タンパク質/siRNAの安定した薬物送達システムとしてのキトサンナノ粒子の開発

概要

キトサンナノ粒子（CS NPs）は、薬物送達システムとして良好な物理化学的性質を示す。 本研究の目的は、CS NPsの物理的特性とコロイド安定性に関する分取パラメータの変調を決定することです。 ＣＳＮＰは，貯蔵安定性を決定する前に硫酸デキストラン（Ｄ ｓ）とのイオン相互作用によって作製した。 MVの表面電荷を有するnmの最小のCS NPsは、CSとDSがpH4で混合され、DS：CS質量比が0.5：1であったときに生成された。 ＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡをナノ粒子中に装填したときに９ ８％の捕捉効率が達成された。 結果はまた、ＣＳ Ｎｐの粒径および表面電荷が、４℃で保存されたときに２週間までわずかに変化したことを示した。 結論として、NPsは4°Cで保たれ、蛋白質を運び、保護することができたとき十分に安定していた。

1. はじめに

内因性ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドは、慢性疾患の治療における大きな可能性のために多くの注目を集める主要な薬 しかし、人体の極端なin vivo環境は、常にこれらの物質の治療上の適用を制限している。 高分子ナノ粒子は、生理的障壁を克服し、負荷された物質を特定の細胞に保護し、標的とする能力のために、送達系として多くの注目を集めている。 キトサン（Ｃ ｓ）のような天然に存在するポリマーはナノ粒子を形成するために研究されている。 CSは生分解性多糖類であり、キチンの脱アセチル化に由来する。 生体適合性とは別に、低毒性、止血性、および静菌性も医薬品分野での様々な用途に貢献しています。 硫酸ナトリウムと硫酸デキストラン（Ｄ ｓ）のようなＣＳを架橋するためにいくつかのアニオンを調べた。 DSは堅くなる代理店の使用なしで蛋白質およびsiRNAの捕捉の効率(EE)を変更し、高い充満密度による薬剤解放の率を制御できます。 DSは安価な材料であることに加えて、トリポリリン酸五ナトリウム（TPP）と比較して機械的により安定なナノ粒子を生成する。

いくつかの研究では、DSを用いたキトサンナノ粒子（CS NPs）のユニークな特徴が報告されていました。 しかし，それらの物理的特性に対する分取パラメータの変調は，ＣＳとＢＳＡ間の静電引力に対するＤ ｓ立体障害の影響など，まだ完全には研究されていない。 さらに、成功した薬物送達システムの決定要因は、その物理的特性および安定性に依存する。 したがって、本研究の目的は、CS NPsのナノサイズ粒子を得るために分取パラメータを調節し、異なる貯蔵温度および様々な懸濁媒体中でのコロイド安定性を

2. 材料および方法

2.1. 材料＜５ ２ ７ ５＞＜８ １ １ ９＞低分子量キトサン（７ ０ｋＤａ、脱アセチル化度７ ５％〜８ ５％）、酢酸氷河、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ、４ ６ｋＤａ）、およびＢｒａｄｆｏｒｄ試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．、アメリカ。 二本鎖ｓｉＲＮＡ（センス：５’−ＧＡＵＵＡＵＧＵＣＣＧＧＵＵＡＵＧＵＡＵＵ−３’、アンチセンス：３’−ＵＡＣＡＵＡＡＣＣＧＧＡＣＡＵＡＡＵＣＵＵ−５’）は、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，ＵＳＡから購入した。 Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ（Ｄ Ｓ）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫから購入した。 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｄｄｅｒ（Ｈｉｇｈ ｒａｎｇｅ）、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液、１ ０ｘ ｔｒｉｓ／ｇｌｙｃｉｎｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ緩衝液、過硫酸アンモニウム、テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、２％ｂｉｓ溶液、および４ ０％ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ溶液をＢｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡから購入した。 Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡから得た。 使用された他のすべての化学物質は分析グレードのものであった。

