Vergleichende Genomik von Clostridium bolteae und Clostridium clostridioforme zeigt artspezifische genomische Eigenschaften und zahlreiche mutmaßliche Antibiotika-Resistenz-Determinanten

Allgemeine Merkmale von Genomen zeigen Intra- und Interspezies-Variationen

Insgesamt 1 bis 21 contigs wurden aus der Montage von liest von Illumina (134 bis 185-fache Abdeckung) für die sechs Stämme von C erzeugt. bolteae (Tabelle 1). Für die sechs Stämme von C. clostridioforme wurden insgesamt 10 bis 48 Contigs erzeugt (82 bis 264-fache Bedeckung). Die Gesamtgenomgröße variierte zwischen Arten und Stämmen. Die Größe von C. bolteae reichte von 6159 kb für Stamm 90A7 bis 6480 kb für Stamm 90B3 mit 5833 bzw. 6059 DNA-kodierenden Sequenzen (CDSs) und vier 16S-rRNA-Genen. Die Genomgröße von C. clostridioforme war kleiner, von 5467 kb für Stamm 90A3 bis 5970 kb für Stamm 90A6 mit jeweils 5231 bis 5916 CDSs und vier 16S rRNA-Genen. Der auf den 16S-rRNA-Sequenzen basierende phylogenetische Baum zeigte, dass die untersuchten C. bolteae und C. clostridioforme eng mit C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum und C. symbiosum verwandt waren, Mitglieder des Clostridium-Clusters XIVa von Firmicutes, wie zuvor berichtet (Daten nicht gezeigt).

Genome von C. bolteae und C. clostridioforme sind große Genome, bei denen genetische Redundanz vorherrscht (Daten nicht gezeigt). Die redundanten Gene waren an einer Vielzahl von Stoffwechselwegen beteiligt, darunter Kohlenstoffstoffwechsel, Transport, Eisenstoffwechsel und Aminosäurebiosynthese. Die Unterschiede in der Anzahl der CDSS zwischen den Genomen spiegelten die Variation der genetischen Redundanz mehr wider als den Gewinn oder Verlust bestimmter Funktionen. Darüber hinaus integrierten Genome mobile Elemente, d. H. Transposons, Insertionssequenzen, Plasmide oder Phagen (Integrase, Kapsidprotein, …), die auf laterale Gentransfers hinweisen. Einige von ihnen trugen antimikrobielle Resistenzgene (siehe unten).

Um das Pangenom der beiden Arten zu untersuchen, verglichen wir die 97.210 CDSs, die aus den 12 neu sequenzierten Genomen gewonnen wurden, mit denen von fünf anderen Genomen (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1 und C. clostridioforme WAL-7855). Alle CDSS wurden unter Verwendung des BlastClust-Algorithmus mit hoher Stringenz über einem Sequenzidentitätsgrenzwert von 90% und einer Längenüberlappung von 90% gruppiert. Insgesamt wurden 10.530 Cluster gefunden. Nur 2294 (21,78 %) Cluster wurden von den beiden Arten geteilt.

Indem wir nur neu sequenzierte Genome verwendeten, schätzten wir das (Spezies-) Kerngenom und die (stammspezifischen) Gene der sechs C. bolteae und der sechs C. clostridioforme (Tabelle 1). Insgesamt 3714 Gene bildeten das Kerngenom von C. bolteae. Die Anzahl der stammspezifischen Gene in dieser Spezies variierte von 73 bis 846. In C. clostridioforme definierten 3660 Gene das Kerngenom. Insgesamt 2409 Cluster wurden von den beiden Arten geteilt; 1305 Gene waren spezifisch für C. bolteae und 1251 für C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 und 90B8 hatten die größte Anzahl einzigartiger Gene für diese Art (735 bzw. 846). C. clostridioforme 90A8 hatte mit 1006 (17 %) einzigartigen Genen die größte Anzahl stammspezifischer Gene in dieser Studie. Diese Stämme integrierten eine hohe Anzahl von mobilen Elementen. Einige einzigartige CDSs wurden als Transporter oder Regulatoren bezeichnet. Nur wenige von ihnen waren an Abwehrmechanismen beteiligt (antimikrobielle Resistenzgene..) oder Stoffwechselwege. Die meisten von ihnen, oft umgeben von CDSs aus Phagen oder Transposons, hatten unbekannte Funktionen (Daten nicht gezeigt).

