteriellen reduktiven Sulfidierung führen
Umweltrelevanz der chlordeconreduktiven Sulfidierung

Isolierung von Desulfovibrio sp.86

Isolierung von Desulfovibrio sp.86 wurde aus dem chlordeconabbauenden Konsortium 865 unter sulfatreduzierenden Bedingungen erreicht. Da Bacterial Consortium 86, das Chlordecon umwandeln kann, aus einem angereicherten Mineralmedium (MM) mit der Bezeichnung MM + 5 erhalten wurde, das mit Chlordecon ergänzt wurde, wurde die chemische Hauptzusammensetzung beibehalten, aber Elektronendonoren und -akzeptoren wurden modifiziert. Verschiedene Medienformulierungen, die zur Anreicherung sulfatreduzierender Bakterien verwendet werden, verwenden organische Säuren, z. B. Lactat, als Kohlenstoff- und Energiequellen (Elektronendonor) und Sulfat, das als Elektronenakzeptor für das Wachstum verwendet wird15,16,17,18. Dabei wurde Pyruvat im MM+ Flüssigmedium durch Lactat ersetzt und Sulfat zugegeben (MMD Flüssigmedium, siehe Abschnitt “Methoden”). Die Anreicherung wurde auf MMD-Agar ausgebreitet und die braunen vibrio-ähnlichen Bakterienkolonien (beobachtet unter optischem Mikroskop) wurden durch zwei zusätzliche Plattenstreifen weiter gereinigt (Fig. S1). Ein isolierter Bakterienstamm war identisch mit Desulfovibrio sp.86 aus dem Konsortium 86 basierend auf 100%igen Identitäten ihrer 16S rRNA-Gene (jeweils 1538 bp).

Genomanalyse von Desulfovibrio sp.86

Das gesamte Genom besteht aus einem einzigen zirkulären Chromosom mit 3.464.070 bp. Die CheckM-Analyse19, die mit 61 Genomen und 284 Abstammungslinien durchgeführt wurde, zeigt, dass das Genom zu den Deltaproteobakterien gehört und die CheckM-Vollständigkeit 100% beträgt (null essentieller Marker fehlt). Der durchschnittliche G + C-Gehalt für die DNA beträgt 58,06%. Insgesamt wurden 3.342 kodierende DNA-Sequenzen (CDSS) für das Chromosom, 4 Pseudogene und 10 verschiedene RNAs (Misc-RNA), 3 rRNA-Operone und 54 tRNA-Gene vorhergesagt.

Die drei 16S rRNA Gene von Desulfovibrio sp.86 sind identisch. Ihre besten Explosionshits (NCBI) stammten von unkultiviertem Desulfovibrio sp. klone aus mikrobiellen Brennstoffzellen wie MFC63A04 (Genbank accession number : FJ823865; coverage 98%; identity 99,87%)20. Ein phylogenetischer Baum unter Verwendung der verfügbaren 16S-rRNA kultivierbarer Bakterien bestätigte die Ähnlichkeiten zwischen Desulfovibrio sp.86 und Desulfovibrio Simplex DSM4141 (Genbank 16S rRNA accession number: NR_117110; Abdeckung 99%; Identität 99, 22%; genomische Sequenz nicht verfügbar) (Abb. S2)21. Auf genomischer Ebene ist Desulfovibrio sp.86 rangiert mit Desulfovibrio desulfuricans subsp. entschwefelung str. ATCC 27.774 Genom (GenBank: NC_011883). Desulfovibrio sp.86 teilt nur 1.408 Gene (43%) mit D. desulfuricans (über 80% Aminosäurenidentität und 80% Alignmentabdeckung). Darüber hinaus sind die durchschnittlichen Nukleotididentitäten (ANI) zwischen Desulfovibrio sp.86 und sequenzierte Desulfovibrio-Genome sind niedriger als der 95% ANI-Cut-off-Wert, der allgemein für die Speziesabgrenzung akzeptiert wird (Abb. S3)22. Diese Ergebnisse zeigen, dass Desulfovibrio sp.86 ist höchstwahrscheinlich eine neue Art des Desulfovibrio-Stammes. Das Vorhandensein von zwei Superoxiddismutasen und einem Katalase-Gen erklärt seine relative Sauerstofftoleranz. Wie erwartet, die Desulfovibrio sp.86 das Genom weist ein umfangreiches Genkomplement für den Schwefelstoffwechsel auf und umfasst die Schwefelatmungswege mit anorganischen Quellen wie Sulfat, Sulfit, Bisulfit und Tetrathionat als Elektronenakzeptoren. Organische Schwefelquellen können durch Fermentationsprodukte von Schwefelbiomasse (Sulfochinovose von Sulfochinovosyllipiden) Sulfoacetat, der Schwefel-nicht-proteogenen Aminosäure Taurin über Sulfoacetaldehyd oder Alkansulfonaten bereitgestellt werden23.