2.2. ブランクおよびBSA負荷CS Np

の調製CSおよびDS溶液をそれぞれ1％v/v酢酸および蒸留水に溶解した。 ＣＳ溶液のｐＨを、１Ｍ Ｎａｏｈまたは１Ｍ Ｈｃｌを添加することによってｐＨ４に調整した。 DS溶液(0.05%,0.1%,0.１％ｗ／ｖ）中に２ ５ ０ｒｐｍで１ ５分間、磁気撹拌（Ｗｉｓｅｓｔｉｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｔｉｒｒｅｒ ＭＳ−ＭＰ８、ＤＡＨＡＮ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋｏｒｅａ）下で滴下してナノ粒子を形成した。 全ての試料を三重にした。 得られたナノ粒子を洗浄し、１ ０℃で１ ２ ５ ０ ０ｒｐｍで２回、１ ５分間、超遠心分離（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ−１ ０ ０ＸＰ超遠心分離、ｒｏｔｏｒ ＮＶ７ ０.１、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）により回収した。 次いで、ＢＳ ａ負荷ＣＳ Ｎｐを上記の方法により調製した。 ＣＳ ＮｐへのｓｉＲＮＡ会合のために、脱イオン水中の３μ ｌのｓｉＲＮＡ（１ ５μ ｇ／μ ｌ）をＤＳ溶液に添加した。(0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, １％ｗ／ｖ）を添加する前に、この滴下をＣＳ溶液（０．

2.3. 電気泳動移動度試験＜５ ２ ７ ５＞＜８ １ １ ９＞ＣＳ Ｎｐの電気泳動移動度測定（）は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて実施し、待ち時間に対して測定した。 各試料を三重に分析した。

2.4. 新たに調製したＣＳ Ｎｐのナノ粒子特性評価＜５ ２ ７ ５＞＜８ １ １ ９＞粒径、表面電荷、および多分散指数（ＰＤＩ）を、光子相関分光法（ＰＣＳ）技術に基づいて、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて測定した。 分析中に希釈は行わなかった。 各試料を三重に分析した。 測定は、２ ５℃で行った。＜２ ５ ７ ８＞＜６ ２ ５ ４＞２． 形態素解析

無負荷CS NPs、BSA/siRNA負荷CS NPsの形態学的特性評価(DS:CS重量比0.5:1,1 : １）は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、Ｔｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｔ、ＦＥＩ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて実施した。

2.6. ＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡ捕捉効率＜５ ２ ７ ５＞＜８ １ １ ９＞ｂｓ Ａ／ｓｉＲＮＡを装填したＣＳ Ｎｐを、１ ４ ０ ０ ０ｒｐｍで３ ０分間、超遠心分離（ｏｐｔｉｍａ Ｌ−１ ０ ０ＸＰ超遠心分離、ローター ＮＶ７ ０． 遠心分離から回収した上清をデカントした。 上清中のＢＳ Ａ含有量を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計により、製造業者の指示に従ってＢｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを使用して、５ ９ ５ｎｍ（Ｕｖ−１ ６ ０ １；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）で分析した。 上清中のｓｉＲＮＡ含量を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計により２ ６ ０ｎｍで分析した。 試料を調製し、三重に測定した。 ＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡ捕捉効率（Ｅ Ｅ）は、以下の式を使用して計算した：＜２ ５ ７ ８＞＜６ ２ ５ ４＞２． Cs Npの安定性

新たに調製したCS Np(0.05%および0.1%w/vのDSおよびCS溶液、resp.）を保存する前に１ ５分間１ ２ ５ ０ ０ｒｐｍで遠心分離した。 超遠心後、得られたペレットを蒸留水（測定されたpH6.6）またはPBS pH7.4のいずれかに再懸濁した。 粒子サイズおよび表面電荷は、所定の貯蔵時間持続時間で測定した。(0, 1, 2, 3, 5, 8, および14日）、および周囲温度または4℃のいずれかで。