Funktionelle Unterschiede zwischen den Arten in den Kerngenomen

Die Herausforderung unserer Studie bestand darin, zuverlässige Informationen aus den Kerngenomen bereitzustellen. Daher haben wir unsere Analyse auf die Kerngenome konzentriert. Die Klassifizierung der CDSs nach dem Clusters of Orthologous Groups (COGs) -System ermöglichte einen Überblick über die Funktionen der beiden Arten. Die Kerngenome von C. bolteae und C. Clostridioforme wurden in den COG-Kategorien K, E, G und R in Bezug auf Transkription (309 und 290 CDSs), Aminosäuretransport und Metabolismus (335 und 276 CDSs), Kohlenhydrattransport und -metabolismus (431 und 425 CDSs) und allgemeine Funktionsvorhersage (366 und 331CDSs) angereichert (über 7% der gesamten COG-Übereinstimmungszahlen) (Tabelle 2).

Während C. bolteae und C. clostridioforme sind phänotypisch verwandt, das Funktionsmuster, das durch Änderung der COG-Annotation erhalten wird, unterschied sich zwischen den beiden Arten (Tabelle 2). 30 zusätzliche CDSs der Nukleotidtransport- und Metabolismuskategorien (F), 97 CDSs der Aminosäuretransport- und Metabolismuskategorien (E) und 79 CDSs, die für Signaltransduktionsmechanismen (T) kodieren, waren spezifisch für C. bolteae. 40 CDSs, die für die Zellwand- / Membran- / Hüllbiogenese (M) kodieren, 50 CDSs für Replikation, Rekombination und Reparatur (L) und 18 CDSs für die Kategorien Lipidtransport und Metabolismus (I) waren spezifisch für C. clostridioforme. Die Unterschiede zwischen den Stoffwechselwegen in C. clostridioforme und C. bolteae scheinen groß genug zu sein, um die Abgrenzung der Arten zu unterstützen.

C. bolteae und C. clostridioforme beherbergten unter den Kohlenhydratwegen unterschiedliche Systeme zur Assimilation von Lactose, die sich in ihren Phosphorylierungszuständen, Zwischenmetaboliten und Bioenergetik unterscheiden (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Gene, die für eine β-Galactosidase kodieren, die Lactose hydrolysiert und Glucose und Galactose liefert, wurden in beiden Spezies gefunden. Ein alternativer Lactose-Abbauweg, das Lactose / Cellobiose-abhängige Phosphotransferase-System (lac / cell-PTS), wurde in fast allen Genomen von C. bolteae gefunden. Das zuvor in C. acetobutylicum beschriebene Operon lac/cell-PTS besteht aus Genen für die transkriptionellen Antiterminatoren 6-Phospho-β-Galactosidase, Phosphoglyceratmutase und Lichenan-Operon sowie aus zwei Kopien von Genen für die Lactose/Cellobiose-Familie IIC, IIB und IIA. Durch ein solches System wird Lactose am C-6-Kohlenstoff phosphoryliert und das internalisierte Lactose-6-phosphat in Galactose-6-phosphat und Glucose durch die 6-phospho-β-galactosidase abgebaut. Außerdem fehlten in C. bolteae 90A7 das Gen für die 6-phospho-β-galactosidase und die Gene für die Lactose/Cellobiose-Familienkomponenten. Es ist wahrscheinlich, dass dieses System, das durch Cellobiose oder Laktose induzierbar und durch mehrere Repressoren (beschrieben in anderen grampositiven Bakterien ) reguliert wird, den laktosenegativen Phänotyp in C. bolteae ausmacht . Mit Hilfe unseres Annotationssystems konnten wir einen Galactose-Operon-Repressor (GalR) unter den Regulatoren der lacI-Familie in C. clostridioforme (alle, außer 90A8), aber nicht in C. bolteae nachweisen. Laborexperimente sind erforderlich, um zu bestimmen, wie die Transkriptionsfaktoren der beiden Spezies Präferenzen bei der Verwendung bestimmter Kohlenhydrate gegenüber anderen vermitteln.