Desulfovibrio sp.86 baut Chlordecon zu bekannten Transformationsprodukten ab sowie eine unerwartete schwefelhaltige Verbindung

Die Chlordecon-abbauende Fähigkeit des isolierten Desulfovibrio sp.Der Stamm 86 wurde unter Verwendung von GC–MS- (Gaschromatographie-Massenspektrometrie) und LC-HRMS- (Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Massenspektrometrie) Techniken unter Wachstumsbedingungen untersucht, die erfolgreich für Desulfovibrio sp angewendet wurden.86 isolierung (MMD flüssiges Medium). Na2S wurde als Reduktionsmittel verwendet und eine anaerobe N2/H2 (98/2; V/V) -Atmosphäre wurde unter Verwendung eines Glove-Box-Systems aufgebracht. Diese Inkubationsbedingungen führten zu einem vollständigen Verschwinden des Chlordeconsignals in GC-MS und LC-HRMS und führten zu ähnlichen GC–MS- und LC-HRMS-TP-Profilen wie mit Citrobacter sp.866: Monohydrochlor-decone A1, Pentachlorbinden B1, Tetrachlorbinden B3-B4 und Polychlorbindencarbonsäuren C1-C2 und C3-C4 (Fig. 1a, b). Im Glove-Box-System wurden Bakterienkulturen unter Verwendung von 100-ml-Glasfläschchen mit einem hydrophoben porösen Film durchgeführt, um einen Gasaustausch zu ermöglichen und eine Kontamination zu vermeiden. Dieser Inkubationszustand wurde als “Renewed Atmosphere” -Zustand (RA) betrachtet. In diesem System wurde die Atmosphäre regelmäßig mit N 2 / H 2 (98/2; V/V) erneuert und die Box nicht thermostatisch gesteuert, so dass die Temperatur zwischen 25 und 33 ° C variierte.86 Kulturen wurden in MMD-Medium unter Verwendung von 100 ml Glasfläschchen, die mit Butylkautschuk-Septen verschlossen waren, in einem Ofen bei 30 ° C platziert. Versiegelte Fläschchen wurden zunächst mit N2 / H2 (98/2; V / V) -Gas gespült, um eine Anaerobiose zu gewährleisten. Diese Inkubationsbedingung wurde als “Confined Atmosphere” -Bedingungen (CA) betrachtet.

