Rozvoj Chitosan Nanočástic jako Stabilní Drug Delivery Systém pro Bílkoviny/siRNA

Abstrakt

Chitosan nanočástic (CS NPs) vykazují dobré fyzikálně-chemické vlastnosti jako drug delivery systémy. Cílem této studie je určit modulaci preparačních parametrů na fyzikálních charakteristikách a koloidní stabilitě CS NPs. CS NP byly vyrobeny iontovou interakcí s dextran sulfátem (DS) před stanovením jejich stability při skladování. Nejmenší CS NPs nm s povrchem starosti mV byly vyrobeny, když CS a DS byly smíchány při pH 4 a DS : CS hmotnostní poměr 0,5 : 1. Účinnost zachycení 98% byla dosažena, když byla BSA/siRNA vložena do nanočástic. Výsledky také ukázaly, že velikost částic a povrchového náboje CS NPs byly mírně změnila až 2 týdny při uchovávání při 4°C. Větší velikosti částic a povrchového náboje byly získány s rostoucí koncentrací DS. Závěrem lze říci, že NP byly dostatečně stabilní, pokud byly udržovány při 4°C a schopné přenášet a chránit protein.

1. Úvod

endogenní peptidy, bílkoviny a oligonukleotidy patří mezi hlavní léky, které přitahují velkou pozornost kvůli jejich velkému potenciálu při léčbě chronických onemocnění . Extrémní prostředí lidského těla in vivo však vždy omezovalo terapeutické aplikace těchto látek . Polymerní nanočástice přitahovaly velkou pozornost jako doručovací systémy díky své schopnosti překonat fyziologické bariéry a chránit a zaměřit naložené látky na specifické buňky . Přirozeně se vyskytující polymery, jako je chitosan (CS), byly studovány za vzniku nanočástic . CS je biologicky rozložitelný polysacharid a je odvozen z deacetylace chitinu . Kromě jeho biokompatibility přispívají nízká toxicita, hemostatické a bakteriostatické vlastnosti také k jeho různým aplikacím ve farmaceutické oblasti . Bylo zkoumáno několik aniontů pro zesítění CS, jako je síran sodný a dextran sulfát (DS). DS je schopen modifikovat účinnost zachycení proteinů a siRNA (EE) bez použití vytvrzovacích činidel a řídit rychlost uvolňování léčiva díky vysoké hustotě náboje . Kromě toho, že DS je levný materiál, produkuje mechanicky stabilnější nanočástice ve srovnání s tripolyfosfátem pentasodným (TPP).

Několik studií hlásil jedinečné vlastnosti chitosan nanočástic (CS NPs) pomocí DS. Nicméně, odlišení předoperační parametry, na jejich fyzikální vlastnosti, je stále ještě není zcela prozkoumán, například vlivem DS stérické překážky na elektrostatické přitažlivosti mezi CS a BSA . Kromě toho je determinant úspěšného systému podávání léků závislý na jeho fyzikálních vlastnostech a stabilitě. Proto cílů této studie byly modulovat parametry preparativní získat nanosized částice CS NPs a určit jejich koloidní stabilitu při různých skladovacích teplotách a v různých pozastavení média.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály

nízkomolekulární chitosan (70 kDa s mírou deacetylation 75%-85%), kyselina octová, roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (PBS), bovinní sérový albumin (BSA, 46 kDa), a Bradford reagent byl zakoupen od Sigma-Aldrich Inc., USA. Dvouvláknová siRNA (sense: 5′-GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) byla zakoupena od Thermoscientific Dharmacon v USA. Dextran sulfát (DS) byl zakoupen od společnosti Fisher Scientific ve Velké Británii. Protein ladder (Vysoký rozsah), Laemmli sample buffer, 10x tris/glycine/dodecyl sulfátu sodného pufru, amonium persulfate, tetramethylenediamine (TEMED), 2% bis solution, a 40% roztok akrylamidu byly zakoupeny z Bio-Rad, USA. Tris-HCl pufr byl získán z Invitrogen, USA. Všechny ostatní použité chemikálie byly analytické kvality.

