udvikling af Chitosan nanopartikler som et stabilt Lægemiddelafgivelsessystem til Protein/siRNA

abstrakt

Chitosan nanopartikler (CS NPs) udviser gode fysisk-kemiske egenskaber som lægemiddelafgivelsessystemer. Formålet med denne undersøgelse er at bestemme moduleringen af præparative parametre på de fysiske egenskaber og kolloid stabilitet af CS NPs. CS NP ‘ er blev fremstillet ved ionisk interaktion med dekstransulfat (DS) inden bestemmelse af deres lagringsstabilitet. De mindste CS NP ‘ er af nm med en overfladeopladning af mV blev produceret, når CS og DS blev blandet ved pH 4 og med et DS : CS-masseforhold på 0,5 : 1. En indfangningseffektivitet på 98% blev opnået, når BSA/siRNA blev indlæst i nanopartiklerne. Resultaterne viste også, at partikelstørrelse og overfladeopladning af CS NPs blev ændret lidt op til 2 uger, når de blev opbevaret ved 4 kg C. større partikelstørrelse og overfladeopladning blev opnået ved at øge koncentrationen af DS. Afslutningsvis var NP ‘ er tilstrækkeligt stabile, når de blev holdt ved 4 K. C. og i stand til at bære og beskytte protein.

1. Introduktion

endogene peptider, protein og oligonukleotider er blandt de vigtigste lægemidler, der tiltrækker meget opmærksomhed på grund af deres store potentialer i behandling af kroniske sygdomme . Imidlertid har det ekstreme in vivo-miljø i menneskekroppen altid begrænset de terapeutiske anvendelser af disse stoffer . Polymere nanopartikler har tiltrukket sig meget opmærksomhed som leveringssystemer på grund af deres evne til at overvinde de fysiologiske barrierer og beskytte og målrette de indlæste stoffer mod specifikke celler . Naturligt forekommende polymerer såsom chitosan (CS) er blevet undersøgt for at danne nanopartikler . CS er et biologisk nedbrydeligt polysaccharid, og det er afledt af deacetylering af chitin . Bortset fra dets biokompatibilitet bidrager de lave toksicitet, hæmostatiske og bakteriostatiske egenskaber også til dets forskellige anvendelser inden for farmaceutisk område . Flere anioner er blevet undersøgt for at tværbinde CS som natriumsulfat og dekstransulfat (DS) . DS er i stand til at modificere protein-og siRNA-indfangningseffektivitet (EE) uden brug af hærdningsmidler og kontrollere hastigheden af lægemiddelfrigivelse på grund af dens høje ladningstæthed . Udover DS er et billigt materiale , producerer det mekanisk mere stabile nanopartikler sammenlignet med pentasodium tripolyphosphat (TPP) .

flere undersøgelser havde rapporteret de unikke træk ved chitosan nanopartikler (CS NPs) ved hjælp af DS. Imidlertid er moduleringen af præparative parametre på deres fysiske egenskaber stadig ikke fuldt ud undersøgt, for eksempel indflydelsen af DS sterisk hindring på den elektrostatiske tiltrækning mellem CS og BSA . Desuden er determinanten for et vellykket lægemiddelafgivelsessystem afhængig af dets fysiske egenskaber og stabilitet. Derfor var målene med denne undersøgelse at modulere præparative parametre for at opnå nanosiserede partikler af CS NPs og at bestemme deres kolloide stabilitet ved forskellige opbevaringstemperaturer og i forskellige suspensionsmedier.

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

chitosan med lav molekylvægt (70 kDa med graden af deacetylering 75% -85%), eddikesyreglacial, phosphatbufret saltvand (PBS), bovint serumalbumin (BSA, 46 kDa) og Bradford-reagens blev købt fra Sigma-Aldrich Inc., USA. Dobbeltstrenget siRNA (sense: 5 ‘- GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAAUCUU-5’) blev købt fra Thermoscientific Dharmacon, USA. DS blev købt fra Fisher Scientific, UK. Proteinstige (højt interval), laemmli-prøvebuffer, 10 gange tris/glycin/natriumdodecylsulfatbuffer, ammoniumpersulfat, tetramethylendiamin (TEMED), 2% bis-opløsning og 40% acrylamidopløsning blev købt fra Bio-Rad, USA. Tris-HCl buffer blev opnået fra Invitrogen, USA. Alle andre anvendte kemikalier var af analytisk kvalitet.