2.8。 インビトロ薬物放出試験

BSA/siRNAの放出を、最も高いEEを有するCS Npから決定した(DS:CS比1:1、EE=98%±0.2および、resp.). ４、４ｍ Ｌ）に懸濁し、３ ７℃で１ ０ ０ｒｐｍの攪拌速度を有する磁気攪拌機（ＭＳ ＭＰ８Ｗｉｓｅ Ｓｔｉｒ Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上に、所定の時間間隔で３ ７℃で４ ８時間置いた（０、０、１ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、１ ０ ０、5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, 試料を１ ０℃で３ ０分間１ ４ ０ ０ ０ｒｐｍで遠心分離し、次いで、上清をデカントし、当量の新鮮な緩衝液で置換した。 上清中の放出されたＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡの量を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｕ．Ｖ−１ ６ ０ １；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）により、それぞれ２ ８ ０および２ ６ ０ｎｍの波長で分析した。

2.9. ＢＳ Ａ完全性＜５ ２ ７ ５＞＜８ １ １ ９＞ＣＳ Ｎｐから放出されたＢＳ Ａの完全性を、ＭＩＮＩ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ ２％分解および１ ０％スタッキングゲル）によって決定した。 ＢＳ Ａ試料を、１：１の比でＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合し、９ ５℃で５分間加熱した。 試料（１ ５μ Ｌ）をウェルに装填し、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｔｒａ Ｃｅｌｌを用いて、ｐＨ８． サンプルバンドを、40％酢酸および10％メタノールを含む0.1％クーマシーブルー溶液で40分間染色し、続いて40％酢酸および10％メタノールの溶液で一晩染色した。

2.10. 統計分析

すべてのデータを平均±標準偏差(SD)として示した。 統計分析（Ａ ＮＯＶＡ検定およびＴｕｋｅｙのｐｏｓｈｏｃ分析）は、Ｓｏｃｉａｌ（ＳＰＳＳ）プログラムバージョン１ ５のための統計パッケージを使用して実施した。 値<0.05は、テストされたグループの平均間に有意な差を示した。

3. 結果

3.1. 粒子サイズと表面電荷

図1(a)は、待ち時間に対する電気移動度()の結果を示しています。 グラフから、30分後にプラトーと定数が残っていることが観察できました。 これは、安定した電気二重層（e.d.l.）の形成が瞬間的ではなく、いくつかの瞬間を必要としたことを示しています。 ＣＳ Ｎｐのサイズに対するＣＳ濃度とＤＳ最終濃度との間の影響を図１（ｂ）に示す。 サイズが500nm未満のCS Npの大部分が低CS濃度（0.1％w/v）で得られたことが観察された。 Ｄ ｓ濃度はナノ粒子の大きさにも影響した（）。 粒径の増加傾向は、DS濃度を0.05から0.25％w/vに増加させると観察することができた。05％w/v（低濃度）は、粒径が500nm未満のナノ粒子を生成した。 それとは対照的に、両方のポリマーの濃度を0.25％以上に増加させたときに大きなナノ粒子（>1000nm）が得られた。 結果に基づいて、0.05〜0.20％w/vのDS濃度を以下の研究のために選択した。 さらに、ＤＳ：ＣＳ重量比の増加（系中に存在するＤＳからの負電荷のより高い密度）は、粒子サイズの増加をもたらしたが、粒子表面電荷の減少をもたらした（表１（上））。 CS重量がDSの質量を超えると、+56.2±1.5mVの正の値が得られた。 しかし，より負に帯電したＤＳを添加すると，粒子表面電荷は−ｍ ｖに減少した。 DS:CSの重量比が2.5:1に達したとき、それは連続的に減少していた。 これは、ナノ粒子の表面に蓄積された過剰のDS分子によるものであると予想された。

(a)

(b))

(a)
(b))