2.2. Příprava Prázdné a BSA-Naložený CS NPs

CS a DS roztoku byly rozpuštěny v 1% v/v kyselině octové a destilovanou vodou, v tomto pořadí. pH CS roztoku bylo upraveno na pH 4 přidáním 1 M NaOH nebo 1 M HCl. Roztok DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, o 0,2%, a 0,25% w/v) byl po kapkách přidán do CS roztok (0,1% w/v) podle magnetické míchání (WiseStir Digitální Vícebodové Magnetické Míchadlo MS-MP8, DAIHAN Vědecké, Korea) při 250 ot / min po dobu 15 min formě nanočástic. Všechny vzorky byly vyrobeny ve trojím vyhotovení. Výsledné nanočástice byly umyté a sklizené ultracentrifugation (Optima L-100 XP Ultracentrifuge s rotorem NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) dvakrát v 12 500 ot / min po dobu 15 min při 10°C. Pro BSA sdružení do CS NPs, BSA byl rozpuštěn v CS roztok (0,1% w/v, pH 4) vypracovat konečné koncentraci 1 mg/mL. CS NP naložené BSA byly poté připraveny výše uvedenou metodou. Pro siRNA sdružení do CS NPs, 3 µL siRNA (15 µg/µL) v deionizované vody bylo přidáno do DS řešení (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, a 0,25% w/v) před přidáním to po kapkách CS roztok (0,1% w/v).

2.3. Elektroforetická Pohyblivost Studie

Elektroforetické mobility (měření) CS Np byly provedeny s Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) a byla měřena proti čekací doba. Každý vzorek byl analyzován ve trojím vyhotovení.

2.4. Nanočástice Charakterizace

velikost Částic, povrchového náboje, a index polydispersity (PDI) čerstvě připraveného CS NPs byly měřeny pomocí Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), na základě Foton Korelační Spektroskopie (PCS) techniky. Během analýzy nebyla provedena žádná ředění. Každý vzorek byl analyzován ve trojím vyhotovení. Měření byla provedena při 25°C.

2.5. Morfologická Analýza

Morfologická charakterizace uvolněn CS NPs, BSA/siRNA načtení CS NPs (DS : CS hmotnostní poměr 0,5 : 1, 1 : 1) bylo provedeno pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Nizozemsko).

2.6. BSA/siRNA Zachycení Účinnost

BSA/siRNA načtení CS NPs byly odděleny z roztoku o ultracentrifugation (Optima L-100 XP Ultracentrifuge s rotorem NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) při 14000 ot / min po dobu 30 min. Supernatanty získané centrifugací byly dekantovány. BSA obsah supernatant byl analyzován na UV-Vis spektrofotometru při 595 nm (U V-1601; Shimadzu, Japonsko) pomocí Bradford protein assay dle instrukce výrobce. obsah siRNA v supernatantu byl analyzován UV-VIS spektrofotometrem při 260 nm. Vzorky byly připraveny a měřeny ve trojím vyhotovení. Účinnost zachycení BSA / siRNA (EE) byla vypočtena pomocí následující rovnice:

2.7. Stabilita CS NPs

čerstvě připravených CS NPs (Vyrobeno z 0,05% a 0,1% w / v roztoku DS a CS, resp.) byly centrifugovány při 12 500 ot / min po dobu 15 minut před uskladněním. Po ultracentrifugaci byly získané pelety resuspendovány buď v destilované vodě (měřeno pH 6,6), nebo v PBS pH 7,4. Velikosti částic a povrchového náboje byla měřena v předem stanovených skladování doba trvání (0, 1, 2, 3, 5, 8, a 14 dní), a na okolní teplotě nebo 4°C.

