Zirkuläre RNA: Funktionen, Anwendungen und Perspektiven

Einleitung

Zirkuläre RNA (circRNA) wurde Mitte der 70er Jahre in RNA-Viren als Viroide entdeckt und zunächst als endogener RNA-Spleißfehler vermutet . Dank der Fortschritte in der Computeranalyse und RNA-Sequenzierungstechniken im selben Jahrzehnt, Diese missverstandenen kreisförmigen Strukturen wurden schließlich sowohl in der Struktur als auch in der Funktionalität korrekt und tiefgreifend erkannt . Im Kern ist circRNA eine einzelsträngige RNA, die sich jedoch von der weitaus bekannteren linearen RNA dadurch unterscheidet, dass sie sich durch kovalente Verbindung ihrer 5 ‘- und 3’ -Enden kontinuierlich in sich selbst einschließt und so einige faszinierende Eigenschaften aufweist, die nicht vollständig erforscht sind: Proteinkomplexgerüst, elterliche Genmodulation, RNA-Protein-Wechselwirkungen und microRNA (miRNA) -Synthese, um nur einige zu nennen . Sie gelten heute als wesentliche Regulationsfunktion für Pflanzen und Tiere gleichermaßen . Eine zunehmende Anzahl von Studiengruppen hat gezeigt und verifiziert, in einem Ausmaß, das Niveau der Wirksamkeit und Wirksamkeit in zirkulären RNAs angezeigt, die typischerweise in lebensfähigen medizinischen Behandlungen und anderen biotechnologischen Anwendungen erforderlich ist. Zum Beispiel werden Fälle von traditionellen Biomarkern, die von vorgeschlagenen circRNA-Substituten weit übertroffen werden, häufig berichtet. Gestützt durch wachsende Unterstützung und Beweise über die fördernden Fähigkeiten von circRNAs, sollten mehr Untersuchungen und Interesse als solche hervorgebracht werden, nicht nur aus einem grundlegenden umfassenden biologischen Verständnis seiner Strukturen und Mechanismen, sondern auch auf einer systematischen Ebene ihrer Wechselwirkungen mit umgebenden Molekülen und Umgebungen. Anwendbarerweise sind circRNAs in Bezug auf ihr Potenzial und ihre Lebensfähigkeit, Krebs und andere bösartige Krankheiten mit anderen neuartigen Behandlungen wie personalisierter Medizin und Stammzelltherapien anzusprechen, auf Augenhöhe.

CircRNA-Eigenschaften

CircRNAs bestehen im Allgemeinen aus 1-5 Exons und die Introns, die die Exons flankieren, sind bis zu 3 mal so lang wie ihr lineares Gegenstück. Eine genauere Analyse hat das Vorhandensein vieler komplementärer Inverter-Alu-Wiederholungen in den Intron-Segmenten ergeben , Einige spekulieren, dass diese spezielle Anordnung es den Spleißstellen tatsächlich erleichtert, sich leicht zu lokalisieren und die Zirkularisierung zu fördern. Da es sich um eng umschlungene Strukturen handelt, gibt es in circRNA effektiv keine 5′- und 3′-Endstrukturen wie Poly-A-Schwänze und 5′-Kappen, wodurch sie immun gegen Exonuklease-Spaltung sind . Empirisch halten sie 2,5-mal länger als ihre linearen Gegenstücke in Brustzellen, wie eine Studie von Enuka et al. . Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften können gängige Labor-Screening-Techniken wie der RNase–R–Abbau – ein Enzym, das ausschließlich lineare RNA abbaut – sowie Poly-A-Tail-Tests enge Schleifenstrukturen gegenüber linearen Formen genau auswählen. Mehrere Forschungsgruppen haben in den letzten Jahren ihren Fokus auf die Identifizierung potenzieller circRNA-Isoformen verlagert, Strukturen, die ursprünglich aus derselben elterlichen DNA exprimiert werden, sich jedoch in ihrer endgültigen reifen Form aufgrund der Differenzierung in der Spezifität von Spleißosomen zur Erkennung von Exons und Introns auf dem Prä-mRNA-Strang geringfügig voneinander unterscheiden . Bemerkenswerte Gruppen sind Salzman, Jeck, Memczak, Guo und Zhang . So erklärt sich die unglaubliche Vielfalt der circRNAs: 20.000 verschiedene Typen wurden bisher in Eukaryoten identifiziert, eine Zahl, die bis heute offen ist .