フィギュア1

時間の関数としての電気泳動移動度（ａ）、およびナノ粒子の粒径に対するＣ ｓおよびＤ Ｓの最終濃度の効果（ｂ）、。

表1（下）は、DS0.2％w/vがBSAを装填した後に最大の粒子サイズを有していたことを示している。 粒径はｎｍであった。 0.1および0の集中のDSのための粒度。15％w/vも空のもの（）よりも大きかった。 一方，ｂｓａ負荷ナノ粒子の表面電荷の高い正の値が空のものに比べて観察された。 これは全てのＤ ｓ濃度で観察された。 さらに、より高いEEの価値は0.5:1の上のDS:CSの重量比を高めることによって達成できます。 1：1、1.5：1、および2：1のDS：CS重量比でのナノ粒子のEEは、それぞれ％、％、および％であった。 最高のＥＥは、ＤＳ：ＣＳ重量比１：１で得られた（表１（下））。

表2はDS0を示しています。2％w/vは、siRNAを負荷した後、最大の粒径（900±60nm）を有していた。 異なるDS濃度（0.05、0.1、0.15、および0.2％w/v）でSIRNAロードされたCS NPsは、より小さな粒子サイズを示した。 DS:CSの重量比のnanoparticlesのEE0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, そして、2:1は、それぞれ％、％、％、および％であった。

3.2. 形態学

CS NPsの画像はTEMによって得られた（図2）。 図2(a)および2(b)は、無負荷のCS NPsが球状構造を示していることを示しています。 画像は、siRNAから生成されたナノ粒子（図2（e）と2（f））が不規則な形態を示したことを示したが、BSAロードされたナノ粒子は、細長い形態を示した（図2（c）と2（d））。

(a)

(b))

(c))

()

(e)

(f))

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

フィギュア2

CS NPsのTEMイメージ。 (a)および(b)0.5:1および1:1でCS Npを無負荷にし、(c)および(d)BSAは0.5:1および1でCS Npを無負荷にしました。 : ５：１および１：１でＣＳ Ｎｐを装填したｓｉＲＮＡ、および（ｅ）および（ｆ）ｓｉＲＮＡをそれぞれ０． 全ての画像は６ ０ｋｘ倍率で撮影した。

3.3. CS Np

の保存安定性0.05および0.10%w/V DSから作製したナノ粒子は、周囲温度で保存したときに図3(a)に示すように、時間の経過とともにサイズが増 粒径の有意な増加は、特に0.05％w/v DSのための貯蔵の14日目の後に観察された。 これは凝集体の形成によるものと考えられていた。 この知見は表面電荷の結果と一致し，表面電荷はほぼ中性に減少することを示した。 対照的に、それらを4℃で保存したとき、それらの粒子サイズおよび表面電荷は、0.10％w/v DSから作られたナノ粒子について14日まで変化しなかった。 0.05%w/v DSでわずかな変化が観察された（図4(a)および4(b)）。 一方、これらのナノ粒子をPBS pH7.4に懸濁させたとき、すべての製剤は1μ m以上の大きなサイズに凝集し、PDI値は0.5以上であった。 それらの粒子表面電荷もほぼ中性であり、+0からの範囲であった。2から+2.5mV。

(a)

(b))

(a)
(b))

フィギュア3

(a)粒径および(b)0.05および0.01%w/v DS溶液で調製し、25℃で保存したCS Npの表面電荷ナノ粒子を蒸留水(pH6〜7の範囲)に懸濁させた。

(a)

(b)
(b))

(a)(b)
(b)
(b)
(b)
(b))

フィギュア4

(a)粒径および(b)0.05および0.10%w/vで調製し、4℃で保存したCS Npの表面電荷ナノ粒子を蒸留水(pH6〜7の範囲)に懸濁させた。

3.4. Bsaのインビトロ放出と完全性

図5(a)は、bsaの放出が放出速度に基づいて2つの段階に分けられることを示しています。 第一段階では、ＢＳ ＡはＣＳ Ｎｐから急速に放出され、最初の６時間でバースト放出を示した。 第二段階では、BSAは6時間から48時間までゆっくりと放出され、60％以上の累積BSA放出をもたらした。 ＣＳ ＮＰから放出されたＢＳ Ａの完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、図５（ｂ）に示す。 観察されたバンドは、37℃で1日目と2日目の後にローディングとリリースプロセスに耐えたBSAが新たに調製されたBSA標準のそれと異ならないことを確 したがって，ＢＳＡは実験条件下でＣＳＮＰ中に天然の形で残っていると結論できた。

