Typ-III-Kollagen ist entscheidend für die Kollagen-I-Fibrillogenese und für die normale kardiovaskuläre Entwicklung

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

ES (J-1) -Zellen (22) wurden mit einem Targetingvektor transfiziert, der ein genomisches DNA-Fragment des Col3a1-Gens enthielt, in dem die Promotorregion des Gens und das erste Exon, das für das Signalpeptid kodiert, deletiert wurden (Abb. 1A). Gezielte ES-Zellklone wurden durch Southern-Blot-Analyse identifiziert und zur Blastozysteninjektion verwendet (Abb. 1B oben). Mutierte Mäuse wurden von zwei unabhängig voneinander zielgerichteten ES-Zellklonen abgeleitet und durch Southern-Blot-Analyse identifiziert (Abb. 1B tiefer). Die Proteinanalyse von Schwanz- und Hautkollagen zeigte, dass heterozygote mutierte Mäuse eine etwa 50% ige Reduktion von Typ-III-Kollagen aufweisen, während bei homozygoten mutierten Tieren kein Typ-III-Kollagen nachgewiesen wurde (Abb. 1C).

Mutierte Tiere waren fruchtbar, aber nur heterozygote Mäuse waren phänotypisch normal. Homozygote mutierte Mäuse zeigten im Entwöhnungsalter eine durchschnittliche Überlebensrate von 5%, wobei die meisten Todesfälle innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Geburt auftraten (Tabelle 1). Die genaue Ursache der neonatalen Letalität ist nicht klar, da die toten Welpen kannibalisiert wurden, bevor sie untersucht werden konnten, und die lichtmikroskopische histologische Analyse von lebenden homozygoten neugeborenen Mutanten keine grobe Anomalie feststellte. Adulte homozygote mutierte Mäuse schienen normal zu sein, außer dass sie etwa 15% kleiner waren als ihre Wildtyp-Wurfgeschwister desselben Geschlechts (Daten nicht gezeigt). Die durchschnittliche Lebensdauer der homozygoten mutierten Mäuse betrug jedoch etwa 6 Monate oder ein Fünftel der normalen Lebensdauer. Die Autopsie zeigte, dass die Blutgefäßruptur die Hauptursache für die verkürzte Lebensdauer dieser Mäuse war (Tabelle 2). Die Bruchstellen waren sporadisch und meist mit großen Blutgefäßen verbunden. Histochemische Analyse wurde durchgeführt, um den Defekt zu finden, der die Zerbrechlichkeit der Blutgefäßwand verursachte. Abb. 2A und B zeigen einen Querschnitt durch die normale Bauchaorta. Die Wand der Aorta besteht aus Intima und Media (Abb. 2A, Pfeil) und Adventitia (Fig. 2A und B, Pfeilspitzen). Das Medium besteht aus elastischen Fasern (Abb. 2B, große Pfeile) und glatte Muskelzellen (Fig. 2B, kleine Pfeile) und sorgt für die Elastizität der Aorta, während die Adventitia hauptsächlich Typ-I-Kollagenfibrillen umfasst und die Dilatation der Aorta begrenzt. Abb. 2C zeigt einen Querschnitt eines sezierenden Aneurysmas der Bauchaorta einer homozygoten mutierten Maus. Der Bruch kreuzte die Medien (Pfeil), was zu einem blutgefüllten Kanal (Stern) zwischen Medien und Adventitia (Pfeilspitzen) führte und das Lumen der Aorta teilweise zusammenbrach. Die Adventitia brach schließlich an anderer Stelle und Blut trat in die Bauchhöhle aus, wie dies bei Menschen mit tödlichem Aortenaneurysma der Fall ist (20). Die Gesamtanordnung der elastischen Fasern und der glatten Muskelzellen (Fig. 2D) war ähnlich wie bei den Steuerungen (Fig. 2B). Die Intensität und Verteilung des extrazellulären Matrixmaterials und die dunklere Färbung in der Adventitia und zwischen elastischen Fasern und glatten Muskelzellen in der Intima mutierter Mäuse (Abb. 2D) waren vergleichbar mit Wildtyp-Kontrollen (Abb. 2B). Keine offensichtlichen Defekte des Herzens und der mittelgroßen und kleinen Arterien in den Mutantentieren wurden unter dem Lichtmikroskop beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Zusätzlich zum Aneurysma zeigten mutierte Mäuse häufige Darmvergrößerungen und gelegentliche Darmrupturen, die zum Tod führten (Tabelle 2). Etwa 60% der homozygoten mutierten Mäuse wiesen Hautläsionen auf, von denen die schwerste als offene Wunde von ≈ 1 cm Länge im Schulterbereich auftrat, die vollständig in die Haut eindrang und subdermales Gewebe freilegte (Abb. 3). Die Wunden waren nicht auf Kämpfe zwischen Tieren zurückzuführen, da sie bei getrennt eingesperrten Tieren beobachtet wurden. Die lichtmikroskopische Analyse von Haut, Darm und anderen inneren Organen, einschließlich Leber und Lunge, ergab keine offensichtliche Anomalie bei mutierten Tieren (Daten nicht gezeigt).