Nach sechswöchiger Inkubation mit Chlordecon war das Pestizid mit den gleichen Analysetechniken nicht mehr nachweisbar. Gleichzeitig erschien eine einzige unbekannte chlorierte Verbindung namens F1. Es war nur durch GC–MS (25,6 min) nachweisbar (Fig. 1c). Wie in den zuvor berichteten Chlordeconabbaukulturen5,6 trat die hauptsächliche Chlordeconumwandlung während der stationären Phase auf (Abb. 1e). Da in LC-HRMS kein sichtbarer chlorierter Peak beobachtet werden konnte (Abb. 1d) basiert die strukturelle Aufklärung von F1 auf der Interpretation von GC-MS-Daten (Abb. 1f). Unter der Annahme, dass das bei m / z 507.8 zentrierte höhere Isotopenmuster das Molekülion enthielt, stellten wir zwei mögliche neutrale Formeln für F1, C10Cl10O2H2 und C10Cl10SH2. In-Source-Fragmente waren denen in polychlorierten Bishomocuban-basierten Strukturen einschließlich Chlordecon, Hydrochlor, Chlordecol und Mirex5,6,24 sehr ähnlich. Tatsächlich sind die Isotopenmuster bei m / z 201,0, 235,9 und 271.9 entstand vermutlich aus der bekannten In-Source-Bishomocuban-Retrocyclodimerisierung und entsprach positiv geladenen C5-Fragmenten. Der Vergleich mit Isotopensimulationen beschränkte die Möglichkeit auf die folgenden Radikalionen: +· +· und +· mit n = 0,1. Die letztere bis-oxygenierte generische Formel erwies sich als höchst unwahrscheinlich, da sie die Anwesenheit einer Gem-Diol-Funktion oder einer Gem-Chlorhydrin-Einheit am Cyclopentenylring erforderte, die den harten GC-chromatographischen Bedingungen (> 200 ° C) widerstehen musste. Stattdessen schlossen wir, dass eine Schwefeleinheit, d.h. eine Thiolfunktion, war wahrscheinlich auf dem Bishomocuban-Polycyclus vorhanden. Wir haben für F1 die in Fig. 2a und schlug den Namen Chlordecthiol vor, das Schwefelanalogon von Chlordecol (Chlordeconalkohol).

Synthese des Chlordecthiol-Standards und Bestätigung, dass das Transformationsprodukt F1 identisch mit Chlordecthiol ist

Um die Struktur von F1 zu bestätigen, wurde das Standard-Chlordecthiol chemisch synthetisiert und vollständig charakterisiert. Um eine chemisch reduktive Sulfidierung von Chlordecon zu erreichen, waren zwei Schritte erforderlich. Die erste bestand in der Umwandlung der Gem-Diol-Funktion von Chlordecon im Gleichgewicht mit der entsprechenden Ketonform20,25 in das Schwefelanalogon, d. H. Gem-Thiol / Thiocarbonyl-Teil. Um diesen Schritt durchzuführen, werden im Allgemeinen phosphorhaltige Schwefelreagenzien angewendet26,27. Hier verwendeten wir Phosphordekasulfid (P4S10), auch Berzelius-Reagenz genannt27,28 gemäß dem Protokoll von Zaidi und Mitarbeitern, die Camphorthiol erfolgreich synthetisierten29 (Abb. 2a). Der zweite Schritt bestand in der Reduktion des Gem-Thiol-Intermediats mit NaBH4. Nach der Reinigung wurde ein weißer Feststoff in einer Gesamtausbeute von 73% erhalten (Fig. 2a). 1D- und 2D-NMR-Analysen bestätigten die Chlordecthiol-Struktur: (i) zwei 1H-Signale, die jeweils für ein Proton integriert und miteinander gekoppelt sind (δ 3,78 ppm, d, J = 5,5 Hz und δ 2,01 ppm, d, J = 5,5 Hz), wobei das eine bei δ 3,78 ppm mit einem nach unten verschobenen 13C-Signal korreliert (δ 55,1 ppm) im HSQC-Experiment, das die CH-Einheit neben der Thiolfunktion perfekt berücksichtigt, und (ii) insgesamt sechs sichtbare 13C-Signale, die die Symmetrieebene widerspiegeln, die in der vorliegenden Bishomocuban-Struktur konserviert ist (Abb. 2a, Fig. S19-23). Obwohl bei der mikrobiellen Transformation F1 unter den entwickelten Bedingungen nicht mit LC-HRMS nachgewiesen werden konnte, lieferte eine konzentrierte Probe des synthetischen Standards Chlordecthiol ein signifikantes Signal. Das Vorhandensein eines Schwefelatoms und die erwartete neutrale Formel C10Cl10SH2 wurden bestätigt (Abb. 2c, d), und die Rohformeln C10Cl10O2H2 wurde ausgeschlossen (Fig. 2b). Schließlich zeigte die GC-MS-Analyse die perfekte Übereinstimmung (d. H. Die gleiche Retentionszeit von 25,6 min und die gleichen In-Source-Massenspektren Abb. S6) zwischen dem synthetischen Standard und TP F1, also definitiv als Chlordecthiol. Tatsächlich ist F1 das erste Mitglied einer neuen Familie von Chlordecon-TPs, die zum ersten Mal ein Schwefelatom besitzen.