(a)
(a)

(b))

((a)
(a)
(b)
(a)
(b))

フィギュア5

(ａ）ｐＨ７でのＤＳ：ＣＳ比１：１でのＢＳ ａ負荷ＣＳ Ｎｐの放出プロファイル。4, . ２ｍｇ／ｍＬ；（Ｃ）ブランク；（Ｄ）無負荷のＣＳ Ｎｐ；（Ｅ）および（Ｆ）ｃｓ Ｎｐから放出されたＢＳ Ａ（ＤＳ：ＣＳ比１：１）の１日目および２日目に放出されたＢＳ Ａ（ＤＳ：ＣＳ比１：１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：（Ｍ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準（ＢＩＯ−ＲＡＤ）；（ａ）ＢＳ Ａ標準１ｍｇ／ｍＬ；（ｂ）ｂｓ Ａ標準０．

3.5. in VitroでのsiRNA放出

図6は、siRNAの放出が放出速度に基づいて二つの段階に分けることができることを示しています。 第一段階では、ｓｉＲＮＡはＣＳ Ｎｐから急速に放出され、最初の６時間でバースト放出を示した。 これにより、ｓｉＲＮＡの５ ８％±５累積放出が生じた。 第二段階では、siRNAは6時間から48時間までゆっくりと放出され、85％以上の累積BSA放出が得られた。

フィギュア6

siRNAの放出プロファイルは、pH7.4でDS:CS比1:1でCS Npをロードした。

4. ディスカッション

本研究でCS NPsを製造するために使用される方法は、穏やかなプロセスであり、添加塩の濃度、粘度、非溶媒の量、ポリマーの分子量などの特定のパラメータを変化させることにより、粒径の制御を可能にする。 本研究は，ｅ．ｄ．ｌの安定化時間を決定することにより，ＣＳＮＰのイオン化可能基の電気的状態に関する情報を得るための研究から始まった。 得られたデータは、安定したe.d.lの形成を示唆した。 ナノ粒子の調製中に攪拌を停止した後、いくつかの瞬間を必要とした。 これらの瞬間は、電解質が粒子核に向かって浸透するために必要であった。 したがって、CS NPsを正確に測定するためには、40分の待ち時間が必要でした。 この所見はＣ ｓ-トリポリりん酸（Ｃ ｓ-ＴＰＰ）Ｎｐｓと類似しており，同じ待ち時間を示唆した。

また、粒子形成に及ぼすポリマー濃度の影響を調べるための研究も行われました。 この研究は、所望のサイズのナノ粒子を生成するための高分子電解質濃度の範囲を確立することを目的としていた。 ナノ粒子の形成に及ぼすCSおよびDSの様々な濃度の影響を研究するために、0.1、0.25、および0.5％w/vのCSおよびDS溶液を調製した。 DSソリューションの可変容量(1, 2, 3, 4, 5, 5.8, 5mLの各CS濃度(0.1〜0.5%w/v)と混合した。 ＣＳおよびＤＳの最終濃度を計算し、試料のサイズを１ ０ ０〜５ ０ ０、５ ０ １〜１ ０ ０ ０、または１ ０ ０ ０ｎｍを超えるもののいずれかに分類した。 粒径はＤ ｓ濃度に影響されることが分かった。 この知見は、ＣＳ−ＴＰＰ Ｎｐの結果と確証された。 一般に、ナノ粒子の所望のサイズは、100と1000nmの間に閉じ込められた。 しかし、以前の研究では、ロードされたナノ粒子は、通常、空のナノ粒子よりも大きなサイズを生成することが示されている。 従って500nmの下ののサイズは好ましいです。