Um die strukturellen Defekte bei mutierten Tieren zu definieren, wurden elektronenmikroskopische Analysen von Aorta und Herz durchgeführt. Abb. 4 zeigt, dass sich die Kollagenfibrillen zwischen glatten Muskelzellen bzw. zwischen glatten Muskelzellen und elastischen Fasern (Fig. 4A, Pfeile) fehlten oder waren in den Medien der mutierten Aorta stark reduziert (Fig. 4B, Pfeile). Am auffälligsten war in der Adventitia, wo der Großteil des Kollagens Typ I ist, der Durchmesser der Kollagenfibrillen der mutierten Aorta sehr variabel (vergleiche Abb. 4 D bis C). Wenn die Fibrillen gezählt und der Durchmesser dieser Fibrillen in einem bestimmten Bereich der Adventitia gemessen wurden, fanden wir, dass die Anzahl der Fibrillen in Mutanten auf ungefähr ein Drittel der Wildtyp-Anzahl reduziert wurde, während der mittlere Durchmesser der Fibrillen in Mutanten ungefähr doppelt so groß war wie bei Wildtyp-Mäusen (Abb. 5). Ähnlich wie bei der Aorta waren die Kollagenfibrillen zwischen Epikard und Myokard reduziert oder fehlten und die Mikrovilli des Epikards waren im Herzen von mutierten Mäusen unterentwickelt (Daten nicht gezeigt).

Neben dem Herz-Kreislauf-System wurden Haut, Darm, Leber und Lunge von mutierten Mäusen elektronenmikroskopisch untersucht. Wie bei der Adventitia der Aorta sind die Kollagen-I-Fibrillen in der mutierten Haut (Abb. 4F, Pfeile und Pfeilspitzen) waren unorganisiert und im Durchmesser im Vergleich zu denen von Wildtyp-Mäusen (Abb. 4E, Pfeile). Diese Veränderung wurde auch in Leber und Lunge von mutierten Mäusen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus fehlten oder waren Kollagenfibrillen in der Submukosa und Serosa von mutierten Därmen stark reduziert (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass Kollagenfibrillen in diesen Bereichen meist Typ-III-Kollagenfibrillen sind.

Frühere Studien, in denen gezielte Mutationen in Col1a1-, Col2a1-, Col5a2- und Col9a1-Gene eingeführt wurden, haben wichtige Erkenntnisse über die Funktion dieser Kollagene gebracht (24-27). Hier zeigen wir, dass Kollagen vom Typ III eine entscheidende Rolle bei der Fibrillogenese spielt, die ein wichtiger Bestandteil der Entwicklung von Organen wie Herz-Kreislauf-System, Darm und Haut ist. Der Mangel an Typ-III-Kollagen störte die Fibrillogenese und führte zu einer fehlerhaften Entwicklung und einem funktionellen Versagen dieser Organe. Unter physiologischen Bedingungen ist Typ-III-Kollagen nicht nur ein wesentlicher Bestandteil von Fibrillen in Geweben wie den Medien der Aorta, sondern auch ein wichtiges regulatorisches Element in der Typ-I-Kollagen-Fibrillogenese. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Typ-III-Kollagen den Durchmesser von Typ-I-Kollagenfibrillen reguliert, was als Mechanismus dient, um die physiologischen Anforderungen verschiedener Gewebe oder eines Gewebes in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erfüllen. Der Phänotyp von Mäusen mit Kollagenmangel vom Typ III ähnelt stark den klinischen Manifestationen von Patienten mit Ehlers-Danlos-Syndrom vom Typ IV, bei denen der Tod durch Blutgefäß- oder Darmruptur verursacht wird (20). Diese mutierten Mäuse sollten sich daher als gute Tiermodelle erweisen, um diese Krankheit zu verstehen und möglicherweise therapeutische Ansätze zu testen.