Weitere Unterscheidungsmerkmale zwischen den beiden Spezies waren CDSs, die für die Biosynthese, den Transport und den Katabolismus von Sekundärmetaboliten kodieren, die nur in C. bolteae gefunden wurden (Tabelle 2).

Interessanterweise war die Anzahl der Gene der Zellmotilitäts- und Sekretionskategorie (N) (34 und 18 CDSs) zwischen den beiden Spezies unterschiedlich. Unter ihnen fanden wir CDSs, die die Flagellenmotilität kodieren und als essentielle Virulenzfaktoren für die meisten beweglichen Pathogene anerkannt sind. Insgesamt repräsentierten vierundzwanzig Gene (46 Cluster + 3 Waisen) das Flagellenoperon in den Genomen von C. bolteae. Unter ihnen zeigten Gene für Flagellin (fliC) und Flagellar Cap (fliD), eines der multiplen Zelloberflächenadhäsine der Bakterien, Clusterspezifität und Mikroevolution. Gene, die für fliD kodieren, wurden durch einen Cluster und zwei zusätzliche Gene in C. bolteae 90A7 und 90B8 dargestellt. FliC-Sequenzen aus C. bolteae 90A9, 90B3 und 90B8 bildeten einen Cluster, diejenigen aus 90A5 und 90B7 gruppierten sich in einer anderen Gruppe, und Sequenzen aus C. bolteae 90A7 blieben nach dem Clustering Waisen (einzigartige Gene) (Abb. 1). Sie waren eng verwandt mit Flagellinsequenzen von C. citroniae und C. hathewayi, anderen Clostridium spp. der Gruppe XIVa, isoliert gelegentlich von menschlichen Infektionen. Darüber hinaus C. bolteae 90A9 und 90B3 teilten sich ein zweites Operon von nur 19 Genen in der Synthese, einschließlich eines Flagellingens (flaA), das eng mit denen von C. clostridioforme verwandt ist (63% Identität). Basierend auf konservierten Resten L87, Q88, R89 und Q96, die für die TLR5-Signalgebung und die Flagellinpolymerisation entscheidend sind, wurde vorhergesagt, dass diese Proteine proinflammatorische Eigenschaften haben . In C. clostridioforme kodierten zwanzig Gene (57 andere Cluster), die in einem einzigen Operon organisiert waren, den Flagellenapparat. FlaA-Sequenzen von C. clostridioforme gehörte zu einer phylogenetischen Gruppe, die eng mit Flagellinsequenzen aus Eubacterium cellulosovens verwandt war, die aus dem Pansen isoliert wurden. Insgesamt Flagellin Gene und Loci-Organisation im Zusammenhang mit Flagellen waren unterschiedlich zwischen den Arten (Zusätzliche Datei 2: Tabelle S2 und Zusätzliche Datei 3: Tabelle S3), was darauf hindeutet, dass Motilität, Chemotaxis und Auftreten von möglichen Wechselwirkungen mit der Dickdarmschleimhaut sind artenspezifisch .

Entfernungsbasierter phylogenetischer Baum von Flagellingenen. Die Werte an Knoten entsprachen Bootstrap-Prozentsätzen, die aus phylogenetischen Bäumen basierend auf mehreren Sequenzausrichtungen von ClustalW , Tcoffee bzw. Gennamen und, Orphan- oder Clusternummern wurden angegeben

Artenunterschiede in den Wegen für die Butyratsynthese

Ein Vergleich der gesamten Genomsequenzen ergab, dass Wege für die Butyratsynthese, die eine Schlüsselrolle für die Gesundheit des Dickdarms beim Menschen spielen, in C. bolteae und C. clostridioforme vorhanden waren.