2.2. Fremstilling af Blank og BSA-Loaded CS NPs

CS og DS opløsning blev opløst i henholdsvis 1% V/V eddikesyre og destilleret vand. pH af CS-opløsning blev justeret til pH 4 ved tilsætning af 1 M NaOH eller 1 M HCI. DS-opløsning (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% og 0,25% vægt / v) blev tilsat dråbevis i CS-Opløsning (0,1% vægt/v) under magnetisk omrøring (Vistir Digital Multipoint magnetisk omrører MS-MP8, DAIHAN Scientific, Korea) ved 250 o / min i 15 minutter for at danne nanopartikler. Alle prøver blev lavet i tre eksemplarer. De resulterende nanopartikler blev vasket og høstet ved ultracentrifugering (Optima L-100 ultracentrifugering med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) to gange ved 12 500 omdr./min i 15 minutter ved 10 liter C. For BSA-tilknytning til CS NPs blev BSA opløst i CS-Opløsning (0,1% vægt/v, pH 4) for at producere en endelig koncentration på 1 mg / mL. BSA-belastede CS NP ‘ er blev derefter fremstillet ved ovennævnte metode. Til siRNA-tilknytning til CS NPs blev 3 liter siRNA (15 liter/liter) i deioniseret vand tilsat til DS-opløsning (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, og 0,25% vægt / v) før tilsætning af denne dråbevis til CS-Opløsning (0,1% vægt/v).

2.3. Elektroforetisk Mobilitetsundersøgelse

elektroforetiske mobilitetsmålinger () af CS NP ‘ er blev udført med en Nanostråler (Malvern Instruments, UK) og blev målt mod ventetid. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer.

2.4. Nanopartikler karakterisering

partikelstørrelse, overfladeladning og polydispersitetsindeks (PDI) af frisklavede CS NPs blev målt ved hjælp af en Resetasisator Nano SS (Malvern Instruments, UK), baseret på fotonkorrelationsspektroskopi (PCS) teknikker. Der blev ikke udført fortyndinger under analysen. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Målingerne blev foretaget ved 25 liter C.

2,5. Morfologisk analyse

morfologisk karakterisering af losset CS NPs, BSA / siRNA loaded CS NPs (DS: CS vægtforhold på 0,5: 1, 1 : 1) blev udført ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Holland).

2.6. BSA / siRNA-Indfangningseffektivitet

BSA / siRNA-belastede CS-NP ‘ er blev adskilt fra opløsningen ved ultracentrifugering (Optima L-100 Ultracentrifuge med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) ved 14000 o / min i 30 min. Supernatanter udvundet fra centrifugering blev dekanteret. BSA-indholdet i supernatanten blev analyseret ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer ved 595 nm (U. V-1601, Japan) ved anvendelse af Bradford-proteinanalysen i henhold til producentens instruktion. siRNA-indholdet i supernatanten blev analyseret ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer ved 260 nm. Prøverne blev fremstillet og målt i tre eksemplarer. BSA / siRNA-indfangningseffektiviteten (EE) blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

2.7. Stabilitet af CS NPs

frisklavet CS NPs (fremstillet af 0,05% og 0,1% vægt/v af DS-og CS-opløsning, hhv.) blev centrifugeret ved 12 500 O / min i 15 minutter før opbevaring. Efter ultracentrifugering blev de opnåede pellets resuspenderet i enten destilleret vand (målt pH på 6,6) eller PBS pH 7,4. Partikelstørrelsen og overfladeladningen blev målt ved forudbestemte opbevaringstid varigheder (0, 1, 2, 3, 5, 8, 14 dage) og ved enten omgivelsestemperatur eller 4 liter C.