CircRNA-Biogenese und Klassifizierung

Die Bildung von circRNAs entsteht durch die Positionierung und Verwürfelung von Exon- und Introngruppen, bei denen es sich um Segmente handelt, die im endgültigen posttranskriptionell modifizierten Produkt reserviert bzw. eliminiert werden . Normalerweise wird eine reife Boten-RNA gebildet, wenn ein Protein-RNA-Komplex namens Spliceosom die Abspaltung von Intronsegmenten in einem Vorläufer-mRNA-Molekül katalysiert, üblicherweise durch Erkennung spezifischer Sequenzen, die das Intronsegment an beiden Enden flankieren. Die Exonsegmente verschmelzen, während die intronischen Segmente folgerichtig herausgenommen und abgebaut werden. Diese konventionelle Wahrnehmung berücksichtigt nicht die Abweichung und den Unterschied in der Potenz über alle Spleißstellen hinweg , von denen einige das Spleißosom ignorieren und unweigerlich zur Synthese von circRNA führen können. Darüber hinaus ist der Beitrag der räumlichen Anordnung der 5′- und 3′-Spleißstelle nicht zu vernachlässigen, denn wenn die erstere stromabwärts der letzteren positioniert ist, baut das Spleißosom günstigerweise eine kovalent geschlossene kreisförmige Struktur über einem linearen exonischen Molekül auf . Dieser Mechanismus, der gemeinhin als “Exon Scrambling” bezeichnet wird, führt zu verschiedenen Arten von circRNAs, einschließlich exonischer, intronischer, exon-intronischer und intergener . In krebsspezifischen Fällen ist die innere Struktur aufgrund der expansiven und damit invasiven Natur bösartiger Tumoren noch schwieriger zu bestimmen . Wir haben kurz die Biogenese und Funktionalität von circRNAs in Abb. 1.

Überblick über die Biogenese und Funktionalität zirkulärer RNA. Erläuterung und Fußnoten: a Eine Boten-RNA in ihrer reifen Form, bei der die Wechselwirkung zwischen Exons und Introns fehlt. b Lariat-getriebene Zirkularisierung. Das Upstream-Exon (Exon 1) und das Downstream-Exon (Exon 4) sind aufgrund des Spleißens der mRNA kovalent gebunden. Dies erleichtert die Produktion eines RNA-Lariat neben den verbleibenden gepaarten Exons, die Exons 2 und 3 sind. c RNA-bindende proteingetriebene und Intron-Pairing-getriebene Zirkularisierungen. In beiden Fällen werden die vorgelagerten und nachgelagerten Introns (Introns 1 und 3) gepaart, um den sandwichartigen Exons (Exons 2 und 3) die Möglichkeit zu geben, zu interagieren, der einzige Unterschied besteht darin, dass sich im ersteren Fall ein externes RBP-Molekül der Gleichung anschließt, um die Reaktion aktiv zu erleichtern, während bei Intronpaarungsgetriebener Zirkularisierung die Hydroxylgruppe und die Phosphatgruppe der vorgelagerten und nachgelagerten Introns jeweils unabhängig voneinander paaren. d ecircRNA oder ElcircRNA wird unabhängig vom Zirkularisierungsweg hergestellt. In einigen Fällen befinden sich intronische Segmente in der Schleife, wodurch ElcircRNAs im Gegensatz zu ecircRNA entstehen, die rein exonische Segmente enthält. zu den Funktionalitäten reifer circRNAs gehört das miRNA-Sponging, das als doppelter Inhibitor für einige chemische Reaktionen fungiert; Proteintranslation ist möglich, wenn auch ziemlich selten, und es wird geforscht, um zu verstehen, wie sie sich von linearen RNA-Translationen unterscheidet; RBP-Proteinkomplexformationen helfen bei der Regulierung und Moderation von Signalwegen und wirken sich indirekt auf die Produktion anderer circRNAs aus; mRNA-Interaktionen, sei es unterstützend oder hemmend