Die beiden Arten waren Butyratproduzenten auf unterschiedliche und komplementäre Weise (Abb. 2, Zusatzdatei 4: Tabelle S4). Alle C. clostridioforme, außer 90A8, trugen einen Locus, der für den Acetyl-CoA-Weg (von Acetyl-CoA zu Butyryl-CoA) kodierte, einschließlich Gene für die Beta-hydroxylbutyrylCoA-Dehydrogenase (hbd), Thiolase (thl), Crotonase (cro), Butyryl-CoA-Dehydrogenase (bcd) und zwei Elektronentransferproteine (ETF alpha, ETF beta) (Zusätzliche Datei 4: Tabelle S4). Nur C. bolteae 90A8 und C. clostridioforme 2149FAA.1 enthielt eine weitere mutmaßliche bcd (74.9 % Identität) in ihren Genomen (Daten nicht gezeigt). Die Lokuszusammensetzung und -anordnung ähnelte der von Faecalibacterium prausnitzii, einem wichtigen Butyratproduzenten des menschlichen Dickdarms . Der Acetyl-CoA-Weg wurde in C. bolteae nicht gefunden. Beide Spezies teilten Gene für die beiden Hydroxy-Glutaryl-CoA-Dehydrogenase (HgCoAd) und die Glutaconyl-CoA-Decarboxylase (Gcd) aus dem Glutarat-Weg, die über BCD-Gene zu Crotonyl-CoA und zu Butyryl-CoA führen können.

Verschiedene Wege für die Butyratsynthese, die möglicherweise in Genomen von C. clostridioforme und C. bolteae vorhanden sind. In durchgezogenen Linien : gefunden in C. bolteae und C. clostridioforme; In fetten gestrichelten Linien : nur gefunden in C. clostridioforme ; In feinen gestrichelten Linien : nur gefunden in C. bolteae 90A5 und 90B7 (weitere Einzelheiten siehe Zusätzliche Datei 4: Tabelle S4). Gene (Proteinnamen) werden angezeigt. Ato, Acetyl-coa-Acetyltransferase ; Bcd, Butyryl-CoA-Deshydrogenase; Buk, Butyratkinase; Aber, Butyrat-Acetoacetat-CoA-Transferase; Cro, Crotonase ; Etf, Elektronentransferprotein; Gcd, Glutaconyl-coa-Decarboxylase; Hbd, Acetoacetyl-coa-Reduktase; 4Hbt, 4-Hydroxybutyrat-COA-Transferase; HgCoAd, 3-Hydroxybutyryl-coa-Dehydrogenase; Ptb, Phosphatbutyryltranferase; Thl, Thiolase

Die endgültige Umwandlung von Butyryl-CoA in Butyrat kann durch die in beiden Spezies vorhandene Butyratkinase (buk) und die Phosphotransbutyrylase (ptb) erfolgen (Zusatzdatei 4: Tabelle S4). Die Gruppe der Buk-Sequenzen aus C. clostridioforme verzweigte sich in der Nähe der Buk-Sequenz aus C. citroniae auf dem Stammbaum (Zusätzliche Datei 5: Abbildung S1). Buk-Sequenzen aus C. bolteae bildeten unterschiedliche monophyletische Gruppen und Sequenzen, die unter den phylogenetischen Bäumen verteilt waren, was auf Polymorphismus und / oder funktionelle Variationen des Enzyms in dieser Spezies hindeutet. Andere Gene für Transferasen aus dem Lysinweg (Ato—alpha— und Beta-Untereinheit ; But-Acetat-CoA-Transferase), die in der Nähe des Butyratlocus in sechs Genomen von C. clostridioforme nachgewiesen wurden, können als letzte Enzyme beteiligt sein. Gene aus dem 4-Aminobutyrat-Weg (4hbt) können eine weitere Alternative für den terminalen Schritt in C sein. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 und BAA613 .

Die Butyryl-CoA:Acetat-CoA-Transferase (but) des Acetyl-CoA-Signalwegs, der letzte Schritt in der Butyratproduktion, der in Clostridium XIVa vorherrscht, wurde weder in den Common Core-Genomen noch in den Genomen des untersuchten C. bolteae gefunden . Im menschlichen Darm haben frühere Studien an Kolonisolaten gesunder Personen gezeigt, dass der Butan überwiegt . Weitere Studien sind erforderlich, um die Auswirkungen der Butyratproduktion über den Glutarat-Signalweg auf die Gesundheit von Dickdarmzellen, insbesondere bei Autismus-Spektrum-C, zu bewerten. bolteae ist überreichlich .

Identifizierung von Antibiotikaresistenzdeterminanten

Arzneimittelresistenzgene, die nicht durch automatisierte Annotation erkannt wurden, wurden durch Homologiesequenzforschung an ARDB identifiziert. Resistenzgene wurden auf einem Wert bis zu 40 % Identität (50 % der positiven Substitutionen) auf 70 % der Länge über dem üblicherweise empfohlenen Cut-off-Wert vorhergesagt (siehe Liste in Tabelle 3). Anschließend wurden der Gengehalt und die genetische Organisation der mikrobiellen Resistenzloci der sechs C. bolteae und der sechs C. clostridioforme mit früheren Daten aus C verglichen. clostridioforme CM201.1 in unserem Labor.