2,8. In Vitro-Lægemiddelfrigivelsesstudie

frigivelsen af BSA/siRNA blev bestemt ud fra CS NPs med det højeste EE (DS : CS-forhold 1 : 1, EE = 98% ren 0,2 og , resp.). BSA / siRNA-belastede CS NP ‘ er blev suspenderet i Tris-HCl-bufferopløsning (pH 7,4, 4 mL) og anbragt på en magnetisk omrører med en omrøringshastighed på 100 o / min ved 37 liter C (MS MP8 Vis omrøring, Tyskland) i 48 timer ved 37 liter C. Ved forudbestemte tidsintervaller (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, og 48 timer) blev prøverne centrifugeret ved 14 000 o / min i 30 minutter ved 10 liter C. Derefter blev supernatanten dekanteret og erstattet med et ækvivalent volumen frisk bufferopløsning. Mængden af frigivet BSA / siRNA i supernatanten blev analyseret ved hjælp af et UV-Vis spektrofotometer (U. V-1601; Shimadsu, Japan) ved en bølgelængde på henholdsvis 280 og 260 nm.

2.9. BSA integritet

integriteten af BSA frigivet fra CS NPs blev bestemt af SDS-PAGE (12% opløsning og 10% stabling gel) ved hjælp af Mini-Protein System (Bio-Rad, USA). BSA-prøver blev blandet med Laemmli-prøvebuffer i forholdet 1 : 1 og opvarmet ved 95 liter C i 5 minutter. Prøver (15 liter) blev indlæst i brøndene, og gelen blev kørt under anvendelse af et mini-Proteinsystem Tetra celle ved en konstant spænding på 150 V i 90 minutter med en løbende buffer indeholdende 25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% SDS ved pH 8,3. Prøvebåndene blev farvet i 40 minutter med 0,1% coomassie blå opløsning indeholdende 40% eddikesyre og 10% methanol efterfulgt af farvning natten over med en opløsning af 40% eddikesyre og 10% methanol.

2.10. Statistisk analyse

alle data blev præsenteret som gennemsnitlig standardafvigelse (SD). Statistisk analyse (ANOVA test og Tukey ‘ s posthoc analyse) blev udført ved hjælp af statistisk pakke til det sociale (SPSS) program version 15. En værdi < 0,05 viste signifikant forskel mellem gennemsnittet af testede grupper.

3. Resultater

3.1. Partikelstørrelse og Overfladeafladning

Figur 1(a) viser resultaterne af elektrisk mobilitet () mod ventetid. Fra grafen kunne det observeres, at det forblev plateau og konstant efter 30 min. Dette viser, at dannelsen af stabilt elektrisk dobbeltlag (e.d.l.) ikke var øjeblikkelig, men krævede nogle øjeblikke. Virkningerne mellem CS-koncentration og DS-slutkoncentrationer på størrelsen af CS NPs er vist i Figur 1(b). Det blev observeret, at de fleste af CS NPs med en størrelse på mindre end 500 nm blev opnået ved en lav CS-koncentration (0,1% vægt/v). DS-koncentration påvirkede også størrelsen på nanopartikler (). En stigende tendens i partikelstørrelse kunne observeres ved at øge DS-koncentrationen fra 0,05 til 0,25% vægt/v. Generelt er DS-koncentration på 0.05% vægt/v (lav koncentration) producerede nanopartikler med partikelstørrelse mindre end 500 nm. I modsætning hertil blev store nanopartikler (>1000 nm) opnået, når koncentrationen af begge polymerer blev forøget til 0,25% eller derover. Baseret på resultaterne blev DS-koncentrationer fra 0,05 til 0,20% vægt/v valgt til følgende undersøgelser. Desuden førte en stigning i DS : CS-vægtforholdet (højere densitet af negative ladninger fra DS til stede i systemet) til en stigning i partikelstørrelse, men et fald i partikeloverfladeladning (tabel 1 (ovenfor)). Da CS-vægten oversteg massen af DS, blev der opnået en positiv værdi på +56,2 liter 1,5 mV. Imidlertid faldt partikeloverfladeladning til-mV, når der blev tilsat mere negativt ladet DS. Det faldt kontinuerligt, da DS : CS-vægtforholdet var nået til 2,5: 1. Dette forventedes at skyldes et overskud af DS-molekyler akkumuleret på overfladen af nanopartikler.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

elektroforetisk mobilitet som en funktion af tid (A) og effekt af de endelige koncentrationer af CS og DS på partikelstørrelsen af nanopartikler (b),.