2.8. Studie uvolňování léčiva in Vitro

uvolňování BSA / siRNA bylo stanoveno z CS NPs s nejvyšším EE (poměr DS : CS 1: 1, EE = 98% ± 0,2 a resp.). BSA/siRNA načtení CS NPs byly pozastaveny v Tris-HCl pufru (pH 7.4, 4 mL) a umístěna na magnetické míchačce se za stálého míchání, rychlost 100 ot / min při 37°C (MS MP8 Moudrý Míchejte, Wertheim, Německo) po dobu 48 h při 37°C. V předem stanovených časových intervalech (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, a 48 h), vzorky byly centrifugovány při 14 000 ot / min po dobu 30 min při 10°C. Pak, supernatant byl dekantován a nahrazeny ekvivalentní objem čerstvý pufr. Množství uvolněného BSA/siRNA v supernatantu byla analyzována pomocí UV-Vis spektrofotometru (U V-1601; Shimadzu, Japonsko) při vlnové délce 280 a 260 nm, respektive.

2.9. BSA Integrity

integrity BSA propuštěn z CS NPs byla určena pomocí SDS-PAGE (12% řešení a 10% stacking gel) pomocí Mini-Protein System (Bio-Rad, USA). Vzorky BSA byly smíchány s laemmli vzorkovacím pufrem v poměru 1 : 1 a zahřívány při 95°C po dobu 5 minut. Vzorky (15 µL) byly vloženy do jamek a gel byl spuštěn pomocí Mini-Protein System Tetra Cell při konstantním napětí 150 V po dobu 90 min s pufr obsahující 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS při pH 8.3. Vzorek kapely byly obarveny za 40 min s 0,1% Coomassie blue roztoku obsahujícího 40% kyseliny octové a 10% methanol, následuje barvení přes noc s roztokem 40% kyselinou octovou a 10% methanol.

2.10. Statistická analýza

všechna data byla prezentována jako průměr ± směrodatná odchylka (SD). Statistická analýza (ANOVA test a tukeyova posthoc analýza) byla provedena pomocí statistického balíčku pro sociální program (SPSS) verze 15. Hodnota < 0,05 vykazovala významný rozdíl mezi průměrem testovaných skupin.

3. Výsledky

3.1. Velikost částic a povrchový náboj

Obrázek 1(a) ukazuje výsledky elektrické mobility () proti čekací době. Z grafu bylo možné pozorovat, že zbývající plošina a konstanta po 30 min. To ukazuje, že vytvoření stabilní elektrické dvouvrstvé vrstvy (e.d.l.) nebylo okamžité, ale vyžadovalo několik okamžiků. Účinky mezi koncentrací CS a konečnými koncentracemi DS na velikost CS NPs jsou uvedeny na obrázku 1(b). Bylo pozorováno, že většina z CS NPs s velikostí menší než 500 nm byly získány na nízké CS koncentraci (0,1% w/v). Koncentrace DS také ovlivnila velikost nanočástic (). Rostoucí trend ve velikosti částic by mohl být pozorován se zvyšováním koncentrace DS z 0,05 na 0,25% w / v. Obecně platí, že koncentrace DS 0.05% w / v (nízká koncentrace) produkovaly nanočástice s velikostí částic menší než 500 nm. Na rozdíl od toho byly získány velké nanočástice (>1000 nm), když byla koncentrace obou polymerů zvýšena na 0,25% nebo vyšší. Na základě výsledků byly pro následující studie vybrány koncentrace DS od 0, 05 do 0, 20% hmotnostních. Kromě toho, zvýšení DS : CS poměr hmotnosti (vyšší hustota záporných nábojů z DS v systému) vedlo ke zvýšení velikosti částic, ale pokles částic povrchový náboj (Tabulka 1 (viz výše)). Protože hmotnost CS překročila hmotnost DS, byla získána kladná hodnota + 56,2 ± 1,5 mV. Povrchový náboj částic se však snížil na-mV, když bylo přidáno více záporně nabitých DS. Neustále klesal, když hmotnostní poměr DS: CS dosáhl 2,5: 1. Očekávalo se, že to bude způsobeno přebytkem molekul DS nahromaděných na povrchu nanočástic.

()

(b)

(a)
(b)

Obrázek 1

Elektroforetické mobility v závislosti na čase (a) a vliv konečné koncentrace CS a DS na velikosti částic nanočástice (b), .