Da sequenzbasierte Vorhersagen möglicherweise Determinanten identifizieren könnten, die nicht zu einer Antibiotikaresistenz führen, wurden Empfindlichkeitstests durchgeführt, um Informationen über die vorhergesagte Reaktion von Bakterien auf Antibiotika zu erhalten. Die in diese Studie einbezogenen Stämme zeigten Resistenzmuster, einschließlich Ampicillin, Makrolide, Lincomycin und Chinolone, die heute bei Anaerobiern üblich sind (Tabelle 4). Sowohl genomische Daten (CDSS und Annotationen) als auch phänotypische Empfindlichkeitstests wurden in Betracht gezogen, um Determinanten der Antibiotikaresistenz zu identifizieren (Tabellen 3 und 4). Vorläufige Assays zur Klonierung bestimmter Gene wurden ebenfalls durchgeführt, um ihre Fähigkeit zur Übertragung von Antibiotikaresistenzen zu überprüfen (siehe unten).

Resistenzgene gegen Antibiotika zur Behandlung anaerober Infektionen

Insgesamt wurden 76 Cluster und 21 stammspezifische Gene identifiziert, die potenziell an der antimikrobiellen Resistenz beteiligt sind (Tabelle 3). Es ist von 42 bis 50 CDSs in C. bolteae und 48 bis 58 CDSs in C. clostridioforme enthalten. 27 bis 42 CDSS pro Genom standen im Zusammenhang mit Arzneimittelresistenzmechanismen gegen Beta-Lactame, Glycopeptide, Makrolide, Lincosamide und Metronidazol.

Sieben Cluster, die an der Beta-Lactam-Resistenz beteiligt sind, teilen sich oder sind Teil des Kerngenoms der beiden Spezies (Abb. 3). Drei Arten von Beta-Lactamasen, einschließlich Beta-Lactamase der Klasse A, Beta-Lactamase der Klasse C, Beta-Lactamase der Klasse D und mehrere Metallo-Enzyme wurden in den zwölf Genomen erkannt. Alle untersuchten Stämme, die aufgrund ihrer Resistenz gegen Ampicillin ausgewählt wurden, teilten das Gen blaCLO1, das zuvor in C. clostridioforme CM201.1 (unveröffentlicht) gefunden wurde, aber die Struktur des in CM201.1 beobachteten integrativen konjugativen Elements (ICE) wurde in den neuen sequenzierten Genomen nicht gefunden. Das Gen blaCLO1 verleiht Resistenz gegen Aminopenicilline und Carboxypenicilline in E. coli, und seine Aktivität wird durch Clavulanat und Sulbactam gehemmt. Neun Aminosäureveränderungen wurden in Beta-Lactamasen von C. bolteae 90A9, 90B3 und 90A8 beobachtet. Diese eng verwandte Beta-Lactamase wurde flankiert von Insertionssequenzen (IS66) und einem mutmaßlichen Gen für Beta-Lactamase der Klasse D (COG 2602), das ebenfalls in Clostridium sp M62/1 aus der menschlichen Darmflora (HMP-Projekt) beschrieben wurde. Gene für Beta-Lactamasen der Klasse C, die zuvor in den Chromosomen enterischer Bakterien (COG2680) gefunden wurden, waren ebenfalls in C vorhanden. bolteae und C. clostridioforme.

Verteilung von Antibiotikaresistenzgenen zwischen und innerhalb des Kerns von C. bolteae und C. clostridioforme. Gene, die mindestens 90 % Länge und 90 % Ähnlichkeit überlappen, wurden als Homologe betrachtet. Resistenzgene wurden auf einem Wert von bis zu 40% Identität (50% der positiven Substitutionen) auf 70% der Länge durch Homologiesequenzforschung an ARDB vorhergesagt. Für alle C. clostridioforme und einige C. bolteae 23S rRNA Methyltransferase Cfr-ähnlich