さらに、DS濃度0.05%w/vのみが、表1に示すように500nm未満の粒径のナノ粒子を生成することができることが明らかになった。 両方のポリマーが低濃度であるとき，ＣＳへのＤＳの添加は小さなｃｏａｃｅｒｖａｔｅ核をもたらすと予想された。 それとは対照的に、サイズが1000nmを超える大きなコアセルベートは、両方のポリマー濃度が0.25％以上に増加したときに形成される傾向があった。 自発的にcoacervateを形作るキトサンの能力は減らされた容解性の高分子電解質の複合体を形作る反対に荷電した高分子電解質の相互作用が原因です。 高濃度のＤＳとＣ ｓの混合物は，ＣＳ鎖の絡み合いと結果として得られた複合体の溶解度に影響を及ぼす可能性が高い。 その結果、高度の錯化およびcoacervateが生成される。 ＣＳの低濃度での粘度の低下はまた、より良好な溶解性をもたらした。 これにより，カチオン性Ｃ ｓと反対に荷電したイオンとの間のより効率的な相互作用が可能になり，より小さな粒子サイズが生成された。 さらに，使用したポリアニオンのモル質量の増加と過剰は，高度に中和された錯体が形成され，凝集する傾向があったため，より大きな粒子をもたらした。 本研究では，ナノ粒子系の粒子表面電荷はＤ ｓとＣ Ｓの重量比に依存した。 粒子表面電荷は比が減少するにつれて増加することが分かった。 この関係は、ナノ粒子の接着特性および輸送特性を容易にするために所望の粒子表面電荷密度を得るのに有用であり得る。

本研究では、安定剤を添加せずに、溶解したBSA分子を含む酸性CS溶液とDS溶液を室温で混合するだけで、CS NPsへのBSAの取り込みが達成されました。 BSAは他の蛋白質の一般的な特徴を包含し、人間にbiocompatibleであるのでモデル蛋白質として頻繁に使用されます。 ＣＳＮＰはＢＳＡを装填した後のサイズが比較的大きいことが分かった。 粒子サイズは、bsaが正常にナノ粒子にロードされていたときに増加すると予想されました。 この傾向は、おそらく、添加されたＢＳ ａ分子の分子量およびサイズに起因する可能性がある。 これらの大きな粒子サイズは、タンパク質の送達におけるそれらの使用を制限する可能性がある。 150-300nmのナノ粒子は、主に肝臓および脾臓に見出される。 さらに、いくつかの報告によると、癌治療のために開発されたナノ粒子の「理想的な」サイズ要件は70〜200nmである。 ナノ粒子は内皮バリアを通過するために150nm以下でなければならないが、文献は常に窓の限界よりも大きな粒子の浸透を報告している。 実際に、開窓および血管系は、様々な病理学的条件下で改変を受けることができる。

例えば、腫瘍の増殖は、200-780nmの大きな窓を有する不連続な内皮によって特徴付けられる新生血管系の発達を誘導する。 さらに，ＢＳＡ担持ナノ粒子の粒子表面電荷は空の粒子よりも高いことが観察された。 これは酸性条件であるときBSAによって所有されているカチオンの特徴が原因であるかもしれません。 したがって、Ｃ ｓおよびＢＳＡ分子からの正電荷は、ロードされたナノ粒子の粒子表面電荷のより高い値に寄与している。

正に帯電したカチオン性ポリマーは、DNA、オリゴヌクレオチド、siRNAなどの核酸に効果的に結合し、保護することができます。 本研究では、酸性のＣＳ溶液と室温でｓｉＲＮＡを含有するＤＳ溶液とを単に混合することによって、ＣＳ ＮｐへのｓｉＲＮＡの取り込みを達成した。 ＣＳＮＰの粒径はｓｉｒｎａを負荷した後のサイズが比較的小さいことが分かった。 SiRNAをロードされたCS NPsの小さいサイズは、縮合小さいサイズのナノ粒子をもたらすカチオンポリマーによる核酸の負電荷の中和に起因する可能性があ ＳｉＲＮＡを負荷したＣＳ Ｎｐもまた、ｂｓ Ａを負荷したＣＳ Ｎｐと同じ傾向に続いて、ブランクＣＳ Ｎｐよりも高いゼータ電位を示した。