CircRNA-Funktion: microRNA-Schwämme

Aufgrund der Einzigartigkeit in den Strukturen von circRNA kodieren sie nicht für Proteine wie die linearen Formen . Studien haben mit empirischen Belegen gezeigt, dass bestimmte circRNAs als microRNA-Schwämme wirken und ihren Mechanismus effektiv behindern. microRNAs sind 21-nt lange nicht-kodierende RNA-Sequenzen, die bei der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression helfen, typischerweise indem sie sich an mRNAs binden und deren Translation in Protein entweder kompetitiv oder nicht kompetitiv hemmen. Sie werden nach ihren Samenregionen in Familien eingeteilt, je nachdem, ob sie dieselbe Nukleotidsequenz von den Positionen 2 bis 7 teilen . CircRNAs besitzen die Komplementarität, sich an microRNAs anzuheften, die Samenregionen der miRNAs zu erkennen und sie kompetitiv zu deaktivieren. Insbesondere zwei circRNAs, CDR1as und circSRY, stehen derzeit im Rampenlicht der wissenschaftlichen Forschung. Es wird beobachtet, dass CDR1as 70 konservierte Bindungsstellen für miRNA-7 enthält, weit signifikant als jeder andere lineare miRNA-Schwamm. Seine Schwammfähigkeit wird von Memczak et al. , die die Sequestrierung von CDR1as-Molekülen gegen eine erhöhte Expression von miR-7 in Zebrafischhirnen nutzten, um durch Überwachung nachfolgender Zebrafisch-Mittelhirnentwicklungen Belege für CDR1as-inhibitorische Aktivitäten gegen die gezielte miRNA zu erhalten. Die Schaltung hingegen wird in Maushoden getestet und ihr komplementärer Angriff auf die miR-138-Samenregion wird bemerkt . Da es 16 spezifische Bindungsstellen enthält, eine Zahl, die unter allen Schwammmolekülen immer noch beeindruckend ist, wird ihre Schwammfunktionalisierungshypothese bestätigt .

CircRNA-Funktion: Interaktion mit RBPs und Proteintranslation

Einige haben festgestellt, dass circRNA die Gentranskription und -expression über andere Wege reguliert. Sie können mit RNA-bindenden Proteinen (RBPs) wie Circ-Foxo3 interagieren und zusammen einen Komplex bilden, der das Überleben und die Proliferation von Zellen beeinflusst, indem er mit p21 und CDK2 interagiert ; Einige stärken die mRNA-Stabilität, indem sie Duplexstrukturen bilden, wie im Fall von CDR1as. Kontroverser sind Gruppen wie Legnini I. et al. und Pamudurti N.R. et al. entdeckt, dass bestimmte circRNAs für Proteine übersetzen können, eine in murinen Myoblasten und eine in Fliegenköpfen . Solche Nachrichten bringen neue Hypothesen über circRNA-Fähigkeiten hervor, die herkömmlicherweise als nicht kodierend angesehen werden . Seit der ersten Entdeckung von Proteinen, die aus dem Hepatitis-Virus übersetzt wurden – einer einzelsträngigen circRNA – haben einige die Aktivierung der circRNA-Translationsfähigkeit durch Einfügen einer IRES (Internal Ribosome Entry Site) vor dem Startcodon verifiziert . Es muss noch viel mehr getan werden, um den genauen Translationsmechanismus dieser circRNAs vollständig zu verstehen und warum sie funktionieren, während die meisten anderen dies nicht tun.

