Chromfreisetzungstest: Die alte Art, zytotoxische T-Zellen zu testen

Es gibt verschiedene Methoden, mit denen Sie feststellen können, ob Ihre T-Zellen zytotoxisch sind, aber ein Chromfreisetzungstest mit radioaktivem 51chrom (51Cr) ist einer der ältesten. Es liefert gute Ergebnisse und eignet sich hervorragend für Labors, die sich keine Durchflusszytometrie leisten können oder nicht zur Verfügung haben.

Hier werde ich eine einfache Methode zum Testen der T-Zell-Abtötungsfunktion mit 51Cr skizzieren. Bevor Sie jedoch mit dem Assay beginnen, sollten Sie sich über die richtigen Sicherheitsmaßnahmen beim Umgang mit radioaktivem Material informieren.

Wählen Sie Ihr Ziel und Ihre Effektoren

Um einen Chromfreisetzungstest durchzuführen, inkubieren Sie zuerst Ihre Zielzellen (T) mit 51Cr. Sie inkubieren dann die Zielzellen mit Effektorzellen (Ihre T-Zellen; E). Wenn die Effektorzellen die Ziele töten, geben sie den 51Cr frei, den Sie mit einem Gammazähler erkennen.

Welche Targets und Effektoren Sie verwenden, hängt ganz von Ihrer Anwendung ab. Ihre Zielzellen sind das, woran Sie die T-Zellfunktion testen. Vielleicht möchten Sie Ihr Ziel töten (Zytotoxizität messen) oder Sie möchten sehen, ob die T-Zellen tolerant sind (z. B. T-Zellen testen, bevor sie zur Sicherheit in einen Patienten gelangen!). Ihre Effektor-T-Zellen können auch aus verschiedenen Quellen stammen. Sie können beispielsweise hergestellte T-Zelllinien oder frisch aus einem Tier isolierte T-Zellen verwenden.

Lass uns radioaktiv werden

Sobald du deine Ziele und Effektoren gesammelt hast, ist es Zeit zu kochen.

1. Zähle deine Zellen. Sie können ein Hämozytometer oder einen automatischen Zellzähler verwenden. Die Anzahl der Zellen, die Sie benötigen, hängt von der Anzahl der Bedingungen und der Anzahl der Replikate jeder Bedingung ab. Typischerweise, Ich führe meine Assays in dreifacher Ausfertigung durch und habe vier Verhältnisse (5:1, 10:1, 20:1 und 40:1 E:T). Aliquoten Sie Ihre Zielzellen (in meinem Fall 500.000- etwa 25.000 pro Vertiefung) in konische 15-ml-Röhrchen und halten Sie jede experimentelle Bedingung getrennt! Stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Zellen in einem kleinen Volumen suspendieren, damit sie mit dem Chrom in Kontakt kommen können.

1. Fügen Sie das 51Cr (etwa 50 µCi) hinzu und inkubieren Sie Ihre Ziele eine Stunde lang mit dem Chrom. Flick die Rohre etwa alle 20 Minuten Chancen für Zellen zu erhöhen, um das Chrom aufzunehmen.

1. Während Sie inkubieren ….Diese lange Inkubation ist eine großartige Zeit, um Ihre Effektorzellen einzurichten. Waschen Sie die T-Zellen zweimal mit PBS, um überschüssige Zytokine zu entfernen, die Ihre Ergebnisse verzerren könnten. Dann resuspendieren Sie sie in den entsprechenden Medien.

1. Sobald Sie die Wäschen beendet haben, können Sie Ihre Effektoren auf den Teller legen! Ich verwende normalerweise eine 96-Well-Platte, da die Volumina eher klein sind. Platzieren Sie die Effektoren in unterschiedlichen Verhältnissen zu den Zielen, um die Tötungsschwelle zu bestimmen. Ich führe den Assay normalerweise in Dreiergruppen aus, aber es hängt davon ab, wie viele Zellen Sie zur Verfügung haben. 40, 20, 10 und 5 zu 1 Verhältnisse (Effektoren zu Zielen) sind eine gute Vorlage, wenn Sie genügend verfügbare Zellen haben.

Zusätzlich zu diesen test, set up zwei control bedingungen:

• eine spontane Freisetzungskontrolle, die nur Zielzellen enthält (im Grunde eine Negativkontrolle, da ohne die Effektoren keine Abtötung erfolgen sollte) und
• eine maximale Freisetzungskontrolle, bei der Sie die Zielzellen lysieren (eine positive Kontrolle, die die maximale Menge an Chrom anzeigt, die von den Zellen aufgenommen wird).

1. Zurück zu diesen Zielzellen … Sobald Ihre Zielzellen mit der Inkubation fertig sind, waschen Sie sie dreimal mit Zellkulturmedium, um das überschüssige Chrom zu entfernen. Spin die zellen sanft zu 400g für 5 min für jede dieser wäscht. Dekantieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter, der in einen sicheren Zerfallsbereich überführt werden kann, anstatt zu versuchen, ihn herauszupipettieren. Dies wird dazu beitragen, mögliche Kontaminationen zu reduzieren, da Sie sich nicht mit Tipps befassen müssen.

1. Nach dem Waschen resuspendieren Sie Ihre Zellen auf 5000 Zellen pro 100?l. Dann fügen Sie 100?l von Zellen zu jedem Brunnen, sogar die spontanen und maximalen Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen zusammen für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C, wie lange genau, hängt von Ihrer Anwendung ab.

1. Vier Stunden später….Nehmen Sie Ihren Teller aus dem Inkubator. 100 hinzufügen?l einer 1% igen Triton-x-Lösung auf Ihre Zellen in den maximalen Vertiefungen, um die Zellen zu lysieren und das gesamte Chrom freizusetzen.

1. Drehen Sie die Platte zehn Minuten lang mit 1250 U / min nach unten, um die Zellen zu pelletieren.

1. Übertragen Sie den Überstand aus jeder Vertiefung in die Vertiefung einer Absorptionsplatte (z. B. Lumaplatten), wobei Sie darauf achten, das Pellet am Boden der Vertiefung nicht zu berühren.

1. Lassen Sie die Platte über Nacht trocknen. Am Morgen legen Sie es in den Plattenleser und erhalten Sie Ihre Ergebnisse.

Die Ergebnisse, die Sie sehen, hängen von Ihrer spezifischen Anwendung ab

Berechnung der Ergebnisse Ihres Chromfreisetzungstests

Sobald Sie die Messwerte erhalten haben, müssen Sie eine einfache Berechnung durchführen, um die Zytotoxizität Ihrer Zellen zu bestimmen.

Berechnen Sie zunächst den Durchschnitt Ihrer Triplikate für jede Bedingung. Dann nehmen Sie diese Durchschnittswerte und stecken Sie sie in diese Formel:

(Chromfreisetzung für Bedingung von Interesse – Chromfreisetzung in spontanen Vertiefungen) / (maximale Chromfreisetzung – Chromfreisetzung in spontanen Vertiefungen)

Multiplizieren Sie den Wert mit 100, um Ihre prozentuale Lyse zu erhalten.