tabel 1 (nedenfor) viser, at DS 0,2% vægt/v havde den største partikelstørrelse efter at være fyldt med BSA. Partikelstørrelsen var nm. Partikelstørrelse for DS ved en koncentration på 0,1 og 0.15% vægt / v var også større end de tomme (). På den anden side blev der observeret højere positive værdier af overfladeafladning for BSA-belastede nanopartikler sammenlignet med de tomme. Dette blev observeret for alle DS-koncentrationer. Desuden kunne højere EE-værdier opnås ved at øge DS : CS-vægtforholdet over 0,5 : 1. EE af nanopartikler ved DS: CS vægtforhold på 1 : 1, 1,5: 1 og 2: 1 var henholdsvis%, % og%. Den højeste EE blev opnået ved et DS : CS-vægtforhold 1: 1 (Tabel 1 (nedenfor)).

tabel 2 viser, at DS 0.2% vægt / v havde den største partikelstørrelse (900 liter 60 nm) efter at være fyldt med siRNA. siRNA indlæst CS NPs ved forskellige DS-koncentrationer (0,05, 0,1, 0,15 og 0,2% vægt/v) viste mindre partikelstørrelse. EE af nanopartikler ved DS: CS vægtforhold på 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, og 2: 1 var henholdsvis%,%, % og%.

3.2. Morfologi

billederne af CS NPs blev opnået ved TEM (figur 2). Figur 2(A) og 2 (b) viser, at losset CS NPs udviste en sfærisk struktur. Billederne viste, at nanopartikler genereret fra siRNA (figur 2(e) og 2(f)) viste uregelmæssig morfologi; BSA-indlæste nanopartikler viste imidlertid aflange morfologier (figur 2(c) og 2(d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

figur 2

tem billeder af CS NPs. (A) og (b) losset CS NPs ved 0,5: 1 og 1: 1, (c) og (d) BSA losset CS NPs ved 0,5 : 1 og 1 : 1, og (e) og (f) siRNA indlæste CS NPs på henholdsvis 0,5 : 1 og 1 : 1. Alle billederne blev taget ved 60 KKS forstørrelse.

3.3. Opbevaringsstabilitet for CS NPs

begge nanopartikler fremstillet af 0,05 og 0,10% vægt/v DS blev forøget i størrelse over tid som vist i figur 3(A), når de blev opbevaret ved omgivelsestemperatur. En signifikant stigning i partikelstørrelse blev observeret efter dag 14 af opbevaring især for 0,05% vægt/v DS. Dette blev anset for at skyldes dannelsen af aggregater. Dette fund bekræftede resultaterne af overfladeafladning, som viste et fald i overfladeafladning til næsten neutral. I modsætning hertil forblev deres partikelstørrelse og overfladeafladning uændret i op til 14 dage for nanopartikler fremstillet af 0,10% vægt/v DS, når de blev opbevaret ved 4 liter C. En lille ændring blev observeret for 0,05% vægt / v DS(figur 4(A) og 4 (b)). På den anden side, når disse nanopartikler blev suspenderet i PBS pH 7,4, blev alle formuleringer aggregeret til større størrelser på mere end 1 liter med PDI-værdier mere end 0,5. Deres partikeloverfladeafgifter var også næsten neutrale og spænder fra + 0.2 til +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 3

(a) partikelstørrelse og (b) overfladeopladning af CS NPs fremstillet ved 0,05 og 0,01% vægt/v DS-opløsning og opbevaret ved 25 liter C. nanopartikler blev suspenderet i destilleret vand (pH i området 6-7),.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 4

(a) partikelstørrelse og (b) overfladeopladning af CS NPs fremstillet ved 0,05 og 0,10% vægt/v og opbevaret ved 4 liter C. nanopartikler blev suspenderet i destilleret vand (pH i området 6-7),.

