Frontiers in Genetics

El ensayo cometa alcalino (electroforesis en gel unicelular) es el método más utilizado para medir el daño al ADN en células eucariotas (Neri et al., 2015). Detecta roturas de hebras (SBs) y sitios alcalino-lábiles a frecuencias de unos pocos cientos a varios miles de roturas por célula, un rango biológicamente útil, que se extiende desde niveles de daño endógeno bajos hasta el grado de daño que se puede infligir experimentalmente sin matar células. La digestión de los nucleoides, después de la lisis, con ciertas endonucleasas de reparación específicas de la lesión permite medir daños distintos del SBs; en particular, la formamidopirimidina DNA glicosilasa (FPG) se ha utilizado ampliamente para detectar purinas alteradas, que la enzima convierte en roturas. Recientemente, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) desarrolló un ensayo bidimensional de cometas de Dos colas (TT-comet) que puede diferenciar entre roturas de ADN de cadena simple (SSBs) y de doble cadena (DSBs) en los mismos cometas en espermatozoides.

Desde el primer informe de Ostling y Johanson (1984), el ensayo comet se ha utilizado ampliamente en ensayos de genotoxicidad de sustancias químicas, tanto en modelos in vitro como in vivo. Una ventaja de este último es que se pueden estudiar células de diversos tejidos, en una amplia variedad de organismos eucariotas. Durante los últimos 15 años, el ensayo comet se ha utilizado ampliamente en Drosophila melanogaster para probar la genotoxicidad de sustancias químicas (Gaivão y Sierra, 2014). Este enfoque es muy útil ya que Drosophila melanogaster es un modelo valioso para todo tipo de procesos relacionados con la salud humana, incluidas las respuestas al daño al ADN.

El uso de plantas, así como de una amplia gama de especies terrestres y acuáticas en el ensayo de cometas, ha aumentado drásticamente en la última década (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), en particular en la evaluación de riesgos ambientales (ERA). Un estudio de validación reciente ha indicado que el ensayo de cometa in vitro combinado con FPG puede ser una línea de evidencia complementaria efectiva en ERA, incluso en escenarios naturales particularmente desafiantes, como los ambientes estuarinos (Costa et al., 2014).

Durante la última década, la producción y el uso de materiales de tamaño nanométrico han aumentado significativamente, y como consecuencia también lo ha hecho la exposición humana a este tipo de materiales. Identificar y comprender los peligros de los nanomateriales en relación con la salud humana no es una cuestión sencilla. No solo la composición química de los SNm es responsable de su genotoxicidad, sino que también la forma, el área de superficie específica, el tamaño, la distribución de tamaños y el potencial zeta determinan los efectos de estos materiales en el genoma. Aunque todavía existe un debate sobre la idoneidad de los ensayos de genotoxicidad estándar para estudiar los efectos del SNm, hasta ahora el método más utilizado en nanogenotoxicología, gracias a su robustez, versatilidad y fiabilidad, ha sido el ensayo comet (Azqueta y Dusinska, 2015). Además de investigar la genotoxicidad de la radiación y diversos productos químicos, el ensayo de cometa vegetal también se ha utilizado recientemente para estudiar el impacto genotóxico de las NPs (Santos et al., 2015).

Otra aplicación del ensayo comet es una valiosa herramienta experimental para la vigilancia biológica humana, así como en estudios clínicos. La recolección de sangre o tejidos no siempre es factible en todos los sujetos humanos, y otras fuentes de células que se pueden recolectar de manera no invasiva se han probado con el ensayo comet; por ejemplo, varios tipos de células epiteliales (Rojas et al., 2014), así como el esperma (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

Paralelamente al desarrollo del ensayo comet para la medición de daños en el ADN, se han desarrollado ensayos para la reparación del ADN, un elemento esencial en la respuesta celular genotóxica. El enfoque más simple para medir la reparación del ADN es tratar las células con un agente que daña el ADN y luego incubarlas para permitir que la reparación continúe, midiendo la cantidad de daño restante a intervalos. En 1994 se describió un enfoque bioquímico alternativo para evaluar la capacidad de reparación (Collins et al., 1994), y desde entonces se han publicado varias versiones modificadas del ensayo para medir tanto la reparación de escisión de base (BER) como la reparación de escisión de nucleótidos (NER) (revisado por Azqueta et al., 2014). Este enfoque bioquímico se ha aplicado para estudiar los efectos del medio ambiente, la nutrición, el estilo de vida y la ocupación en la capacidad de reparación del ADN, además de investigaciones clínicas (Azqueta et al., 2014).

Este enfoque alternativo in vitro para la reparación del ADN evalúa la actividad de reparación de un extracto celular en un sustrato de ADN que contiene lesiones definidas. El ensayo cometa se utiliza para seguir la acumulación de roturas de ADN (intermedios de reparación) con el tiempo de incubación. Recientemente, Slyskova y sus colegas fueron los primeros en aplicar con éxito los ensayos de reparación de ADN in vitro para BER y NER en muestras de tejido humano; específicamente, biopsias de carcinoma colorrectal (Slyskova et al., 2012, 2014).

Se adoptó recientemente un tipo diferente de ensayo de reparación de ADN, que permite que las células incrustadas en el gel se reparen antes de la lisis, para estudiar la cinética de reparación de ADN con más detalle; específicamente, estudiar la regulación de las proteínas BER por modificaciones post-transcripcionales (Nickson y Parsons, 2014). Otra forma de estudiar la reparación del ADN, a nivel de genes específicos, es con la técnica cometa-PEZ, que hace uso de sondas de ADN etiquetadas con fluorescentes que se hibridan con el ADN monocatenario de la cola del cometa. McAllister et al. (2014) utilizaron este método para estudiar la reparación de ruptura de cadenas preferenciales en ADN a granel, así como en regiones seleccionadas con genes transcritos activamente.

