Wie gestaltet man gRNA für CRISPR Genome Editing?
Die gRNA führt das CRIPR Cas9-System an den richtigen genomischen Ort, um einen Doppelstrangbruch durchzuführen.Die Target-Spezifität des CRISPR Cas9-Systems wird durch die 20 Nukleotide am 5′-Ende der gRNA bestimmt. Die gRNA-Basenpaare zum komplementären Strang der Zielsequenz und Cas9-Nuklease führen einen Doppelstrangbruch durch.
Beim Entwerfen eines gRNA müssen folgende Dinge berücksichtigt werden.
1) GC-Inhalt: Der typische Bereich liegt zwischen 40% und 80%. Ein höherer GC-Gehalt stabilisiert den RNA -DNA-Duplex, während Off-Target-Hybridisierungen destabilisiert werden
2) Länge: Die Länge kann eingestellt werden und reicht von 17-24 Basenpaaren. Eine kürzere Sequenz führt zu minimierten Off-Target-Effekten. (17) ist die unterste Grenze für die Länge der Führungssequenz, jede Länge der Führungssequenz jede Länge, die kürzer als 17 ist, hat eine statistische Chance, mehrere genomische Loci anzugreifen.)
3)Mögliche Off-Target-Effekte: Mismatch-Toleranz und die Zielstelle führt zu Off-Target-Effekten. Dies kann durch genomweite Zieleffektsuchen reduziert werden.
Es gibt viele Websites, die bei der Gestaltung von gRNAs helfen. Einige von ihnen sind Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA Designer und Biotools.
Ich erkläre hier, wie man die Chop Chop-Website benutzt,
1) gehe zu https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Spezies auswählen
3) Spezies-spezifische Gen-ID auswählen oder das interessierende Nukleotid ausschneiden und einfügen und Analyse starten.
Sobald die Analyse abgeschlossen ist, wird eine grafische Darstellung der ortsspezifischen gRNA angezeigt. Jede potenzielle gRNA zeigt auch die möglichen Off-Target-Effekte. Wählen Sie diejenigen mit weniger Off-Target-Effekten.