3.4. BSA in Vitro frigivelse og integritet

figur 5(A) illustrerer, at frigivelsen af BSA kunne opdeles i to faser baseret på frigivelseshastigheden. I den første fase blev BSA hurtigt frigivet fra CS NPs og viste en burst-frigivelse i den første 6 h. Dette resulterede i en kumulativ frigivelse af BSA på 45%. I det andet trin blev BSA langsomt frigivet fra 6 timer op til 48 timer, hvilket resulterede i en kumulativ BSA-frigivelse på mere end 60%. Integriteten af BSA frigivet fra CS NPS blev evalueret af SDS-PAGE og er vist ved Figur 5(b). De observerede bånd bekræftede, at BSA, der havde udholdt indlæsnings-og frigørelsesprocesserne ved 37 liter C efter dage 1 og 2 var ikke forskellige fra den for frisklavede BSA-standarder. Det kunne derfor konkluderes, at BSA forblev i sin oprindelige form i CS NPs under de eksperimentelle betingelser.

(a)

(b)

(a)
(b)

figur 5

(a) frigørelsesprofilen for BSA indlæst CS NPs ved DS : CS-forhold på 1 : 1 ved pH 7.4, . (B) SDS-side analyse af BSA frigivet fra CS NPs: (M) SDS-side standarder (BIO-RAD); (a) BSA standard 1 mg/mL; (B) BSA standard 0,2 mg/mL; (C) blank; (D) losset CS NPs; (E) og (F) BSA frigivet fra CS NPs (DS : CS ratio på 1 : 1) på dag 1 og 2.

3.5. Sirna in Vitro frigivelse

figur 6 illustrerer, at frigivelsen af siRNA kunne opdeles i to faser baseret på frigivelseshastigheden. I den første fase blev siRNA hurtigt frigivet fra CS NPs og viste en burst-frigivelse i den første 6 h. Dette resulterede i en kumulativ frigivelse af siRNA på 58% og 5. I anden fase blev siRNA langsomt frigivet fra 6 timer op til 48 timer, hvilket resulterede i en kumulativ BSA-frigivelse på mere end 85%.

figur 6

frigivelsesprofilen for siRNA indlæste CS NPs ved DS: CS-forhold på 1: 1 ved pH 7.4, .

4. Diskussioner

metoden, der anvendes til fremstilling af CS NPs i den foreliggende undersøgelse, er en mild proces, og den muliggør kontrol af partikelstørrelsen ved at variere visse parametre for eksempel koncentration af tilsatte salte, viskositet, mængde ikke-opløsningsmiddel og molekylvægt af polymer. Denne undersøgelse blev startet med undersøgelsen for at få information om elektrisk tilstand af ioniserbare grupper af CS NPs ved at bestemme stabiliseringstiden for e.d.L. dette trin er vigtigt for at opnå pålidelige og reproducerbare resultater. De opnåede data antydede, at dannelsen af stabil e. d.l. under nanopartikler forberedelse krævede nogle øjeblikke efter standsning af omrøring. Disse øjeblikke var nødvendige for at elektrolytterne kunne trænge ind mod partiklernes kerne. Dermed, ventetid på 40 min var nødvendig før CS NPs kunne måles nøjagtigt. Dette fund svarede til CS-tripolyphosphat (CS-TPP) NPs, som foreslog den samme ventetid .

en undersøgelse blev også udført for at bestemme indflydelsen af polymerkoncentration på partikeldannelse. Undersøgelsen havde til formål at etablere rækkevidden af polyelektrolytkoncentration til fremstilling af nanopartikler med den ønskede størrelse. For at undersøge virkningerne af de varierende koncentrationer af CS og DS på dannelsen af nanopartikler blev CS og DS opløsning på 0,1, 0,25 og 0,5% vægt/v fremstillet. Variable volumener af DS-opløsning (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, og 10 mL) blev blandet med 5 mL af hver CS–koncentration (0,1-0,5% vægt/v). Den endelige koncentration af CS og DS blev beregnet, og størrelser af prøver blev kategoriseret enten som 100-500, 501-1000 eller mere end 1000 nm. Det blev fundet, at partikelstørrelsen blev påvirket af DS-koncentrationen. Dette fund bekræftede resultaterne af CS-TPP NPs . Generelt er den ønskede størrelse af nanopartikler begrænset mellem 100 og 1000 nm. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist, at de indlæste nanopartikler normalt ville producere en større størrelse end de tomme. Størrelsen på under 500 nm er derfor gunstig.