CircRNA-Anwendungspotenzial

Praktischer sind circRNAs lebensfähige Biomarker für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, da sie aufgrund ihrer geschlossenen zirkulären Struktur nicht leicht durch Exonukleasen abgebaut werden können. In einigen Fällen wurden circRNAs gefunden, die herkömmliche Biomarker übertrumpfen. Beispielsweise erhöht die Hochregulierung von Circ-PVT1 in Geweben von Magenkrebs (GC) die Schwammaktivität von miR-125 und fördert anschließend die GC-Proliferation ; hsa_circ_0000190 hat auch Aufmerksamkeit erregt, indem es genau umgekehrt arbeitet – die Herunterregulierung erfolgt, wenn es mit GC in Kontakt kommt, und es wird getestet, um empfindlicher und spezifischer als Biomarker wie CEA und CA 19-9 zu sein . Ein weiteres Beispiel ist das hepatozelluläre Karzinom (HCC), bei dem der vorliegende Biomarker Alpha-Fetoprotein (AFP) ist . AFP zeigt eine schlechte Empfindlichkeit, wobei 40% aller Patienten mit HCC normale AFP-Spiegel testeten. Der konstruktive Weg, diese Empfindlichkeit zu erhöhen, ist die Kombination mit anderen Markern, was keine effektive Lösung ist. Alternativ können Xingchen Shang et al. hat die Korrelation zwischen circ_005075 und der Tumorgröße vorgeschlagen und sie als lebensfähigen prognostischen Biomarker aufgeführt, der aufgrund seiner Stabilität und Spezifität sowohl in der Wirksamkeit als auch im Potenzial überlegen ist. Dies deutet darauf hin, dass die Entwicklung und Invasion von HCCs eng mit circRNAs verbunden sind, obwohl ihr vollständiger Mechanismus noch unklar ist. Dennoch ist die Liste möglicher circRNA-Biomarker für die Krebsforschung nicht nur auf diese beiden Krankheiten beschränkt. Wir haben die verfügbaren Studien zu circRNAs, die an verschiedenen menschlichen Krankheiten beteiligt sind, in Tabelle 1 zusammengefasst.

Weitere neuere Studien haben identifiziert und versuchen, die Anreicherung und Stabilität von circRNAs in Exosomen zu entschlüsseln, eine Kombination, die die Targeting-Fähigkeit von circRNAs weiter verbessern könnte. Exosomen sind extrazelluläre Vesikel, deren Hauptfunktion darin besteht, verschiedene Zellinhalte, Chemikalien sowie Faktoren zu transportieren und so die Interaktion und Reaktion von Zelle zu Zelle zu ermöglichen . Daher ist eine beträchtliche Anzahl von zellulären Veränderungen und Gewebeantworten eine Folge davon, ob das entsprechende Vesikel derselben Kompatibilität erfolgreich sein Ziel erreicht hat, und von Illicited-Reaktionen oder transportierten Faktoren . Das Verständnis des Exosomenmechanismus kann dazu beitragen, Mediationen über Tumormikroumgebungen und interzelluläre Netzwerke abzuleiten, daher großes Interesse an der Exosom-circRNA in letzter Zeit angesichts der Möglichkeit einer verstärkten Wirksamkeit und Targeting-Fähigkeit auf bösartige oder fehlerhafte Zellen.