Tabulka 1 (níže) ukazuje, že DS 0,2% w / v měl největší velikost částic poté, co byl naložen BSA. Velikost částic byla nm. Velikost částic pro DS při koncentraci 0,1 A 0.15% w / v byl také větší než ty prázdné (). Na druhé straně byly pozorovány vyšší kladné hodnoty povrchového náboje pro nanočástice naložené BSA ve srovnání s prázdnými. To bylo pozorováno u všech koncentrací DS. Navíc vyšších hodnot EE lze dosáhnout zvýšením hmotnostního poměru DS : CS nad 0,5: 1. EE nanočástic při hmotnostním poměru DS : CS 1 : 1, 1,5 : 1 a 2: 1 bylo%, % a%. Nejvyšší EE bylo dosaženo při hmotnostním poměru DS : CS 1: 1 (Tabulka 1 (níže)).

Tabulka 2 ukazuje, že DS 0.2% hmotnostních / v mělo největší velikost částic (900 ± 60 nm) poté, co bylo naloženo siRNA. siRNA naložené CS NPs při různých koncentracích DS (0,05, 0,1, 0,15 a 0,2% w/v) vykazovaly menší velikost částic. EE nanočástic při hmotnostním poměru DS : CS 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, a 2: 1 bylo %,%, % a%.

3.2. Morfologie

obrazy CS NPs byly získány TEM (Obrázek 2). Obrázky 2(a) a 2 (b) ukazují, že nezatížené CS NPs vykazovaly sférickou strukturu. Obrázky ukázaly, že nanočástice generované ze siRNA (obrázky 2 (e) a 2 (f)) vykazovaly nepravidelnou morfologii; nanočástice naložené BSA však vykazovaly prodloužené morfologie (obrázky 2 (c) a 2 (d))).

()

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Obrázek 2

TEM snímky CS NPs. a) A b) vyložené CS NPs při 0,5 : 1 a 1: 1, c) A d) BSA naložené CS NPs při 0,5: 1 a 1 : 1, a (e) a (f) siRNA naložené CS NPs při 0,5: 1 a 1 : 1, resp. Všechny snímky byly pořízeny při zvětšení 60 kX.

3.3. Skladovací Stabilita CS NPs

Jak nanočástice vyrobené z 0,05 a 0,10% w/v DS jsou zvýšené ve velikosti v průběhu času, jak je znázorněno na Obrázku 3(a) při skladování při teplotě okolí. Významné zvýšení velikosti částic bylo pozorováno po 14. dni skladování, zejména pro 0,05% w / v DS. Předpokládalo se, že to bylo způsobeno tvorbou agregátů. Toto zjištění bylo potvrzeno výsledky povrchového náboje, které ukázaly pokles povrchového náboje na téměř neutrální. V kontrastu, když byly skladovány při 4°C, velikosti částic a povrchového náboje zůstala nezměněna až 14 dní pro nanočástice vyrobené z 0.10% w/v DS. Byla pozorována mírná změna pro 0, 05% w / v DS (obrázky 4(a) a 4(B)). Na druhé straně, když byly tyto nanočástice suspendovány v PBS pH 7,4, byly všechny formulace agregovány na větší velikosti větší než 1 µm s hodnotami PDI vyššími než 0,5. Jejich povrchové náboje částic byly také téměř neutrální, v rozmezí od + 0.2 až + 2,5 mV.

()

(b)

(a)
(b)

Obrázek 3

(a) velikost Částic a (b) povrchu starosti CS NPs připraven na 0,05 a 0,01% w/v DS řešení a uloženy při teplotě 25°C. Nanočástice byly suspendovány v destilované vodě (pH v rozmezí 6-7), .

()

(b)

(a)
(b)

Obrázek 4

(a) velikost Částic a (b) povrchu starosti CS NPs připraven na 0,05 a 0,10% w/v, a skladuje se při 4°C. Nanočástice byly suspendovány v destilované vodě (pH v rozmezí 6-7), .