Eine hohe Anzahl vorhergesagter Gene (32 CDSS) war an der Resistenz gegen Glycopeptide beteiligt (Zusätzliche Datei 6: Abbildung S2). C. clostridioforme 90A8 war der Einzelstamm mit allen für die Glykopeptidresistenz erforderlichen Genen in Übereinstimmung mit dem Phänotyp (MHK > 256 mg/l). Die Vancomycinresistenz in diesem Stamm wurde einem Operon vom VanB-Typ zugeschrieben, das von einem Tn1549-ähnlichen Element getragen wurde. Leider führt eine Deletion von zehn Nukleotiden innerhalb des Relaxase-Gens von Tn1549 dazu, dass 90A8 in vitro keine Vancomycin-Resistenz übertragen kann . Die anderen Genome von C. clostridioforme enthielten einen Teil des Vancomycin-Resistenz-Operons vom VanD-Typ, aber das D-Ala-Lac-Ligase-vanD-Gen wurde durch ein Stop-Codon gestört, das zu einem verkürzten Protein führte (Zusätzliche Datei 6: Abbildung S2). Außerdem fehlten vanH und vanY, die für eine D-Lactatdehydrogenase bzw. eine DD-Carboxypeptidase kodieren. In ähnlicher Weise sind die Genome von C. bolteae beherbergte vier CDSS, Homolog von vanRG vanUG vanG vanYG, die aufgrund des Fehlens eines Serinracemase-Gens ein unvollständiges und nicht funktionelles Operon bildeten. Die hohe Anzahl von CDSs, die für die Glykopeptidresistenz kodieren (einschließlich vanD oder vanG, von denen bekannt ist, dass sie chromosomal und nicht übertragbar sind), die in den Genomen von C. bolteae und C. clostridioforme gefunden wurden, deutet darauf hin, dass sie Teil der gesamten Operone der Vorfahren sind, die sich in Abwesenheit von Antibiotika entwickelt haben selektiver Druck . Das Vorhandensein eines unvollständigen van-Operons ist faszinierend, aber ähnliche Beobachtungen bei anderen Anaerobiern, die in Mikrobiomen wie Clostridium difficile 630 oder Ruminococcus spp., wurden berichtet .

Homologe zum Adenylyltransferase-Gen, die eine Resistenz gegen die Lincosamide verleihen, waren im Kerngenom beider Spezies vorhanden (Abb. 3). LnuA-Gene von C. clostridioforme und C. bolteae hatten 70 bis 72 % Identität mit Orthologen, die in C. hathewayi und C. citroniae gefunden wurden. C. clostridioforme 90B1 und 90A6 enthielten ein zusätzliches lnu-Gen (68 % Identität mit LnuA90A5), ohne Spuren von mobilen Elementen. Lincomycinresistenz tritt häufig bei C. bolteae und C. clostridioforme auf und ist häufig mit einer Resistenz gegen Clindamycin verbunden. LnuA-Proteine der beiden Spezies zeigten 51 bis 54% der Identität mit LnuA von Staphylococcus, was auf eine gemeinsame Funktionalität hindeutet, aber die Rolle von LNU-Genen ist aufgrund des Vorhandenseins anderer mutmaßlicher Mechanismen schwer festzustellen . In ähnlicher Weise waren alle Stämme resistent gegen Erythromycin, während zwei Gene, die homolog zum Erythromycin-Ribosomen-Methylase-Gen, ermB, waren nur in den Genomen von C. clostridioforme 90A4 und 90A8. Eine Überexpression von Multidrug-Effluxpumpen und Makrolid- und verschiedenen Makrolid-Lincosamid-Streptogramin B—spezifischen Effluxsystemen wie MacB, MefA, VgaA, MsrA / MsrB und CcmA (Tabelle 3, Zusätzliche Datei 7: Abbildung S3), die in den untersuchten Genomen gefunden wurden, kann zu Makrolid- und Lincosamidresistenz führen . Zusätzlich wurden zwei Cluster von CDSs, die für xenobiotische Acetyltransferasen im Zusammenhang mit VatB kodieren (48 % Identität), in den Kerngenomen jeder der Spezies gefunden (Abb. 3). VatB inaktiviert Virginiamycin , aber hier wurde die Resistenz durch antimikrobielle Empfindlichkeitstests nicht nachgewiesen (Tabelle 4).

