CMV-promotormutanter med en reduceret tilbøjelighed til produktivitetstab i CHO-celler

for at overvåge virkningerne af methyleringsudsatte CpG-steder fra forstærkeren, den proksimale og kernepromotorregionen valgte vi ikke kun at undersøge C-179, men også cytosinerne i positioner -508 (C-508) og -41 (C-41). Ingen af de udvalgte CpG-steder overlapper med kendte transkriptionsfaktorbindingssteder hos Cricetidae-arter. For at opretholde det samlede GC-indhold udførte vi C til G transversioner (Fig. 1a). Udover C-41 er C-13 det andet cytosin i kernepromotorregionen, der synes at være hyppigt methyleret. Fordi mutation af C – 13 til G ville skabe et nyt CpG-sted, foretrak vi at undersøge C-41g. de muterede promotorvarianter blev forkortet med en kode på tre bogstaver, f.eks. variant GCC har guanin i stedet for cytosin i position -508, mens cytosinbaserne ved -179 og -41 bevares. CCC er den ikke-muterede kontrol hCMV-MIE (Fig. 1a). Muterede eller native promotorer blev introduceret i forskellige plasmider og placeret opstrøms for forskellige reportergener.

for at se, om mutationerne påvirker promotorens styrke, udførte vi to uafhængige eksperimenter ved transient at transficere reporterplasmider, der udtrykker udskilt embryonisk alkalisk phosphatase (SEAP) i CHO-K1-celler og undersøgte ekspressionen af SEAP fem dage efter transfektion. Den ikke-muterede promotor blev anvendt som reference (Fig. 1b). Ekspression af SEAP fra GGG, GCG og CGC-promotorer var konsekvent omkring 20% lavere end fra den ikke-muterede promotor med mindre variation mellem replikateksperimenterne. Generelt viste C til G-mutationerne en tendens til beskedent reduceret promotorstyrke, som imidlertid syntes at være acceptabel.

dernæst spurgte vi, om hCMV-MIE-promotorvarianter påvirker ekspressionsstabiliteten af permanent transficerede CHO-celler under langvarig dyrkning. Til dette formål valgte vi en eGFP-reporter, der muliggør cytometrisk analyse af reportergenekspression på enkeltcelleniveau. eGFP-reporterplasmider blev transficeret til CHO-K1-celler, og tre til fire uafhængige puljer af permanent transficerede celler blev valgt med metotreksat. Disse blev dyrket over tre måneder i nærværelse af selektionsmiddel. Fireogtredive og syvogfirs dage efter transfektion blev eGFP-ekspression målt ved cytometri (to puljer gik tabt mellem dag 34 og 87 på grund af forurening). De geometriske midler til fluorescensintensiteten på 10.000 hændelser pr.måling blev beregnet for hver cellepulje og afbildet for begge tidspunkter (Fig. 1c). Fireogtredive dage efter transfektion var der ringe forskel mellem konstruktionerne. Kun en CGC-pool viste forhøjede ekspressionsniveauer. Syvogfirs dage efter transfektion, to ud af fire puljer transficeret med CGC og to ud af tre puljer transficeret med CCG viste markant højere eGFP-værdier end alle andre puljer, transficeret enten med den ikke-muterede kontrol eller de resterende promotorvarianter. Disse observationer antydede en stabiliserende virkning af de enkelte C-41g-eller C-179g-mutationer på eGFP-ekspression. For at konsolidere dette resultat gentog vi eksperimentet med både promotorvarianter og med et større antal puljer. Vi genererede ti puljer med henholdsvis CCG eller CCC og otte puljer med CGC (to puljer gik tabt på grund af forurening). Cellerne blev dyrket som før og analyseret ved strømningscytometri fra dag 42 til dag 69 efter transfektion (Fig. 1D og supplerende Fig. S1 online). Efter 42 dage blev eGFP-ekspression stærkt forøget i fire CCG-puljer sammenlignet med CCC-kontrolpuljerne, mens to CGC-puljer viste en moderat stigning i eGFP-ekspression (Fig. 1D, venstre panel). Efter 69 dage viste tre CCG-puljer stadig høje niveauer af eGFP, mens eGFP-ekspression af CGC-puljerne var faldet til CCC-kontrolniveauer (Fig. 1D, højre panel). Forskellene mellem grupperne blev testet på hvert tidspunkt med den ikke-parametriske stål-dv-test. Alfa-niveauet blev sat til 0,05. En signifikant forskel blev observeret mellem CCG og CCC på dag 56 efter transfektion (p = 0,0305; se supplerende Fig. S1 online). Samlet set resultaterne af Fig. 1c, d foreslog, at både mutationer C-41g og C-179g kan forsinke tabet af hCMV-MIE-drevet rekombinant genekspression.