3.4. BSA in Vitro uvolňování a integrita

obrázek 5(a) ukazuje, že uvolňování BSA by mohlo být rozděleno do dvou fází na základě rychlosti uvolňování. V první fázi, BSA byl rychle propuštěn z CS NPs a ukázal výbuch uvolnění v prvních 6 h. To mělo za následek 45% ± 5 kumulativní uvolňování BSA. Ve druhém stupni byla BSA pomalu uvolňována od 6 h do 48 h, což mělo za následek kumulativní uvolnění BSA více než 60%. Integrita BSA uvolněná z CS NPS byla hodnocena stránkou SDS a je znázorněna na obrázku 5(b). Pásy pozorované potvrdil, že BSA, který vydržel zatížení a procesy uvolňování při 37°C po dnech 1 a 2 nebyly odlišné od čerstvě připravené BSA standardů. Proto lze vyvodit závěr, že BSA zůstala ve své původní formě v CS NPs za experimentálních podmínek.

()

(b)

(a)
(b)

Obrázek 5

(a) vydání profilu BSA načtení CS NPs v DS : CS poměru 1 : 1 při pH 7.4, . (b) SDS-PAGE analýzy BSA propuštěn z CS NPs: (M) SDS-PAGE standards (BIO-RAD); (O) BSA standard 1 mg/mL; (B) BSA standard 0,2 mg/mL; (C) prázdné; (D) vyložení CS NPs; (E) a (F) BSA propuštěn z CS NPs (DS : CS poměr 1 : 1) ve dnech 1 a 2.

3.5. siRNA in Vitro Release

obrázek 6 ukazuje, že uvolňování siRNA může být rozděleno do dvou fází na základě rychlosti uvolňování. V první fázi, siRNA byla rychle uvolněna z CS NPs a vykazovala uvolnění výbuchu v prvním 6 h. Výsledkem bylo 58% ± 5 kumulativního uvolnění siRNA. Ve druhém stupni se siRNA pomalu uvolňovala od 6 h do 48 h, což mělo za následek kumulativní uvolnění BSA více než 85%.

Obrázek 6

uvolnění profilu siRNA načtení CS NPs v DS : CS poměru 1 : 1 při pH 7.4, .

4. Diskuse

metoda používaná k výrobě CS NPs v této studii je mírné procesu, a to umožňuje kontrolu velikosti částic tím, že mění určité parametry, jako je například koncentrace přidané soli, viskozita, množství nonsolvent, a molekulovou hmotnost polymeru. Tato studie byla zahájena na šetření, k získání informací o elektrické stavu ionizovatelné skupiny CS NPs tím, že se stanoví doba stabilizace e.d.l. Tento krok je důležité získat spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Získané údaje naznačují, že vznik stabilního e. d.l. během přípravy nanočástic vyžadovalo několik okamžiků po zastavení míchání. Tyto momenty byly potřebné k tomu, aby elektrolyty pronikly směrem k jádru částic. Tím pádem, čekací doba 40 min bylo zapotřebí, než bylo možné přesně změřit CS NPs. Tento nález byl podobný CS-tripolyfosfátu (CS-TPP) NPs, který navrhl stejnou čekací dobu .

byla také provedena studie ke stanovení vlivu koncentrace polymeru na tvorbu částic. Studie byla zaměřena na stanovení rozsahu polyelektrolyty koncentrace na výrobu nanočástic s požadovanou velikost. Pro studium účinků různých koncentrací CS a DS na tvorbu nanočástic byly připraveny CS a DS roztok 0,1, 0,25 a 0,5% w / v. Variabilní objemy řešení DS (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, a 10 mL) byly smíchány s 5 mL každé koncentrace CS (0, 1-0, 5% w/obj). Byla vypočtena konečná koncentrace CS A DS a velikosti vzorků byly kategorizovány buď jako 100-500, 501-1000 nebo více než 1000 nm. Bylo zjištěno, že velikost částic byla ovlivněna koncentrací DS. Toto zjištění potvrdilo výsledky CS-TPP NPs . Obecně je požadovaná velikost nanočástic omezena mezi 100 a 1000 nm. Předchozí studie však ukázaly, že naložené nanočástice by normálně produkovaly větší velikost než prázdné. Velikost pod 500 nm je proto příznivá.

