Ensayo de liberación de cromo: La Forma de la Vieja Escuela de Probar las Células T Citotóxicas

Hay varios métodos que puede usar para ver si sus células T son citotóxicas, pero un ensayo de liberación de cromo con 51 cromio radiactivo (51Cr) es uno de los más antiguos. Da buenos resultados y es ideal para laboratorios que no pueden pagar o no tienen citometría de flujo fácilmente disponible.

Aquí, describiré un método simple para probar la función de destrucción de células T usando 51Cr. Pero antes de comenzar el ensayo, asegúrese de leer las medidas de seguridad adecuadas al manipular materiales radiactivos.

Elija su Objetivo y Efectores

Para realizar un ensayo de liberación de cromo, primero incuba sus células objetivo (T) con 51Cr. A continuación, incubas las células diana con células efectoras (tus células T; E). Si las células efectoras matan a los objetivos, liberarán el 51Cr, que detectarás con un contador gamma.

Los destinos y efectores que utilice dependen por completo de su aplicación. Sus células diana son con las que está probando la función de las células T. Es posible que desee matar a su objetivo (medir la citotoxicidad) o podría estar buscando ver si las células T son tolerantes (¡como probar las células fabricadas antes de que ingresen a un paciente por seguridad!). Sus células T efectoras también pueden derivarse de diferentes fuentes. Por ejemplo, puede usar líneas de células T fabricadas o células T recién aisladas de un animal.

Vamos a ser Radioactivos

Una vez que hayas reunido a tus objetivos y efectores, es hora de empezar a cocinar.

1. Cuente sus células. Puede usar un hemocitómetro o un contador automático de células. El número de celdas que necesita depende del número de condiciones y de cuántas réplicas de cada condición realice. Normalmente tengo mis ensayos por triplicado y tienen cuatro ratios (5:1, 10:1, 20:1 y 40:1 E:T). Alícuota tus células objetivo (en mi caso, 500,000 – aproximadamente 25,000 por pocillo) en tubos cónicos de 15 ml, ¡manteniendo cada condición experimental separada! Asegúrese de suspender sus células en un volumen pequeño para que tengan la oportunidad de entrar en contacto con el cromo.

1. Agrega el 51Cr (alrededor de 50 µCi) e incuba tus objetivos con el cromo durante una hora. Golpee los tubos aproximadamente cada 20 minutos para aumentar las oportunidades de que las células absorban el cromo.

1. Mientras incubas.Esta larga incubación es un buen momento para configurar sus células efectoras. Lave las células T dos veces con PBS para eliminar el exceso de citoquinas que podrían sesgar los resultados. A continuación, volver a suspender en los medios de comunicación adecuados.

1. Una vez que haya terminado los lavados, ¡estará listo para poner sus efectores en el plato! Normalmente uso una placa de 96 pocillos, ya que los volúmenes son bastante pequeños. Coloque los efectores en diferentes proporciones con respecto a los objetivos para determinar el umbral de muerte. Normalmente realizo el ensayo en triplicados, pero depende de cuántas células tenga disponibles. las proporciones 40, 20, 10 y 5 a 1 (Efectores a Objetivos) son una buena plantilla si tiene suficientes celdas disponibles.

Además de estas pruebas, configure dos condiciones de control:

• un control de liberación espontánea que contiene solo células diana (básicamente un control negativo porque no debe haber muerte sin los efectores) y
• un control de liberación máxima en el que se lyse las células diana (un control positivo que muestra la cantidad máxima de cromo absorbida por las células).

1. De vuelta a esas células Objetivo Once Una vez que las células objetivo hayan terminado de incubarse, lávelas tres veces con medio de cultivo celular para eliminar el exceso de cromo. Gire las células suavemente a 400 g durante 5 minutos para cada uno de estos lavados. Decantar el sobrenadante en un contenedor de residuos que se pueda transferir a un área de descomposición segura en lugar de tratar de pipetearlo. Esto ayudará a reducir la posible contaminación, ya que no tendrá que lidiar con ninguna propina.

1. Después de los lavados, ¿resuspender las células a 5000 células por cada 100?l. A continuación, añadir 100?l de células a cada pozo, incluso los pozos espontáneos y máximos. Incubar las células juntas durante un mínimo de 4 horas a 37°C, el tiempo exacto depende de la aplicación.

1. Cuatro horas después FourSaca tu plato de la incubadora. Añadir 100?l de una solución de tritón-x al 1% a sus células en los pocillos máximos para lisar las células y liberar todo el cromo.

1. Gire la placa hacia abajo a 1250 rpm durante diez minutos para pelletear las celdas.

1. Transfiera el sobrenadante de cada pozo al pozo de una placa absorbente (por ejemplo, placas de luz), teniendo cuidado de no tocar el gránulo en el fondo del pozo.

1. Deja que el plato se seque durante la noche. Por la mañana, colócalo en el lector de platos y obtén tus resultados.

Los resultados que vea dependerán de su aplicación específica

Calcular los Resultados de Su Ensayo de Liberación de cromo

Una vez que tenga las lecturas, debe realizar un cálculo simple para determinar la citotoxicidad de sus células.

Primero, promedia tus triplicados para cada condición. Luego tome esos promedios y conéctelos a esta fórmula:

(Liberación de cromo para condiciones de interés – Liberación de cromo en pozos espontáneos)/ (liberación máxima de cromo – Liberación de cromo en pozos espontáneos)

Multiplique el valor por 100 para obtener su porcentaje de lisis.