mutationer C-41g og C-179g hæmmer fuldstændigt DNA-methylering på det respektive sted, da guanin ikke kan methyleres. Vi spekulerede på, om disse mutationer også påvirkede methyleringsniveauer på andre CpG-steder inden for hCMV-MIE. Derfor, vi målte methyleringsniveauerne for alle CpG-steder i de individuelle hCMV-MIE-varianter ved bisulfitkonvertering kombineret med næste generations sekventering. Til dette formål ekstraherede vi genomisk DNA fra cellepuljerne i det andet eksperiment 42 og 69 dage efter transfektion og behandlede det med bisulfit for at skelne mellem methyleret og ikke-methyleret cytosin. hCMV-MIE DNA blev forstærket og sekventeret med Illumina Misek-systemet (Fig. 1e). C – 179 blev stærkest methyleret inden for alle puljer transficeret med enten CCC eller CCG, hvilket bekræfter tidligere observationer med den ikke-muterede hCMV-MIE12. Desuden observerede vi et tydeligt methyleringsmønster, der var meget ens med alle puljer, men afveg i den samlede intensitet. Især var ikke-muteret C – 508 og C-41 konsekvent blandt de hyppigst methylerede steder. Mutationen af C – 41 I promotorvariant CCG, især mutationen af C-179 i variant CGC, ser ud til ensartet at mindske methyleringen af alle CpG-steder snarere end at ændre methyleringsmønsteret. Da vi beregnede de gennemsnitlige methyleringsniveauer på tværs af alle CpG-steder for hver pool, opdagede vi lavere samlet methylering med de muterede promotorvarianter (se supplerende Fig. S2 online). Forskellen var mest udtalt med variant CGC, men nåede ikke statistisk signifikans med stål-dv-testen (Kurt = 0,05). I gennemsnit steg methylering over tid med alle konstruktioner.

udover epigenetisk promotorhæmning er tab af transgenkopier en væsentlig årsag til produktionsstabilitet i rekombinante celler20. For at estimere det relative bidrag målte vi plasmidkopieringsnumre med kpcr 42 og 69 dage efter transfektion. Gennemsnitlige plasmidkopiantal faldt over tid uden nogen åbenbar forskel mellem konstruktionerne (se supplerende Fig. S2 online). Interessant nok blev fordelingen af kopinumre skiftet mod lavere værdier i CGC-gruppen. Men da vi testede statistisk signifikans med stål-dv-testen, viste forskellene mellem konstruktionerne sig ikke at være signifikante (kr = 0,05).

puljer af permanent transficerede celler er meget heterogene blandinger af kloner, der adskiller sig i transgenekspression og væksthastighed. Meget produktive kloner har tendens til at have en lavere vækstrate21. Derfor vokser lavproducerende celler, hvoraf mange er til stede i kulturen efter transfektion, næsten uundgåeligt de høje producenter før eller senere. For at minimere denne bias undersøgte vi mutationerne C-179g og C-41g i klonale cellelinjer. Da vi havde til formål at vurdere virkningerne på produktionen af et potentielt kommercielt produkt, skiftede vi til et IgG-IL2 fusionsprotein som reporter. Promotorvarianter indeholdende begge mutationer enten alene (CGC eller CCG) eller i kombination (CGG) blev således indsat opstrøms for den lette kæde og det tunge kædegen af et IgG-IL2-ekspressionsplasmid.