Dále výsledky ukázaly, že pouze DS koncentraci 0,05% w/v byl schopen vyrábět nanočástice s velikostí částic méně než 500 nm, jak je znázorněno v Tabulce 1. Očekávalo se, že když byly oba polymery v nízkých koncentracích, přidání DS do CS vedlo k malým koacervátovým jádrům. Na rozdíl od toho měly velké koacerváty, které přesáhly velikost 1000 nm, tendenci se tvořit, když koncentrace obou polymerů vzrostla na 0,25% nebo více. Chitosan má schopnost spontánně tvoří koacervát je v důsledku interakce opačně nabitých polyelektrolyty tvoří polyelektrolytu komplex s omezenou rozpustnost. Směs vysoké koncentrace DS s CS je proto pravděpodobnější, že ovlivní zapletení CS řetězců a rozpustnost výsledného komplexu. Výsledkem bude vysoký stupeň komplexace a koacervátu . Snížená viskozita při nižší koncentraci CS také vedla k lepší rozpustnosti. To umožnilo účinnější interakci mezi kationtovými CS a opačně nabitými ionty, a tak byla vytvořena menší velikost částic . Navíc zvýšení a nadbytek molární hmotnosti použitého polyanionu vedlo k větším částicím, protože byly vytvořeny vysoce neutralizované komplexy a měly tendenci se flokulovat . V této studii byl povrchový náboj částic nanočásticového systému závislý na hmotnostním poměru DS a CS. Bylo zjištěno, že povrchový náboj částic se zvyšuje s poklesem poměru. Tento vztah by mohl být užitečný při získávání požadované hustoty povrchového náboje částic pro usnadnění adhezních a transportních vlastností nanočástic.

V této studii, začlenění BSA do CS NPs bylo dosaženo tím, že prostě míchání kyselé CS roztok obsahující rozpuštěný BSA molekuly s DS řešení při pokojové teplotě bez přidání stabilizátoru. BSA se často používá jako modelový protein, protože zahrnuje obecnou charakteristiku jiných proteinů a je biokompatibilní pro člověka. Bylo zjištěno, že CS NP byly po načtení pomocí BSA poměrně větší. Velikost částic se měla zvýšit, když byla BSA úspěšně naložena do nanočástic. Tento trend může být pravděpodobně způsoben molekulovou hmotností a velikostí přidaných molekul BSA. Tyto velké velikosti částic mohou omezit jejich použití při dodávání bílkovin. Nanočástice 150-300 nm se nacházejí hlavně v játrech a slezině . Kromě toho je podle některých zpráv “ideální” požadavek na velikost nanočástic vyvinutých pro léčbu rakoviny mezi 70 a 200 nm . I když nanočástic by měla být větší než 150 nm, aby přes endoteliální bariéry, v literatuře se vždy uvádí pronikání částic větších než limity fenestrace. Fenestrace a vaskulatura mohou podstoupit modifikaci za různých patologických stavů .

například, růst nádoru se indukuje rozvoj neovasculature vyznačuje diskontinuální endotelem s velkými fenestrace z 200-780 nm . Kromě toho bylo pozorováno, že povrchový náboj částic nanočástic zatížených BSA byl vyšší než prázdný. To může být způsobeno kationtovou charakteristikou BSA, pokud je přítomna v kyselém stavu. Kladné náboje z molekul CS a BSA proto přispěly k vyšší hodnotě povrchového náboje částic pro naložené nanočástice.