理想的には、成功した送達システムは、高度の薬物の関連性を有するべきである。 ＳｉＲＮＡを負荷したＣＳ Ｎｐは、全てのＤＳ：ＣＳ重量比について、より高い捕捉効率（＜６ １ ５ ３＞９ ０％）を示した。 DSでのナノ粒子の捕捉効率：1のCS重量比：1、1.5 : 1、および2:1は0.5:1の重量比よりも高かった。 この現象は、おそらくナノ粒子中に提示されたDSの割合が高いためであった。 より多くのDSが追加されると、より多くのBSAがナノ粒子に捕捉されるのを容易にする。 これは、BSAが双性イオン分子であるという事実によって説明することができる。 3.5–4.0の公式媒体のpHで、BSAの容解性はそれによって所有されている高められた正電荷が非常に高められた原因であることができます。 したがって、ＢＳ Ａは、ナノ粒子に静電的に付着し、安定して装填することができる。 酸性溶液中では，ＢＳＡは正電荷を有し，ＣＳと競合してＤＳと静電的に相互作用することができた。 この発見は、bsaロードされたCS NPSの増加した正の表面電荷と無負荷のものと比較して裏付けられました。 さらに、BSA上にはマルチイオンサイトがあり、この特徴はbsaのナノ粒子への取り込みを容易にする可能性がある。 この知見は、ＣＳ−ＴＰＰ Ｎｐを用いた知見とは異なる。

この研究では、bsaとTPPの代わりにbsaとCSの間に静電相互作用が存在していた。 また，ｂｓａが負電荷を有し，正に帯電したＣ ｓ分子と相互作用するためには，ｂｓａは等電点よりも高いｐｈを有する溶液に溶解すべきであることが示唆された。 したがって、この発見は、静電相互作用がCS-タンパク質相互作用またはDS-タンパク質相互作用のいずれかを介してナノ粒子にBSAの取り込みを促進す

TEMは、個々のナノ粒子のナノスケールの可視化を可能にし、サイズと形態の両方の情報を提供します。 粒子形態は、コロイドおよび化学的安定性ならびにナノ粒子の生物活性のための重要な因子である。 ｓｉｒｎａ負荷Ｃ ｓ Ｎｐは不規則な形態を示したが，ＢＳＡ負荷Ｃ Ｓ Ｎｐは細長い形態を示した。 これは、BSAのサイズが大きいため、CSにシールドのように絡み合ったり作用したりする可能性があり、構造内のCSの全体的な露出が制限される可能性があ