Ekspressionsplasmider, der bærer enten CCG, CGC, CGG eller den ikke-muterede hCMV-MIE, blev transficeret til CHO-K1-celler, og stabilt transficerede kloner blev isoleret i 384-brøndsplader. Konstruktion blev tilfældigt udvalgt og udvidet til seks-brøndsplader. Efter at cellelinjerne havde vist stabil vækst, studerede vi deres produktivitet i cirka to måneder, fra dag 68 til dag 134 efter transfektion. Nogle cellelinjer gik tabt på grund af forurening eller nedsat levedygtighed, men 23 Til 29 kloner pr.

under hele undersøgelsen bestemte vi IgG-IL2 koncentrationer i cellekultur supernatanter og produktivitet pr. I begyndelsen (dag 68) og slutningen (dag 134) af undersøgelsen viste cellelinjer transficeret med CGC signifikant højere titere end kontroltransfektanterne (Kurt = 0,05; Fig. 2a). Cellelinjer med bemærkelsesværdigt høje titere blev også observeret blandt CGG-transfektanterne på dag 68 og blandt CCG-og CGG-transfektanterne på dag 134. Når vi sammenlignede specifikke produktiviteter mellem cellelinjer transficeret med forskellige konstruktioner, lavede vi lignende observationer (Fig. 2b). For at kompensere for upræcisionen i celletælling, gennemsnittes den specifikke produktivitetskvalitet for to passager i begyndelsen (dag 68-71 og 83-86 efter transfektion, der repræsenterer de tidligste tilgængelige datapunkter) og tre passager ved afslutningen af langvarig dyrkning (dag 124-127, dag 127-131 og dag131-134 efter transfektion). Der blev observeret signifikante forskelle mellem cellelinjer transficeret med CGC eller CCC ved afslutningen af langvarig dyrkning (Kurt = 0,05).

hCMV-MIE-varianterne CGC og CCG stabiliserer produktionen af rekombinant protein i klonale cho-cellelinjer.

(a) IgG-IL2-titere af CHO-kloner 68 dage (venstre panel) og 134 dage (højre panel) efter transfektion. (B) specifik produktivitetskvalitet for CHO-kloner i begyndelsen (venstre panel) og slutningen (højre panel) af langvarig dyrkning. Tidlige KP-værdier blev beregnet ved et gennemsnit af KP-værdierne for to tidlige passager, der repræsenterer de to tidligste datapunkter (dag 68-71 og dag 83-86 efter transfektion). De sidste tre passager (dag 124-127, dage127–131 og dag 131-134 efter transfektion) (c) procentvis ændring af specifikke produktiviteter i langtidsdyrkning baseret på data vist i (b) med (venstre panel) og uden (højre panel) en outlier identificeret ved jackknife-analyse. Kun kloner, der producerede påviselige niveauer af produkt på dag 68, blev overvejet. (a–c) identiteten af promotorvarianterne og antallet (N) af uafhængige cellepuljer er angivet under h-aksen. De øverste og nederste ender af kasserne repræsenterer den første og den tredje kvartil i hver gruppe. Enderne af knurhår repræsenterer de laveste og højeste værdier, der stadig ligger inden for det 1,5 gange interkvartilområde. Den grå linje angiver det samlede gennemsnit af Y-variablen i diagrammet. Signifikante forskelle (kr = 0,05) mellem grupperne i henhold til stål-dv-testen er angivet med p-værdierne.

højere titere og specifikke produktiviteter af cellelinjer, der bærer G-179 eller G-41, antydede en stabiliserende virkning af disse mutationer på hCMV-MIE-drevet genekspression. For at dokumentere denne effekt beregnede vi den procentvise ændring af kvaliteten under langvarig dyrkning for hver enkelt cellelinie som det mest passende mål for dens produktionsstabilitet (Fig. 2c). Selvfølgelig var dette kun muligt med cellelinjer, der stadig producerer IgG-IL2 på dag 68 efter transfektion. En kontroltransfektant øgede sin specifikke produktivitet med 500% og blev identificeret som en outlier ved jackknife outlier-analyse (Fig. 2C, venstre plot). Derfor blev denne cellelinie udelukket fra yderligere analyse (Fig. 2C, højre plot). Cellelinjer transficeret med enten CGC eller CCG var signifikant mere stabile end kontrolcellelinjer transficeret med CCC (kr = 0,05). Overraskende adskiller den dobbelte mutant CGG sig ikke fra kontrollen.