CMV-Promotormutanten mit reduzierter Neigung zu Produktivitätsverlust in CHO-Zellen

Um die Auswirkungen von methylierungsanfälligen CpG-Stellen aus dem Enhancer, der proximalen und der Kernpromotorregion zu überwachen, haben wir uns entschieden, nicht nur C-179, sondern auch die Cytosine an den Positionen -508 (C-508) und -41 (C-41) zu untersuchen. Keine der ausgewählten CpG-Stellen überschneidet sich mit bekannten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in Cricetidae-Arten. Um den Gesamt-GC-Gehalt zu erhalten, führten wir C-zu-G-Transversionen durch (Abb. 1a). Neben C-41 ist C-13 das zweite Cytosin in der Kernpromotorregion, das häufig methyliert zu sein scheint. Da die Mutation von C-13 zu G eine neue CpG-Stelle erzeugen würde, zogen wir es vor, C-41G zu untersuchen. Die mutierten Promotorvarianten wurden mit einem dreibuchstabigen Code abgekürzt, z. B. Variante GCC hat Guanin anstelle von Cytosin an Position -508, während die Cytosinbasen an -179 und -41 erhalten bleiben. CCC ist die unmutierte Steuerung hCMV-MIE (Abb. 1a). Mutierte oder native Promotoren wurden in verschiedene Plasmide eingebracht und verschiedenen Reportergenen vorgeschaltet.

Um zu sehen, ob die Mutationen die Stärke des Promotors beeinflussen, führten wir zwei unabhängige Experimente durch, indem wir Reporterplasmide, die sekretierte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) exprimieren, transient in CHO-K1-Zellen transfizierten und die Expression von SEAP fünf Tage nach der Transfektion untersuchten. Als Referenz wurde der unmutierte Promotor verwendet (Fig. 1b). Die Expression von SEAP aus GGG-, GCG- und CGC-Promotoren war durchweg etwa 20% niedriger als aus dem unmutierten Promotor, mit geringfügigen Abweichungen zwischen den Replikatexperimenten. Im Allgemeinen zeigten die C- bis G-Mutationen eine Tendenz zu leicht reduzierter Promotorstärke, die jedoch akzeptabel zu sein schien.

Als nächstes fragten wir, ob hCMV-MIE-Promotorvarianten die Expressionsstabilität von permanent transfizierten CHO-Zellen während der Langzeitkultivierung beeinflussen. Zu diesem Zweck wählten wir einen eGFP-Reporter, der die zytometrische Analyse der Reportergenexpression auf Einzelzellebene ermöglicht. eGFP-Reporterplasmide wurden in CHO-K1-Zellen transfiziert und drei bis vier unabhängige Pools permanent transfizierter Zellen wurden mit Methotrexat (MTX) selektiert. Diese wurden über drei Monate in Gegenwart von Selektionsmittel MTX kultiviert. Vierunddreißig und siebenundachtzig Tage nach der Transfektion wurde die eGFP-Expression zytometrisch gemessen (zwei Pools gingen zwischen Tag 34 und 87 aufgrund von Kontamination verloren). Die geometrischen Mittelwerte der Fluoreszenzintensität von 10.000 Ereignissen pro Messung wurden für jeden Zellpool berechnet und für beide Zeitpunkte aufgetragen (Abb. 1c). Vierunddreißig Tage nach der Transfektion gab es wenig Unterschied zwischen den Konstrukten. Nur ein CGC-Pool zeigte erhöhte Expressionsniveaus. Siebenundachtzig Tage nach der Transfektion zeigten zwei von vier mit CGC transfizierten Pools und zwei von drei mit CCG transfizierten Pools deutlich höhere eGFP-Werte als alle anderen Pools, die entweder mit der unmutierten Kontrolle oder den verbleibenden Promotorvarianten transfiziert wurden. Diese Beobachtungen deuteten auf eine stabilisierende Wirkung der einzelnen C-41G- oder C-179G-Mutationen auf die eGFP-Expression hin. Um dieses Ergebnis zu konsolidieren, haben wir das Experiment mit beiden Promotorvarianten und mit einer größeren Anzahl von Pools wiederholt. Wir generierten zehn Pools mit CCG bzw. CCC und acht Pools mit CGC (zwei Pools gingen durch Kontamination verloren). Die Zellen wurden wie zuvor kultiviert und von Tag 42 bis Tag 69 nach Transfektion durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 1d und ergänzend Fig. S1 online). Nach 42 Tagen war die eGFP-Expression in vier CCG-Pools im Vergleich zu den CCC-Kontrollpools stark erhöht, während zwei CGC-Pools einen moderaten Anstieg der eGFP-Expression zeigten (Abb. 1d, linke Seite). Nach 69 Tagen zeigten drei CCG-Pools immer noch hohe eGFP-Werte, während die eGFP-Expression der CGC-Pools auf CCC-Kontrollwerte gesunken war (Abb. 1d, rechte Seite). Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden zu jedem Zeitpunkt mit dem nichtparametrischen Stahl-Dwass-Test getestet. Der Alpha-Pegel wurde auf 0,05 eingestellt. Ein signifikanter Unterschied zwischen CCG und CCC wurde am Tag 56 nach der Transfektion beobachtet (p = 0,0305; siehe Ergänzende Abb. S1 online). Zusammengenommen ergeben sich die Ergebnisse der Fig. 1c, d schlugen vor, dass beide Mutationen C-41G und C-179G den Verlust der hCMV-MIE-gesteuerten rekombinanten Genexpression verzögern können.