保存時のCS Npの安定性プロファイルも重要です。 この情報は、異なる媒体および温度下でのナノ粒子の安定性についての見解を提供することができる。 ナノ粒子の安定性を，平均粒径と表面電荷の経時的変化を評価することによって調べた。 最初に、ナノ粒子をpH6.6の蒸留水に再懸濁し、これを0.2μ mフィルターによって濾過して、水中に存在する可能性のある汚染物質を除去した。 この研究のために、0.05および0.10％w/vのDSから作られたナノ粒子のみを試験した。 他のＤＳ濃度は、遠心分離後の粒径の増加のために決定されなかった。 粒径は、それぞれ0.15％w/V DSおよび0.20％w/v DSでnmおよびnmまでであった。 粒径の増加は、ＣＳ Ｎｐ自体が水性環境中でそれらの球状形状を侵食して失うことに起因し、その結果、粒子の平均直径は、この侵食に応答して上昇する。 さらに，両方の濃度から作られたナノ粒子の粒子表面電荷は時間とともに減少していた。 リゾチームが存在しないにもかかわらず，ｃｓは水性培地中で分解される可能性があると考えられた。 その結果、CS Npは、粒子サイズおよび表面電荷が変化しないか、またはわずかに14日まで変化したため、4℃で保存した場合により安定であることが示 その結果、CS Npは劣化しやすいため、周囲温度で保存すべきではないことも示唆されました。 その結果，室温で保存されたＣＳＮＰは，涼しい環境で保存されたものよりも劣化しやすいことが示唆された。 それはおそらくナノ粒子の運動運動を遅くするかもしれない涼しい環境によるものでした。 したがって、ナノ粒子は、それらの球状形状を維持することができ、侵食は起こりにくくなる。 さらに、これらのナノ粒子がpH7.4でPBS中に凝集したことが観察された。 これは、PBS中のナノ粒子の粒子表面電荷が中性付近でより低いことに起因する可能性がある。 ゼロに低下した粒子表面電荷は，ＣＳＮＰがｐｂｓのリン酸基によって電荷相殺を受けたことを示している。 これらのナノ粒子の中性荷電状態は、ナノ粒子を個別に維持するために重要な分子内および分子間力の損失を引き起こす可能性がある。 その結果、これらの非荷電ナノ粒子は凝集し始め、コロイド系を不安定化させる可能性がある。 PBSとは対照的に、蒸留水は多数の水素イオンを提供して水素結合を形成することができ、CS Npのイオン化可能な基と相互作用することによってナノ粒子の凝集を破壊するのを助けることができる。＜2578＞＜8119＞CS NpからのBSAおよびsiRNAのin vitro放出試験を、Tris-HCL緩衝液中で実施した。 ＢＳ ＡおよびｓｉＲＮＡの放出は、放出速度に基づいて２つの段階に分けることができる。 第一段階では、薬物はCS NPsから急速に放出された。 この段階でのＢＳ ＡおよびｓｉＲＮＡの放出は、粒子表面で結合したＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡの拡散を伴う可能性がある。 第二段階では、ｂｓ Ａ／ｓｉＲＮＡは、ポリマーの膨潤または分解のためにゆっくりと放出された。 ＣＳ Ｎｐ中の残りのＢＳ Ａ／ｓｉＲＮＡは、粒子が完全に侵食されるかまたは放出媒体中に溶解されるまで、完全には放出されないであろう。 これはＣ Ｓセグメント上の残りのＢＳＡ／ｓｉＲＮＡと遊離アミノ基との間の相互作用によるものと考えられた。 加えて、穏やかな条件下で処方することができると以前に記載されている合成系は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されたように、ＣＳ Ｎｐに装填されたタンパク質の安定性が無傷であることを保証した。

5. 結論

要約すると、この研究は、CSおよびDS濃度ならびにpHがCS NPsの粒径および表面電荷を制御するパラメータであることを示しています。 500nm未満のナノ粒子は、ds:CS重量比0.5:1pH4で得ることができました。 BSA捕捉の場合、より高いDS：CS重量比を有するナノ粒子は、88％以上のより高い捕捉効率を有している。 達成された捕捉効率の最も高い割合は、0.10％w/v DS（DS：CS比1：1）であった。 しかし、ｓｉＲＮＡを負荷したＣＳ Ｎｐは、すべてのＤＳ：ＣＳ比に対して高い捕捉効率（＜５ ８ ４ ９＞９ ０％）を示した。 保存温度および懸濁培地は、ＣＳ Ｎｐの安定性に影響を及ぼす可能性のある因子であることが見出された。 CS NPsは不安定であり、周囲温度で不安定になる傾向がありましたが、涼しい環境（2-4℃）が提供されたときにこの不安定な動作を保留します。 さらに，ＣＳＮＰは，水分子とｃ ｓｎｐのイオン化可能基との間に形成される水素結合に起因する可能性のあるｐｂｓよりも蒸留水中での安定性が良好であった。

利益相反

著者らは、現在の研究には個人的または財政的利益相反はないと宣言している。

謝辞

著者らは、現在の研究プロジェクトの資金提供と支援のためのマレーシア大学（UKM-DLP-2011-001）の”Dana Lonjakan Penerbitan”を感謝して認めています。