In den Kerngenomen beider Arten wurde ein Cluster von CDSs-Homologen zu den Metronidazol-Resistenzgenen (nim) nachgewiesen, und Metronidazol war bei den untersuchten Arten sehr aktiv . In Bacteroides fragilis wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression von nim-Genen stromabwärts von IS-Elementen zu einer Metronidazol-Resistenz führt . In Ermangelung von IS direkt stromaufwärts der nim-Gene muss der Mechanismus zur Übertragung einer Metronidazol-Resistenz gegen C. bolteae und C. clostridioforme noch ermittelt werden.

Unerwartete Beobachtung neuer Resistenzgene

In Bezug auf andere Arzneimittelresistenzen zeigten Genomdaten Gene, die mit Resistenzmechanismen gegen Chloramphenicol und Rifampicin zusammenhängen (Tabelle 3). In den meisten Genomen jeder Spezies fanden wir CDSs, die für eine Chloramphenicolacetyltransferase der Gruppe A kodieren, die Chloramphenicol inaktivieren kann. Allerdings waren nur C. bolteae 90B3 und 90B8 resistent gegen Chloramphenicol. Das Genom des Stammes 90B8 enthielt eine zweite Kopie des Cat-Gens, das von einem Tn4451-ähnlichen Transposon getragen wurde (96 und 90 % Identität mit Tn4451 bzw. Tn4453). Das 90B3-Genom enthielt ein CDS-Homolog zum Gen cfr, das für eine 23S-rRNA-Methyltransferase kodiert, die weitgehend in grampositiven Bakterien verbreitet ist. Erwartungsgemäß war der Stamm 90B3 auch resistent gegen Florfenicol, Tiamulin und Linezolid (MHK = 16 mg/l). Andere 23S-rRNA-Methyltransferase (Cfr-like) CDSs wurden in einer Umgebung, die reich an transponierbaren Elementen (Tn 6103-6110-CTn4 ) in den Genomen von C. clostridioforme und C. bolteae 90A5 und 90B7, nachgewiesen, aber die rRNA-Methylierung schien die Empfindlichkeit gegenüber Chloramphenicol nicht zu beeinflussen (Abb. 3).

Die Analyse genomischer Daten ermöglichte die Erkennung von CDSs-Homologen zu Rifampin-ADP-ribosyltransferase (arr) -Genen in C. bolteae, jedoch nicht in C. clostridioforme. Um die arr-Gene herum wurden keine mobilen Elemente oder Spuren von mobilen Elementen gefunden, was darauf hindeutet, dass sie für diese Art einheimisch sind. Diese neuen Arr-Sequenzen verzweigten sich in der Nähe von Arr-Proteinen aus C. saccharoperbutylacetonicum und einigen Cyanobakterien auf dem phylogenetischen Baum (Zusätzliche Datei 8: Abbildung S4). Sie unterschieden sich von Arr-2-Proteinen von Enterobacteriaceae und von Arr-Proteinen von Mycobacterium und Streptomyces spp.. Alle Stämme außer 90A7 waren anfällig für Rifampicin. In Abwesenheit von Mutationen in rpoB (bekannt für Rifampicin-Resistenz verantwortlich), Resistenz von C. bolteae 90A7 (MHK: 32 mg / l) war wahrscheinlich auf eine positive Selektion von Mutationen in aar Cbol90A7 zurückzuführen. Die Anfälligkeit anderer C. bolteae für Rifampicin war wahrscheinlich auf das Fehlen von Promotoren stromaufwärts der arr (wie durch In-Silico-Analyse vorhergesagt) oder auf Nukleotidsubstitutionen innerhalb der Arr zurückzuführen, die zu Aminosäureersatz und funktioneller Inaktivierung führten (Daten nicht gezeigt).

Bezüglich der Resistenz aller Stämme gegen Moxifloxacin und Ciprofloxacin zeigten alle Stämme von C. bolteae mehrere Substitutionen in der “chinolonresistenzbestimmenden Region” (QRDR) von gyrB. Wir fanden keine Substitutionen in dieser Region für gyrA, noch beschrieben im Protein des Chinolon-resistenten epidemischen Stammes, C. difficile 027 . Daher war GyrB wahrscheinlich das bevorzugte Ziel beim Erwerb von Chinolonresistenz bei diesen beiden Spezies. Darüber hinaus waren in allen Stämmen mehrere CDSs vorhanden, die für den AcrB-Innenmembrantransporter kodieren. Diese Transporter sind Teil einer Multidrug-Efflux-Pumpe mit Resistenz-Nodulation-Division, von der bekannt ist, dass sie den Efflux von Chinolonen in einigen gramnegativen Bakterien erhöht . Weitere Studien sind erforderlich, um ihren Einfluss auf den Empfindlichkeitsverlust von Clostridium spp. zu Fluorchinolonen.