Die Fähigkeit von Desulfovibrio sp.86 zum Abbau von Chlordecontransformationsprodukten

Verbindungen A1, B1, C1-C2 und F1 repräsentativ für die vier Familien von TPs, die möglicherweise in Gegenwart von Desulfovibrio sp.86 wurden nach chemischen Protokollen synthetisiert, die zuvor berichtet wurden6 und hierin für F1 entwickelt. Jede von ihnen wurde in Gegenwart von Desulfovibrio sp.86 kulturen unter Bedingungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die reduktive Sulfidierung fördern (versiegelte Durchstechflasche; CA-Bedingungen) oder die Entchlorung mit Ringöffnung (offene Durchstechflasche; RA-Bedingungen). Eine duale GC-MS- und LC-HRMS-Überwachung aller Proben wurde durchgeführt.

Nach einmonatiger Inkubation unter CA-Bedingungen wurde 10-Monohydrochlor-decone A1 vollständig in zwei unbekannte chlorierte Verbindungen überführt und mittels GC-MS getrennt (Retentionszeiten: 24,3 min F2 und 24,5 min F3, Fig. 3, Fig. S7-S11). Sie zeigten ein identisches In-Source-Massenspektrum, das dem F1-Fragmentierungsmuster sehr ähnlich war (Abb. S8). Alle detektierten In-Source-Fragmente wiesen ein Chloratom weniger auf als ihre Analoga im F1-Massenspektrum. Die Verbindungen F2 und F3 wurden somit als Diastereomere des 10-Monohydrochlor-decthiols angenommen (Fig. 3c). Dies wurde durch die chemische Synthese der beiden 10-Monohydrochlor-Decthiol-Standards aus 10-Monohydrochlor-decon A1 nach der bisher für die Synthese von Chlordecthiol F1 angewandten Verfahrensweise bestätigt (Fig. S24-27). Diese chemischen Standards hatten die gleichen Retentionszeiten (24,3 und 24,5 min) und die gleichen Massenspektren im Vergleich zu den biologischen F2 und F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 und F1 blieben auch nach sechsmonatiger Inkubation mit Desulfovibrio sp.86 unter CA-Bedingungen.

Nach sechsmonatiger Inkubation unter RA-Bedingungen wurde Chlordecthiol F1 teilweise in 10-Monohydrochlor–decthiole F2 und F3 umgewandelt und zwei weitere unbekannte chlorierte Spezies mit GC-MS nachgewiesen, genannt F4 (Retentionszeit: 17,9 min) und F5 (Retentionszeit: 26,6 min) (Abb. 3d, Fig. S12). Keine dieser beiden Verbindungen ergab ein nachweisbares Signal in LC-HRMS. Die GC-MS-Analyse ermöglichte es, C10Cl6SH4 als Rohformel für F4 vorzuschlagen (Abb. S14) und C11Cl10SH4 für F5 (Fig. S15). Methylchlordecsulfid wurde chemisch synthetisiert und vollständig durch NMR charakterisiert (Abb. S28-31). Die perfekte Übereinstimmung von GC-Retentionszeiten und GC-Massenspektren von Methylchlordecsulfid und biologischem F5 (Abb. S13) bestätigt seine postulierte Identität. Bemerkenswert ist die Struktur von F5 (Abb. 3d) eine S-methylierte Form von F1 darstellt. Die genaue Natur von F4 bleibt zu klären (siehe SI-Ergänzungstext). Alle anderen TPs blieben unter RA-Bedingungen unverändert.

Zusammenfassend wurde A1 (unter RA-Bedingungen gebildet) ebenso wie Chlordecon reduktiv sulfidiert; Unter beiden Inkubationsbedingungen schienen Polychlorindene (B1 und C1-C2) durch Desulfovibrio sp.86, während F1 (hergestellt unter CA-Bedingungen) unter RA-Bedingungen transformiert werden konnte (Fig. 3).