Die Mutationen C-41G und C-179G hemmen die DNA-Methylierung an der jeweiligen Stelle vollständig, da Guanin nicht methyliert werden kann. Wir fragten uns, ob diese Mutationen auch die Methylierungsniveaus an anderen CpG-Stellen innerhalb von hCMV-MIE beeinflussten. Deshalb, Wir haben die Methylierungsniveaus aller CpG-Stellen in den einzelnen hCMV-MIE-Varianten durch Bisulfitumwandlung in Verbindung mit Next Generation Sequencing gemessen. Zu diesem Zweck extrahierten wir genomische DNA aus den Zellpools des zweiten Experiments 42 und 69 Tage nach der Transfektion und behandelten sie mit Bisulfit, um zwischen methyliertem und nicht methyliertem Cytosin zu unterscheiden. hCMV-MIE DNA wurde mit dem Illumina MiSeq System amplifiziert und sequenziert (Abb. 1e). C-179 war in allen Pools, die entweder mit CCC oder CCG transfiziert waren, am stärksten methyliert, was frühere Beobachtungen mit dem unmutierten hCMV-MIE12 bestätigte. Darüber hinaus beobachteten wir ein ausgeprägtes Methylierungsmuster, das bei allen Pools sehr ähnlich war, sich jedoch in der Gesamtintensität unterschied. Insbesondere unmutierte C-508 und C-41 gehörten durchweg zu den am häufigsten methylierten Stellen. Die Mutation von C-41 in der Promotorvariante CCG, insbesondere die Mutation von C-179 in der Variante CGC, scheint die Methylierung aller CpG-Stellen gleichmäßig zu verringern, anstatt das Methylierungsmuster zu ändern. Als wir die durchschnittlichen Methylierungsniveaus über allen CpG-Standorten für jeden Pool berechneten, entdeckten wir niedrigere Gesamtmethylierung mit den mutierten Förderervarianten (sehen Sie ergänzende Abb. S2 online). Der Unterschied war bei der Variante CGC am ausgeprägtesten, erreichte jedoch beim Stahl-Dwass-Test keine statistische Signifikanz (α = 0,05). Im Durchschnitt nahm die Methylierung mit der Zeit bei allen Konstrukten zu.

Neben dem epigenetischen Promotor-Silencing ist der Verlust von Transgenkopien eine Hauptursache für die Produktionsinstabilität in rekombinanten Zellen20. Um den relativen Beitrag abzuschätzen, haben wir die Plasmidkopiezahlen 42 und 69 Tage nach der Transfektion mittels qPCR gemessen. Die durchschnittliche Plasmid-Kopienzahl nahm mit der Zeit ab, ohne erkennbaren Unterschied zwischen den Konstrukten (siehe ergänzende Abb. S2 online). Interessanterweise wurde die Verteilung der Kopienzahlen in der CGC-Gruppe in Richtung niedrigerer Werte verschoben. Als wir jedoch die statistische Signifikanz mit dem Steel-Dwass-Test testeten, erwiesen sich die Unterschiede zwischen den Konstrukten als nicht signifikant (α = 0,05).