Der Ursprung von circRNAs hängt letztendlich von den entsprechenden miRNA-Spiegeln in ihren Spenderzellen ab, die sowohl immun als auch nicht immun sein können. Exosom-RNAs können Schäden an der DNA minimieren, indem sie den Zellzyklus beschleunigen, wie kürzlich in einem Fall der Überexpression von miR-217 gezeigt wurde, was zu einer Verringerung der Clclin-D1- und EZH2-Expression führt. Es wird angenommen, dass dieses Verhalten mit der deregulierten Proliferation in Form von Neoplasmen zusammenhängt . In jüngerer Zeit haben viele experimentelle Ergebnisse die direkte Beziehung zwischen Exosomen und neoplastischer Transformation sowie die mechanistische Wirkung von circRNA auf die Tumormikroumgebung geschlossen . Unter Pankreasduktales Adenokarzinom (PDAC) Zum Beispiel wurde es mit der abnormal hohen Expression des Exosoms circ-PED8A in Verbindung gebracht ; Das Exosom circNRIP1 fördert Metastasen bei Magenkrebs (GC) durch Sponging miR-149-5p, in einer anderen Studie. Am wichtigsten ist vielleicht die Rolle, die das Exosom circPTGR1 bei der Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) spielt , wobei die Hochregulierung des Exosoms circRNA die Tumorinvasion förderte. Aufgrund dieser hochkorrelativen Befunde werden Exosom-circRNAs als diagnostische Indikatoren für ihre entsprechenden bösartigen Tumoren vorgeschlagen, basierend auf ihrer Reaktionsfähigkeit bei sich ändernden Expressionsniveaus und ihrer ausgezeichneten Stabilität, gekoppelt mit ihrem angeborenen gezielten Verabreichungsmechanismus . Gegenwärtig wurden über 1000 circRNAs in Exosomen im gesamten menschlichen Körper identifiziert, wobei weitere Untersuchungen zur Entdeckung zusätzlicher Exosom-circRNA-Krebs-Kombinationen durchgeführt wurden.

CircRNA Herausforderungen und Perspektiven

Trotz zunehmender Forschung, die parallel zum Anstieg der Popularität von circRNA durchgeführt wurde, bleibt die biologische Funktion der meisten circRNAs immer noch ein Rätsel. Zum Beispiel wird beobachtet, dass die Mehrheit der circRNAs im Zytoplasma patrouilliert, aber sie stammen aus dem Zellkern, so dass die Frage aufgeworfen wird, wie sie durch die winzige Kernpore passen. Darüber hinaus muss noch untersucht werden, dass sich viele der zirkularisierten Exons (85%) mit proteinkodierenden Sequenzen überlappen, die meisten circRNAs jedoch nicht für Proteine kodieren. Auf einer klinischeren Ebene erfordern sie weitere Tests, um traditionelle diagnostische Verfahren vollständig ersetzen zu können. Bedenken wie die traumaverursachende Extraktion von Patientengewebe und der teure circRNA-Nachweis im Gewebe müssen noch angegangen werden, um ein umfassendes Verständnis ihrer Sekundärstrukturen und ihrer unterschiedlichen Rollen untereinander zu erlangen. Das Versäumnis, geeignete circRNA-Biomarker bei Patienten ordnungsgemäß zu verabreichen, kann klinische Ergebnisse verschleiern, die überwunden werden müssen, indem ein besseres Bild von der Erzeugung, Lokalisierung und dem Abbau der vorgeschlagenen circRNAs gewonnen wird.

Dennoch sind circRNAs immer noch attraktive Optionen für die Entwicklung einer Reihe von biologischen therapeutischen Instrumenten. Es gibt bereits Berichte über In-vitro- und In-vivo-RNA-Konstruktion unter Verwendung von Gruppe I permutierten Intron-Exon (PIE) -Sequenzen für das komplementäre Targeting von Spliceosomal-Backsplice-Site-flankierenden Sequenzen, und dieser Mechanismus kann möglicherweise extrapoliert werden, um jede Sequenz oder jedes Protein bekannter Struktur einzuschließen, wenn wir dies wünschen. Als Randbemerkung gibt es viel Raum für Verbesserungen bei der Erweiterung der Vielfalt der diagnostischen Möglichkeiten von circRNA. In einem Beispiel zielt die vorliegende molekulare Analyse von Blut auf die Analyse zellfreier Fragmente genomischer DNA ab; Eine große Zukunftsperspektive wäre es, die Probenahme von krankheitsspezifischen extrazellulären Vesikeln in Betracht zu ziehen, um den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit genauer zu überwachen. Diese Ideen legen den Grundstein für weitere Vorschläge zur selektiven Proteinregulation und programmierten Zellsignalisierung. Wie in laufenden Experimenten immer wieder gezeigt, haben circRNAs ihr Sponging- und Biomarking-Potenzial souverän unter Beweis gestellt, was uns dazu drängen sollte, die Geheimnisse der lange missverstandenen circRNAs zu entschlüsseln.