Vollständige Genomsequenz von Clostridium innocuum Stamm ATCC 14501

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Wir berichten über die vollständige Genomsequenz von Clostridium innocuum Stamm ATCC 14501, der 1962 nach Isolierung aus einem Blinddarmentzündungsabszess identifiziert wurde (1). Es wurde als grampositiver Stab mit terminalen Sporen charakterisiert. Die Kolonien hatten einen Durchmesser von 1,5 bis 2,5 mm, waren glänzend, weiß, erhaben und nicht hämolytisch. Die intraperitoneale Inokulation des Kulturüberstandes in Mäuse war nicht pathogen. Seitdem gilt C. innocuum als gutartiger gastrointestinaler Mikroorganismus (1).

Nun wird das pathogene Potential von C. innocuum überdacht. Kürzlich berichteten Chia und Kollegen, dass C. innocuum die zweithäufigste Clostridienart ist, die eine extraintestinale Infektion verursacht (2) und eine Ursache für eine Clostridium difficile-ähnliche Darminfektion ist (3). Diese Isolate waren vancomycinresistent, zytotoxisch gegen Vero- und HT-29-Zellen und enteropathogen bei Mäusen (3). Mit dieser Überprüfung der Pathogenität von C. innocuum wird die vollständige Genomsequenz des Stammes ATCC 14501 benötigt.

Genomische DNA (gDNA) für Illumina und Nanopore Bibliotheken wurde unter Verwendung der BiOstic bacteremia DNA isolation Kit (Qiagen, Germantown, MD) aus einer über Nacht Kultur gezüchtet anaerob in tryptischen Sojabrühe bei 37 ° C. Long-Read-Sequenzierung Bibliotheken wurden aus unscharfen gDNA unter Verwendung Ligation Sequenzierung Kit SQK-LSK109 (Oxford Nanopore, UK) und sequenziert auf der MinION-Plattform unter Verwendung einer FLO-MIN106 Durchflusszelle. Standardparameter wurden für alle Software verwendet, sofern nicht anders angegeben. Guppy v3.4.5 wurde verwendet, um Anruflesevorgänge mit dem hochgenauen R9.4.1-Modell zu stützen und eine Filterung der Lesequalität basierend auf Q-Scores, Demultiplexing und Barcode-Trimmen durchzuführen. Die ungefähre Leseabdeckung betrug 98 × von 19.646 Lesevorgängen mit insgesamt 460,0 Mbp. Der gelesene N50-Wert betrug 22.933 Nukleotide und der L50-Wert 7.784 Reads. Nanopore-Lesequalität wurde unter Verwendung pycoQC v2 ausgewertet.5.0.21 (4).

Short-Read-Sequenzierungsbibliotheken wurden aus gDNA unter Verwendung des Nextera XT-Kits (Illumina, San Diego, CA) hergestellt und auf der Illumina MiSeq-Plattform unter Verwendung einer v3-Flusszelle sequenziert, um 482.327 Paare von 301-bp-Lesevorgängen zu erhalten. Sequenzierungsadapter wurden von Reads auf dem Instrument getrimmt, um 196,3 Mbp Sequenz mit einer ungefähren Genomabdeckung von 42 × zu erzeugen. Die Illumina-Lesequalität wurde mit FastQC v0.11.2 (5) bewertet. Um falsch-positive Variantenaufrufe in Alignments zu minimieren, wurde kein Qualitäts-Trimmen von Illumina-Reads durchgeführt (6).

Das Genom wurde mit Nanoporen-Reads zusammengestellt, die die Q-Score-Filterung unter Verwendung von Flye v2.6 bestanden, um ein einzelnes 4,30-Mb-Contig (7) zu erzeugen. Adaptergestutzte Illumina-Messwerte wurden mit BWA v0.7.17 auf die Baugruppe ausgerichtet, und Montagefehler wurden mit Pilon v1.23 mit einer –mindepth-Einstellung von 0,1 (8, 9) korrigiert. Serielle Leseausrichtung und Pilonkorrektur wurden dreimal durchgeführt, bis keine weiteren Montagekorrekturen mehr erzeugt wurden. Eine kundenspezifische Software (Pilon Tools v0.1) (https://github.com/egonozer/pilon_tools) wurde verwendet, um verbleibende Homopolymer-Montagefehler zu identifizieren, manuell zu bewerten und zu korrigieren. Zirkulator v1.5.5 wurde verwendet, um die Zirkularisierung des Chromosoms sicherzustellen, indem überlappende Enden abgeschnitten und zum Anfang des dnaA-Gens gedreht wurden (10). Die Endmontage ist eine einzelne Chromosomensequenz mit einer Länge von 4.718.906 bp und einem GC-Gehalt von 43,6%. Die Annotation wurde unter Verwendung der NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) v4.11 (11, 12) durchgeführt.