El estudio de la cinética de reparación del daño inducido nos ayudará a comprender las respuestas celulares a los productos químicos genotóxicos. Además, la importancia de la reparación del ADN como actor en el proceso (anticancerígeno)se puede dilucidar examinando la reparación a nivel de tejidos diana específicos del cáncer. Es probable que la regulación de la reparación—y otros aspectos de la respuesta celular a los compuestos genotóxicos—implique mecanismos epigenéticos y el ensayo comet se ha adoptado con éxito para medir los cambios en el patrón de metilación del ADN global en células individuales en diversas condiciones de crecimiento (Lewies et al., 2014).

Por ciento de ADN de cola se recomienda como el mejor descriptor para las frecuencias de rotura de ADN, ya que los cometas a los que se hace referencia, y el alcance del daño, se pueden visualizar fácilmente. Sin embargo, muchos investigadores todavía prefieren el uso del momento de cola (Møller et al., 2014). De hecho, los dos descriptores están influenciados de manera similar por las condiciones de ensayo (Azqueta et al., 2011; Ersson y Möller, 2011).

La variabilidad en el ensayo de cometas es un problema importante, ya sea que surja del uso de diferentes protocolos, o de variaciones experimentales incontrolables o aleatorias. Se recomienda la inclusión de estándares de referencia en todos los experimentos, especialmente cuando un gran número de muestras—de un ensayo de biomonitorización, por ejemplo—se analizan en diferentes ocasiones. Los estándares de referencia son células con una cantidad conocida de daño al ADN; células no tratadas (control negativo), células expuestas a rayos X (control positivo) o células tratadas con fotosensibilizador más luz (control positivo para ensayos que incluyen incubación de GPA), preparadas por lotes y congeladas como alícuotas. Si se produce una variación sustancial en los estándares en una serie de experimentos, los resultados de la muestra se pueden normalizar (Collins et al., 2014). Si se intercambian normas de referencia entre laboratorios, los resultados de estos laboratorios pueden compararse más fácilmente.

Las células estándar de referencia se colocan normalmente en geles en paralelo a los geles de muestra. Normas internas—es decir,, células estándar en el mismo gel que las células de muestra, sería ideal; pero, por supuesto, es esencial poder distinguir los dos tipos de células. Las células de peces que son más grandes o más pequeñas en tamaño de genoma en comparación con las células humanas se han adoptado con éxito para este propósito (Brunborg et al., 2015). Estas células de referencia se pueden utilizar en combinación con una curva estándar o de calibración (establecida con células que reciben diferentes dosis de radiación ionizante), lo que permite una cuantificación más precisa de las lesiones de ADN expresadas como una frecuencia de rotura de ADN en lugar de % de ADN de cola.

Las estadísticas son una herramienta importante en todas las aplicaciones del ensayo comet, para comprobar si se producen pequeñas diferencias por casualidad. Se han publicado descripciones concisas del análisis estadístico y recomendaciones para las pruebas (Lovell et al., 1999; Lovell y Omori, 2008). Møller y Loft (2014) nos recuerdan que, para mantener el análisis estadístico del ensayo de cometas simple, el diseño del estudio apropiado y la potencia estadística deben considerarse cuidadosamente al planificar los experimentos.

Al igual que con todos los ensayos biológicos, la integración de datos es crucial para interpretar los resultados de los ensayos de cometas dentro del panorama general. La integración de la información proporcionada por el ensayo comet con otros indicadores de daño al ADN y respuestas celulares (por ejemplo, estrés oxidativo, división celular o muerte celular) se ha aplicado tanto en ERA (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015), así como estudios en humanos (biomonitorización) (por ejemplo, Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Incluir también datos “omicos” ayudará a desentrañar el modo de acción de los compuestos genotóxicos (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – aunque vale la pena señalar que varios estudios han demostrado que las medidas fenotípicas de reparación de ADN no necesariamente se correlacionan con datos genómicos o transcriptómicos (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); los diferentes enfoques deben considerarse complementarios.

Incluso después de tres décadas de desarrollo y modificación, el ensayo comet sigue siendo un ensayo bastante simple, versátil pero laborioso. Recientemente se revisaron varias modificaciones de alto rendimiento del ensayo (Brunborg et al., 2014). Tanto las aplicaciones in vivo como in vitro obtendrían una gran ventaja de las mejoras adicionales en la eficiencia, la estandarización del protocolo y el rendimiento. La automatización y la miniaturización son estrategias comunes en muchas áreas de la biología, permitiendo cambios de órdenes de magnitud en el número de muestras analizadas por experimento, reduciendo el sesgo subjetivo y mejorando la reproducibilidad.

Entonces, ¿qué podemos esperar en los próximos 30 años? Aceptación del ensayo de cometas in vitro para pruebas de genotoxicidad, puntuación automatizada de cometas de bajo costo para salvar a los investigadores de la observación interminable de microscopios, estandarización de protocolos (quizás) y estándares de referencia internos confiables, más estudios de biomonitorización humana de reparación de ADN (aceptando que los ensayos fenotípicos tienen un lugar importante junto con la genómica y la transcriptómica), monitoreo ambiental utilizando una variedad de especies animales y vegetales; y muchos más desarrollos y aplicaciones impredecibles.

Declaración de Conflicto de Intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses potencial.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a todos los autores, así como a los revisores y editores que han contribuido a este Tema de Investigación de Fronteras. SL es beneficiaria de una beca postdoctoral del Fondo de Investigación AXA y del Premio Cefic-LRI de Ciencia Innovadora 2013. AA agradece el apoyo personal del Ministerio de Economía y Competitividad (programa Ramón y Cajal, 2013) del Gobierno español.