Insgesamt können ähnliche Resistenzprofile gegen Antibiotika in C. bolteae und C. clostridioforme aus verschiedenen Mechanismen resultieren.

Resistenzgene gegen Antibiotika, die gegen Clostridium spp. weniger aktiv oder inaktiv sind

Die Genome von C. bolteae und C.clostridioforme trug eine oder zwei Kopien des Undecaprenylpyrophosphatphosphatase-Gens bacA und 2 bis 5 Kopien der Effluxpumpengene bcrA, die in Übereinstimmung mit ihrer geringen Empfindlichkeit an der Bacitracinresistenz beteiligt waren . Wir fanden auch einen Cluster von CDSs-Homolog zum Dihydrofolatreduktase-Gen, dfrA20 (41% Identität / 97% Länge) von Pasteurella multocida im Kerngenom beider Arten, der die schlechte Aktivität von Trimethoprim auf unserem Clostridium spp. . Darüber hinaus enthielt C. clostridioforme 90A6 eine CD, die mit dfrA aus Enterococcus faecium identisch war. Dieses Gen, das in einer Umgebung nachgewiesen wurde, die reich an mobilen Elementen ist, steht im Einklang mit einem neuen Beispiel für den horizontalen Transfer zwischen Enterococcus spp. und Clostridien.

Interessanterweise enthielten die Genome von C. bolteae oder C. clostridioforme verschiedene Resistenzgene gegen Antibiotika, die bei diesen Spezies von Natur aus inaktiv sind. Fünf CDSS waren Homologe von Genen, die Aminoglykoside phosphorylieren, acetylieren oder adenylieren. Vier dieser mutmaßlichen Resistenzgene wurden in einer Umgebung mobiler Elemente nachgewiesen. Drei Gene, aadE, sat4 und aph(3′)-III, die Resistenz gegen Streptothricin, Streptomycin und Kanamycin verleihen, wurden als Teil eines Transposons gefunden, das durch zwei IS1182-Kopien in C. clostridioforme 90A3 (zwei Kopien), 90A6 und 90B1. Das nachgewiesene aph(3′)-III war identisch mit dem aph(3′)-III, Teil des multiresistenten Plasmids PF856 aus E. faecium , auch verwandt mit einer internen Domäne (99% Identität) eines SSCmec-Elements von Staphylococcus aureus HT20040085. In ähnlicher Weise wurde das Aminoglykosid-6-Adenylyltransferase-Gen ant (6′) -Ia, das eine Resistenz gegen Streptomycin verleiht, von C geteilt. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 Kopien), 90A4, 90A6 (2 Kopien) und C. bolteae 90A7. Das Adenylyltransferase-Gen aad(9′)-b, das eine Resistenz gegen Streptomycin/Spectinomycin vermittelt, wurde in C. bolteae 90B3 gefunden. Auch im Genom von C. clostridioforme 90B1 waren zwei Kopien der Acetyltransferase aac(6′)-Im vorhanden. Homologe von AAC (6′) -Im, die Resistenz gegen Tobramycin und Amikacin-Resistenz verleihen, wurden auch in E. coli (96% Identität), Coprococcus sp, C. difficile und Enterococcus faecium gefunden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wurden drei CDSS, die für eine Aminoglykosidkinase (APH) kodieren, von denen bekannt ist, dass sie in grampositiven Bakterien weit verbreitet sind, auch bei allen Stämmen beobachtet .

Zahlreiche Tetracyclin-Resistenzgene wurden auch in C. bolteae und C. clostridioforme nachgewiesen. Sie umfassen sowohl Effluxgene wie tet40 als auch Ribosomenschutzdeterminanten wie tetO, tetW und tet32, die zuvor als in der Darmflora unter entfernt verwandten Bakterien zirkulierend gemeldet wurden .