Untersuchung der Inkubationsbedingungen, die zur bakteriellen reduktiven Sulfidierung führen

Untersuchung der physikalisch-chemischen oder physiologischen Parameter, die die Umwandlungswege von Chlordecon in den Kulturen von Desulfovibrio sp.86, GC-MS-Überwachung (B1- und F1-Anwesenheit als Hinweise auf RA- bzw.

Zwei schwefelhaltige anorganische Verbindungen, das Reduktionsmittel Na2S und der Elektronenakzeptor Na2SO4, waren im ursprünglichen flüssigen MMD-Medium vorhanden. Eine erste Versuchsreihe in verschlossenen Fläschchen mit Substitution von Na2S durch andere Reduktionsmittel, ob geschwefelt oder nicht, d. H. Cystein und Titan (III) citrat (TiCi), führte zu einem vergleichbaren Gehalt an Chlordecthiol F1 (Tabelle 1). Spuren von TP B1 wurden auch in allen Experimenten beobachtet, einschließlich Na2S, der Positivkontrolle (Tabelle 1).

Tabelle 1: Einfluss des Reduktionsmittels auf das Chlordecon-TP-Profil.

Eine zweite Versuchsreihe wurde unter Verwendung von Na2S als Reduktionsmittel und alternativen Elektronenakzeptoren auf Schwefelbasis in versiegelten Fläschchen durchgeführt (Tabelle 2). Die Verwendung von 90% 34S-angereichertem anorganischem Sulfat führte zu einem Chlordecthiol-Produkt mit ähnlichem 34S-Anreicherungsgrad (90% 34S-F1 / 10% F1, Abb. S16). Die GC-MS-Analyse des Kulturkopfraums ergab auch das Vorhandensein von H234S und H3C34SH (Abb. S16), was zeigt, dass Desulfovbibrio sp.86 produzierte H2S aus Sulfat. Diese Gase wurden unter CA-Bedingungen unter Verwendung von MMD-Medium im Kulturkopfraum nachgewiesen, während sie unter RA-Bedingungen, die der Handschuhfachatmosphäre entsprachen, im Kulturkopfraum fehlten (Abb. S17). Die Abwesenheit von Sulfat hemmte Desulfovibrio sp.86 Wachstum, führte jedoch zur Bildung von B1 (Tabelle 2)5. Die Umlagerung von Sulfat durch Sulfit, Bisulfit oder Thiosulfat führte in allen Fällen zur Bildung von Chlordecthiol F1.

Tabelle 2: Einfluss des Elektronenakzeptors auf Schwefelbasis auf das Chlordecon-TP-Profil.

Eine dritte Versuchsreihe mit Gläsern untersuchte den Einfluss der Art der Gasphase in Kontakt mit der Kultur. Zwischen dem RA-Zustand mit offenen Fläschchen im Handschuhfach und dem CA-Zustand mit versiegelten Fläschchen im Ofen unterschieden sich mehrere Parameter (Art und Volumen der Atmosphäre, Temperatur). Unter Verwendung eines Glassystems mit mehreren Fläschchen untersuchen wir selektiv die Wirkung der Atmosphärenerneuerung auf die Chlordeconumwandlung durch Desulfovibrio sp.86 in MMD mittel. In jedem Fall wurden offene Fläschchen mit hydrophoben porösen Filmen in Gläser gefüllt, die zunächst mit einem ausgewählten Gas gespült wurden. Alle Gläser wurden bei 30 ° C inkubiert. Einige von ihnen wurden mehrmals gespült, um das Handschuhfachsystem nachzuahmen, während andere geschlossen gehalten wurden.