Kladně nabité kationtové polymery mohou účinně vázat a chránit nukleové kyseliny jako DNA, oligonukleotidy , a siRNA . V této studii bylo inkorporace siRNA do CS NPs dosaženo jednoduchým smícháním kyselého CS roztoku s DS roztokem obsahujícím siRNA při pokojové teplotě. Bylo zjištěno, že velikost částic CS NPs byla po načtení siRNA poměrně menší. Menší velikost CS NPs naloženo s siRNA může být vzhledem k neutralizaci záporného náboje nukleových kyselin pomocí kationtového polymeru, což v kondenzované menší velikosti nanočástic. SiRNA načtené CS NPs také vykazovaly vyšší potenciál Zeta než prázdné CS NPs, po stejném trendu jako u BSA načtených CS NPs.

v ideálním případě by úspěšný doručovací systém měl mít vysoký stupeň sdružování léků. SiRNA naložený CS NPs vykazoval vyšší účinnost zachycení (<90%) pro všechny hmotnostní poměry DS : CS. Účinnost zachycení nanočástic při hmotnostním poměru DS : CS 1: 1, 1,5 : 1 a 2: 1 byl vyšší než hmotnostní poměr 0,5: 1. Tento jev byl pravděpodobně způsoben vyšším podílem DS prezentovaných v nanočásticích. Jak přidalo více DS, usnadnilo by to zachycení více BSA do nanočástic. To lze vysvětlit skutečností, že BSA je zwitterionová molekula. Na pH, složení média 3.5–4.0, rozpustnost BSA by mohla být vysoce důsledku nárůstu kladné náboje posedlý . BSA by tak byla schopna elektrostaticky připojit a stabilně načíst do nanočástic. V kyselém roztoku by BSA mohla mít kladný náboj a soutěžit s CS o elektrostatickou interakci s DS. Toto zjištění bylo potvrzeno s vyšší pozitivní povrchu poplatky BSA načtení CS NPS ve srovnání s vyloženo ty. Kromě toho existují na BSA multiiontová místa a tato funkce by mohla usnadnit začlenění BSA do nanočástic. Toto zjištění se liší od zjištění s CS-TPP NPs .

ve studii byla přítomna elektrostatická interakce mezi BSA a CS namísto BSA a TPP. Bylo také navrženo, aby se BSA rozpustil v roztoku s pH vyšším, než je jeho izoelektrický bod, aby BSA měla záporný náboj a interagovala s kladně nabitými molekulami CS. Toto zjištění proto prokázalo, že elektrostatická interakce je hlavním faktorem přispívajícím k podpoře začlenění BSA do nanočástic buď interakcí CS-proteinu nebo interakcí DS-proteinu.

TEM umožňuje vizualizaci jednotlivých nanočástic v nanoměřítku a poskytuje informace o velikosti i morfologii. Morfologie částic je důležitým faktorem pro koloidní a chemickou stabilitu a bioaktivitu nanočástic. siRNA loaded CS NPs vykazoval nepravidelnou morfologii; nicméně, BSA loaded CS NPs vykazoval prodlouženou morfologii. To by mohlo být způsobeno větší velikostí BSA, která se může zamotat nebo působit jako štít vůči CS, čímž se omezuje Celková expozice CS ve struktuře.