desuden viste resultaterne, at kun DS-koncentration på 0,05% vægt/v var i stand til at producere nanopartikler med partikelstørrelse mindre end 500 nm som vist i tabel 1. Det forventedes, da når begge polymerer var i lave koncentrationer, tilsætningen af DS til CS resulterede i små coacervatkerner. I modsætning hertil havde store coacervater, der oversteg 1000 nm i størrelse, tendens til at dannes, når begge polymerkoncentrationer steg til 0,25% eller derover. Chitosans evne til spontant at danne coacervat skyldes interaktionen mellem modsat ladede polyelektrolytter for at danne et polyelektrolytkompleks med reduceret opløselighed. Blandingen af høj koncentration af DS med CS er derfor mere tilbøjelig til at påvirke sammenfiltringen af CS-kæderne og opløseligheden af det resulterende kompleks. Som følge heraf vil der blive produceret en høj grad af kompleksdannelse og coacervat . Den nedsatte viskositet ved en lavere koncentration af CS resulterede også i bedre opløselighed. Dette muliggjorde en mere effektiv interaktion mellem den kationiske CS og modsat ladede ioner, og således blev der produceret en mindre partikelstørrelse . Derudover resulterede en stigning og overskud i den molære masse af den anvendte polyanion i større partikler, fordi der blev dannet stærkt neutraliserede komplekser, og de havde tendens til at flokkulere . I denne undersøgelse var partikeloverfladeladning af nanopartikulatsystemet afhængig af vægtforholdet mellem DS og CS. Partikeloverfladeladning viste sig at være øget, da forholdet faldt. Dette forhold kan være nyttigt til opnåelse af den ønskede partikeloverfladeladningstæthed for at lette vedhæftning og transportegenskaber af nanopartiklerne.

i denne undersøgelse blev inkorporeringen af BSA i CS NPs opnået ved simpelthen at blande den sure CS-opløsning indeholdende opløste BSA-molekyler med DS-opløsningen ved stuetemperatur uden tilsætning af stabilisator. BSA bruges ofte som et modelprotein, fordi det omfatter det generelle kendetegn ved andre proteiner, og det er biokompatibelt for mennesker. Det blev fundet, at CS NP ‘ er var forholdsvis større i størrelse efter indlæsning med BSA. Partikelstørrelsen forventedes at stige, når BSA med succes blev indlæst i nanopartikler. Denne tendens kan muligvis skyldes molekylvægten og størrelsen af de tilsatte BSA-molekyler. Disse store partikelstørrelser kan begrænse deres anvendelse i levering af protein. Nanopartikler på 150-300 nm findes hovedsageligt i leveren og milten . Desuden er det “ideelle” størrelsesbehov for nanopartikler udviklet til kræftbehandling ifølge nogle rapporter mellem 70 og 200 nm . Selvom nanopartikler ikke bør være større end 150 nm for at krydse endotelbarrieren, rapporterer litteraturen altid penetrationen af partikler, der er større end grænserne for fenestrationer. Faktisk kan fenestration og vaskulaturen undergå modifikation under forskellige patologiske tilstande .

for eksempel vil tumorvækst inducere udviklingen af neovaskulatur karakteriseret ved diskontinuerligt endotel med store fenestrationer på 200-780 nm . Desuden blev det observeret, at partikeloverfladeladningen af BSA-indlæst nanopartikel var højere end de tomme. Dette kan skyldes den kationiske egenskab, som BSA besidder, når den er til stede i sur tilstand. De positive ladninger fra CS-og BSA-molekyler har derfor bidraget til en højere værdi af partikeloverfladeladning for de belastede nanopartikler.

positivt ladede kationiske polymerer kan effektivt binde til og beskytte nukleinsyrer såsom DNA, oligonukleotider og siRNA . I denne undersøgelse blev inkorporeringen af siRNA i CS NPs opnået ved simpelthen at blande den sure CS-opløsning med DS-opløsningen indeholdende siRNA ved stuetemperatur. Det blev fundet, at partikelstørrelsen af CS NPs var forholdsvis mindre i størrelse efter indlæsning med siRNA. Den mindre størrelse af CS NPs fyldt med siRNA kan skyldes neutralisering af negative ladninger af nukleinsyre ved Kationisk polymer, hvilket resulterer i kondenserede nanopartikler i mindre størrelse. SiRNA-indlæste CS NPs viste også et højere potentiale end tomme CS NPs, efter den samme tendens som for BSA-indlæst CS NPs.