Pools permanent transfizierter Zellen sind sehr heterogene Mischungen von Klonen, die sich in Transgenexpression und Wachstumsrate unterscheiden. Hochproduktive Klone haben tendenziell eine niedrigere Wachstumsrate21. Daher überwachsen niedrig produzierende Zellen, von denen viele nach der Transfektion in der Kultur vorhanden sind, früher oder später fast zwangsläufig die hohen Produzenten. Um diese Verzerrung zu minimieren, untersuchten wir die Mutationen C-179G und C-41G in klonalen Zelllinien. Da wir die Auswirkungen auf die Produktion eines potenziellen kommerziellen Produkts bewerten wollten, wechselten wir zu einem IgG-IL2-Fusionsprotein als Reporter. So wurden Promotorvarianten, die beide Mutationen entweder allein (CGC oder CCG) oder in Kombination (CGG) enthielten, stromaufwärts des Gens der leichten Kette und des Gens der schweren Kette eines IgG-IL2-Expressionsplasmids inseriert.

Expressionsplasmide, die entweder CCG, CGC, CGG oder das unmutierte hCMV-MIE tragen, wurden in CHO-K1-Zellen transfiziert und stabil transfizierte Klone in 384-Well-Platten isoliert. Dreißig klonale Zelllinien pro Konstrukt wurden zufällig ausgewählt und in Sechs-Well-Platten expandiert. Nachdem die Zelllinien ein stabiles Wachstum gezeigt hatten, untersuchten wir ihre Produktivität ungefähr zwei Monate lang, von Tag 68 bis Tag 134 nach der Transfektion. Einige Zelllinien gingen durch Kontamination oder verminderte Lebensfähigkeit verloren, dennoch wurden über den gesamten Zeitraum 23 bis 29 Klone pro Konstrukt untersucht.

Während der gesamten Studie bestimmten wir die IgG-IL2-Konzentrationen in Zellkulturüberständen und die Produktivität pro Zelle und Tag (spezifische Produktivität qP). Zu Beginn (Tag 68) und am Ende (Tag 134) der Studie zeigten mit CGC transfizierte Zelllinien signifikant höhere Titer als die Kontrolltransfektanten (α = 0,05; Abb. 2a). Zelllinien mit bemerkenswert hohen Titern wurden auch unter den CGG-Transfektanten am Tag 68 und unter den CCG- und CGG-Transfektanten am Tag 134 beobachtet. Wenn wir spezifische Produktivitäten zwischen Zelllinien verglichen, die mit verschiedenen Konstrukten transfiziert wurden, machten wir ähnliche Beobachtungen (Abb. 2b). Um die Ungenauigkeit bei der Zellzählung zu kompensieren, haben wir die spezifischen Produktivitäten QP von zwei Passagen zu Beginn (Tag 68-71 und 83-86 nach Transfektion, die die frühesten verfügbaren Datenpunkte darstellen) und drei Passagen am Ende der Langzeitkultivierung (Tag 124-127, Tag 127-131 und Tag 131-134 nach Transfektion) gemittelt. Signifikante Unterschiede zwischen mit CGC oder CCC transfizierten Zelllinien wurden am Ende der Langzeitkultivierung beobachtet (α = 0,05).

Höhere Titer und spezifische Produktivitäten von Zelllinien, die G-179 oder G-41 tragen, deuteten auf eine stabilisierende Wirkung dieser Mutationen auf die hCMV-MIE-gesteuerte Genexpression hin. Um diesen Effekt zu dokumentieren, berechneten wir die prozentuale Veränderung von qP während der Langzeitkultivierung für jede einzelne Zelllinie als das am besten geeignete Maß für ihre Produktionsstabilität (Abb. 2c). Dies war natürlich nur mit Zelllinien möglich, die am Tag 68 nach der Transfektion noch IgG-IL2 produzierten. Ein Kontroll-Transfektant erhöhte seine spezifische Produktivität um 500% und wurde durch Jackknife-Ausreißeranalyse als Ausreißer identifiziert (Abb. 2c, linkes Diagramm). Daher wurde diese Zelllinie von der weiteren Analyse ausgeschlossen (Abb. 2c, rechter Plot). Zelllinien, die entweder mit CGC oder CCG transfiziert wurden, waren signifikant stabiler als Kontrollzelllinien, die mit CCC transfiziert wurden (α = 0,05). Überraschenderweise unterschied sich die Doppelmutante CGG nicht von der Kontrolle.

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