Die Gläser 1-4 enthielten zwei identische offene Durchstechflaschen, gefüllt mit MMD, Chlordecon und Desulfovibrio sp.86 Inokulum und eine negative abiotische Kontrolle. Unter ihnen wurden zwei Gläser zweimal pro Woche gespült, Glas 1 mit (N2 / H2 (98/2; V / V)), Glas 2 mit N2 (Abb. 4a), während die Gläser 3 und 4 zunächst mit N2 und (N2/H2 (98/2; V/V)) jeweils ungespült gelassen wurden (Fig. 4b).

Die letzten beiden Gläser (Glas 5 und 6) enthielten drei offene Durchstechflaschen, die mit MMD, Chlordecon und Desulfovibrio sp.86, plus eine Kultur ohne Sulfat. Diese Gläser wurden zunächst mit (N2/H2 (98/2; V/V)) gespült und 2 Monate ungespült gelassen (Abb. 4c).

Parallel zu den Gläsern wurden zwei versiegelte Fläschchen mit MMD ohne Sulfat, Chlordecon und Desulfovibrio sp.86 wurden mit extemporär synthetisiertem H2S gespült (Fig. S4).

Nach zweimonatiger Inkubation bei 30 °C wurde TP B1 in Fläschchen in den gespülten Gläsern 1 und 2 nachgewiesen (Tabelle 3a), während TP F1 nur in Fläschchen in den nicht gespülten Gläsern 3 und 4 gefunden wurde (Tabelle 3b). In den abiotischen Kontrollen waren keine TP vorhanden. In den Gläsern 5 und 6 war F1 sowohl in Sulfat als auch in sulfatfreiem Desulfovibrio sp.86 offene Kulturen (Tabelle 3c). In gleicher Weise Desulfovibrio sp.86 sulfatfreie Kulturen, die mit H2S gespült wurden, zeigten signifikante Konzentrationen von F1 TP, während in der Negativkontrolle keine Transformation beobachtet wurde (Tabelle 3d).

Tabelle 3: Einfluss der Gasatmosphäre auf das Chlordecon-TP-Profil.

Ein zusätzliches chemisches Experiment wurde durchgeführt, um den Einfluss von H2S auf die Chlordecontransformation zu untersuchen. Es wurde ein klassisches chemisches Protokoll angewendet, das die Bildung von B- und C-TPs ermöglicht (Chlordecon, Titancitrat, Vitamin B12, Wasser). Unter N2-Atmosphäre wurden B- und C-TPs erhalten, unter H2S-Atmosphäre jedoch nur A1 (Abb. S18).

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Bildung von Chlordecthiol F1 ein geschlossenes Inkubationssystem mit reduzierender Atmosphäre erfordert. H2 als anfängliche Gasatmosphäre ist jedoch nicht obligatorisch, während die Anwesenheit von H2S erforderlich ist. Chemisch verhindert das Vorhandensein von H2S den ringöffnenden Entchlorungsprozess.

Umweltrelevanz der chlordeconreduktiven Sulfidierung

Wir haben unsere frühere Sammlung der mit Chlordecon kontaminierten Umweltproben der Insel Martinique (acht Böden und Zweibettsedimente), in denen verschiedene Konzentrationen von Chlordecon-TPs gemeldet wurden, erneut untersucht6. Unter den neuartigen schwefelhaltigen TPs, die hier berichtet wurden, fanden wir nennenswerte Konzentrationen von F1 in den beiden Bettsedimentproben (927 und 928) bei einer Konzentration, die auf 50 µg / kg bzw. 20 µg / kg nasses Sediment geschätzt wurde (Tabelle S1). Parallel dazu wurden Daten zur Bakterienpopulationsdiversität aus der Metabarcoding-Analyse dieser Proben (Abb. 5, Fig. S5) wurden verarbeitet, um ein hierarchisches Clustering von Umweltproben gemäß ihrer taxonomischen Zusammensetzung6 wiederherzustellen. Es wurde festgestellt, dass sulfatreduzierende Bakterien in Bettsedimenten viel stärker vorhanden waren als in den anderen Kompartimenten, wie zuvor berichtet wurde30,31,32.

Transformation des widerspenstigen Pestizids Chlordecon durch Desulfovibrio sp.86 mit Umschaltung von ringöffnender Entchlorung auf reduktive Sulfidierungsaktivität