ideelt set bør et vellykket leveringssystem have en høj grad af associerende lægemidler. De siRNA-indlæste CS NPs viste højere indfangningseffektivitet (<90%) for alle DS : CS-vægtforhold. Nanopartiklernes indfangningseffektivitet ved DS: CS vægtforhold på 1: 1, 1,5 : 1, og 2 : 1 var højere end vægtforholdet på 0,5 : 1. Dette fænomen skyldtes sandsynligvis højere andel af DS præsenteret i nanopartiklerne. Efterhånden som flere DS tilføjede, ville det lette mere BSA at blive fanget i nanopartikler. Dette kan forklares ved, at BSA er et vitterionisk molekyle. Ved pH i formuleringsmediet på 3,5-4,0 kunne opløseligheden af BSA øges stærkt på grund af øgede positive ladninger, som det besidder . Således ville BSA være i stand til elektrostatisk at fastgøre og stabilt indlæse i nanopartiklerne. I sur opløsning kunne BSA have positiv ladning og konkurrere med CS for at interagere med DS elektrostatisk. Dette fund blev bekræftet med de øgede positive overfladeafgifter for BSA-belastede CS NPS sammenlignet med ubelastede. Desuden er der multi-Ioniske steder på BSA, og denne funktion kan lette inkorporeringen af BSA i nanopartikler. Dette fund adskiller sig fra Fundet med CS-TPP NPs .

i undersøgelsen var den elektrostatiske interaktion til stede mellem BSA og CS i stedet for BSA og TPP. Det blev også foreslået, at BSA skulle opløses i en opløsning med pH højere end dets isoelektriske punkt for at BSA kunne have negativ ladning og interagere med de positivt ladede CS-molekyler. Dette fund viste derfor, at elektrostatisk interaktion er den vigtigste medvirkende faktor til at fremme inkorporeringen af BSA i nanopartikler enten via CS-proteininteraktion eller DS-proteininteraktion.

TEM tillader nanoskala visualisering af individuelle nanopartikler og giver information om både størrelse og morfologi. Partikelmorfologien er en vigtig faktor for den kolloide og kemiske stabilitet såvel som bioaktiviteten af nanopartikler. siRNA indlæst CS NPs viste uregelmæssig morfologi; imidlertid, BSA indlæst CS NPs viste langstrakt morfologi. Dette kan skyldes større størrelse af BSA, som kan vikle eller fungere som et skjold til CS, hvilket begrænser den samlede eksponering af CS inden for struktur.