stabilní profil CS NPs při skladování je také důležitý. Tyto informace by mohly poskytnout pohled na stabilitu nanočástic za různých médií a teploty. Stabilita nanočástic byla zkoumána hodnocením jejich variability střední velikosti částic a povrchového náboje v průběhu času. Nejprve byly nanočástice resuspendovány v destilované vodě při pH 6,6, která byla filtrována filtrem 0,2 µm, aby se odstranily možné kontaminanty přítomné ve vodě. Pro tuto studii byly testovány pouze nanočástice vyrobené z 0, 05 a 0, 10% w/v DS. Jiné koncentrace DS nebyly stanoveny kvůli zvýšené velikosti částic po centrifugaci. Velikost částic byla až nm a nm pro 0,15% a 0,20% w / v DS. Přírůstek velikosti částic může v důsledku CS NPs sami narušit a přijít o jejich kulovitý tvar ve vodném prostředí, a v důsledku toho je střední průměr částic by vzniknout jako reakce na tento eroze . Kromě toho povrchové náboje částic pro nanočástice vyrobené z obou koncentrací v průběhu času klesaly. Bylo podezření, že CS může být degradován ve vodném prostředí, i když v nepřítomnosti lysozymů. Výsledky ukázaly, že CS NP byly stabilnější, když byly skladovány při teplotě 4°C, protože jejich velikost částic a povrchová náplň byly nezměněny nebo mírně změněny až do 14 dnů. Výsledky rovněž naznačují, že CS NPs by neměly být skladovány při okolní teplotě, protože jsou náchylné k degradaci. Výsledky tedy naznačují, že CS NPs uloženy při pokojové teplotě, jsou náchylnější k degradaci než ty, které byly skladovány v chladném prostředí. Bylo to pravděpodobně způsobeno chladným prostředím, které může zpomalit kinetický pohyb nanočástic. Nanočástice by si tedy mohly udržet svůj sférický tvar a eroze by byla méně pravděpodobná. Navíc bylo pozorováno, že tyto nanočástice byly agregovány v PBS při pH 7,4. To může být přičítáno nižšímu povrchovému náboji nanočástic v PBS, téměř neutrální. Povrchová nálož částic, která klesla na nulu, může naznačovat, že CS NPs byl zrušen poplatek fosfátovými skupinami PBS. Neutrální nabitý stav těchto nanočástic může způsobit ztrátu intra – a intermolekulární síly, důležité pro udržení nanočástic jednotlivě. V důsledku toho mohou tyto nenabité nanočástice začít agregovat a destabilizovat koloidní systém. Na rozdíl od PBS, destilovaná voda může poskytnout mnoho vodíkových iontů tvořit vodíkové vazby, které mohou pomoci při lámání agregace nanočástic v interakci s ionizovatelné skupiny CS NPs.

studie uvolňování BSA a siRNA z CS NPs in vitro byla provedena v pufru Tris-HCL. Uvolnění BSA a siRNA by mohlo být rozděleno do dvou fází na základě rychlosti uvolňování. V první fázi byla droga rychle uvolněna z CS NPs. Uvolňování BSA a siRNA v této fázi může zahrnovat difúzi BSA / siRNA vázané na povrchu částic. Ve druhém stupni se BSA / siRNA uvolňovala pomalu v důsledku bobtnání nebo degradace polymeru. Zbývající BSA / siRNA v CS NPs by nebyla zcela uvolněna, dokud by částice nebyly zcela erodovány nebo rozpuštěny v uvolňovacím médiu. To mohlo být způsobeno interakcí mezi zbývající BSA / siRNA a volnou aminoskupinou na CS segmentech . Kromě toho, integrovaný systém, který byl dříve popisován jako bytí moci být formulovány za mírných podmínek ujistil, že stabilita proteinů načten do CS NPs byl neporušený, jak je stanoveno pomocí SDS-PAGE.

5. Závěry

souhrnně tato studie ukazuje, že koncentrace CS a DS a pH byly parametry, které regulují velikost částic a povrchový náboj CS NPs. Nanočástice menší než 500 nm by mohly být získány při hmotnostním poměru DS : CS 0,5: 1 při pH 4. V případě zachycení BSA mají nanočástice s vyšším hmotnostním poměrem DS : CS vyšší účinnost zachycení o více než 88%. Nejvyšší procento dosažené účinnosti zachycení bylo při 0, 10% w / v DS (poměr DS: CS 1: 1). CS NP naložené siRNA však vykazovaly vysokou účinnost zachycení (>90%) pro všechny poměry DS: CS. Bylo zjištěno, že skladovací teplota a suspendující médium jsou faktory, které by mohly ovlivnit stabilitu CS NPs. CS NP byly labilní a mají tendenci destabilizovat při okolní teplotě, ale zadržují toto labilní chování, když bylo poskytnuto chladné prostředí (2-4°C). Kromě toho, CS NPs měl lepší stabilitu v destilované vodě než v PBS, což může být způsobeno vodíkovými vazbami, které se vytvořily mezi molekulami vody a ionizovatelnými skupinami CS NPs.

střet zájmů

autoři prohlašují, že v současném výzkumu neexistuje žádný osobní ani finanční střet zájmů.

Potvrzení

autoři vděčně na vědomí “Dana Lonjakan Penerbitan” Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) pro financování a podporu aktuální výzkumný projekt.