Stabilitetsprofil for CS NPs ved opbevaring er også vigtig. Disse oplysninger kunne give et overblik over stabiliteten af nanopartikler under forskellige medier og temperatur. Stabiliteten af nanopartikler blev undersøgt ved at vurdere deres variation i gennemsnitlig partikelstørrelse og overfladeafladning over tid. Først blev nanopartiklerne resuspenderet i destilleret vand ved pH 6,6, som blev filtreret med 0,2 liter filter for at fjerne mulige forurenende stoffer, der var til stede i vand. Til denne undersøgelse blev kun nanopartikler fremstillet af 0,05 og 0,10% vægt/v af DS testet. Andre DS-koncentrationer blev ikke bestemt på grund af øget partikelstørrelse efter centrifugering. Partikelstørrelsen var op til nm og nm for henholdsvis 0,15% og 0,20% vægt/v DS. Forøgelsen af partikelstørrelse kan på grund af CS NPs selv erodere og miste deres sfæriske form i et vandigt miljø, og følgelig vil partikelets gennemsnitlige diameter stige som reaktion på denne erosion . Desuden faldt partikeloverfladeafgifter for nanopartiklerne fremstillet af begge koncentrationer over tid. Det blev mistanke om, at CS kan nedbrydes i vandige medier, selvom det ikke var lysosymmer. Resultaterne viste, at CS NP ‘ er var mere stabile, når de blev opbevaret ved 4 liter C, da deres partikelstørrelse og overfladeafladning var uændrede eller lidt ændrede op til 14 dage. Resultaterne antydede også, at CS NPs ikke bør opbevares ved omgivelsestemperatur, da de er tilbøjelige til nedbrydning. Resultaterne antydede derfor, at CS NP ‘ er, der opbevares ved stuetemperatur, er mere tilbøjelige til nedbrydning end dem, der blev opbevaret i kølige omgivelser. Det skyldtes sandsynligvis det kølige miljø, der kan bremse den kinetiske bevægelse af nanopartikler. Nanopartiklerne kunne således opretholde deres sfæriske form, og erosion ville være mindre tilbøjelige til at forekomme. Desuden blev det observeret, at disse nanopartikler blev aggregeret i PBS ved pH 7,4. Dette kan tilskrives lavere partikeloverfladeladning af nanopartikler i PBS, tæt på neutral. Partikeloverfladeafladning, der faldt til nul, kan indikere, at CS NPs havde gennemgået charge annullering af phosphatgrupper af PBS. Den neutrale ladede status for disse nanopartikler kan forårsage tab af intra-og intermolekylære kræfter, hvilket er vigtigt for at opretholde nanopartiklerne individuelt. Som et resultat kan disse uladede nanopartikler begynde at aggregere og destabilisere det kolloide system. I modsætning til PBS kan destilleret vand tilvejebringe adskillige hydrogenioner til dannelse af hydrogenbindinger, som kan hjælpe med at bryde aggregering af nanopartikler ved at interagere med ioniserbare grupper af CS NPs.

in vitro-frigivelsesstudiet af BSA og siRNA fra CS NPs blev udført i Tris-HCL-buffer. Frigivelsen af BSA og siRNA kunne opdeles i to faser baseret på frigivelseshastigheden. I første fase blev lægemidlet hurtigt frigivet fra CS NPs. Frigivelsen af BSA og siRNA på dette stadium kan involvere diffusion af BSA/siRNA bundet ved partikeloverfladen. I anden fase blev BSA/siRNA frigivet langsomt på grund af hævelse eller nedbrydning af polymeren. Den resterende BSA / siRNA i CS NPs ville ikke frigives fuldstændigt, før partiklerne var fuldstændigt eroderet eller opløst i frigivelsesmedium. Dette kan have været på grund af interaktionen mellem den resterende BSA/siRNA og fri aminogruppe på CS-segmenterne . Derudover forsikrede det syntetiserede system, der tidligere er blevet beskrevet som værende i stand til at blive formuleret under milde betingelser, at stabiliteten af proteinerne indlæst i CS NPs var intakt som bestemt af SDS-PAGE.

5. Konklusioner

sammenfattende viser denne undersøgelse, at CS-og DS-koncentration såvel som pH var de parametre, der kontrollerede partikelstørrelse og overfladeafladning af CS NPs. Nanopartikler mindre end 500 nm kunne opnås ved DS : CS vægtforhold på 0,5 : 1 ved pH 4. I tilfælde af BSA-indfangning har nanopartikler med højere DS : CS-vægtforhold haft højere indfangningseffektivitet på mere end 88%. Den højeste opnåede indfangningseffektivitet var på 0,10% vægt / v DS (DS : CS-forhold på 1: 1). CS NP ‘ er fyldt med siRNA viste imidlertid høj indfangningseffektivitet (>90%) for alle DS : CS-forhold. Opbevaringstemperatur og suspensionsmedium viste sig at være de faktorer, der kunne påvirke stabiliteten af CS NPs. CS NP ‘ er var labile og har tendens til at destabilisere ved omgivelsestemperatur, men tilbageholde denne labile opførsel, når der blev tilvejebragt køligt miljø (2-4 liter C). Derudover havde CS NPs bedre stabilitet i destilleret vand end i PBS, hvilket kunne skyldes hydrogenbindinger, der dannedes mellem vandmolekyler og ioniserbare grupper af CS NPs.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen personlig eller økonomisk interessekonflikt i den aktuelle forskning.

anerkendelse

forfatterne anerkender taknemmeligt “Dana Lonjakan Penerbitan” fra Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) til finansiering og støtte til det aktuelle forskningsprojekt.