Mutantes promotores de CMV con una propensión reducida a la pérdida de productividad en células CHO

Con el fin de monitorear los efectos de los sitios de GpC propensos a la metilación desde el potenciador, la región proximal y la región promotora central, optamos por investigar no solo C-179, sino también las citosinas en las posiciones -508 (C-508) y -41 (C-41). Ninguno de los sitios seleccionados de GpC se superpone con los sitios conocidos de unión de factores de transcripción en especies de Cricetidae. Para mantener el contenido general de GC, se realizaron transversiones de C a G (Fig. 1a). Además de la C-41, la C-13 es la segunda citosina en la región promotora central que parece estar metilada con frecuencia. Debido a que la mutación de C-13 a G crearía un nuevo sitio de GpC, preferimos investigar C-41G. Las variantes promotoras mutadas se abreviaron con un código de tres letras, por ejemplo, la variante GCC tiene guanina en lugar de citosina en la posición -508, mientras que las bases de citosina en -179 y -41 se conservan. CCC es el control no mutado del VCM-MIE (Fig. 1a). Los promotores mutados o nativos se introdujeron en varios plásmidos y se colocaron aguas arriba de diferentes genes reporteros.

Para ver si las mutaciones afectan la fuerza del promotor, realizamos dos experimentos independientes transfiriendo transitoriamente plásmidos reporteros que expresaban fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) en células CHO-K1 y examinamos la expresión de SEAP cinco días después de la transfección. Se utilizó como referencia el promotor no mutado (Fig. 1b). La expresión del PAES de los promotores de GGG, GCG y CGC fue consistentemente un 20% menor que la del promotor no mutado, con una variación menor entre los experimentos replicados. En general, las mutaciones de C a G mostraron una tendencia a una fuerza promotora modestamente reducida que, sin embargo, parecía ser aceptable.

A continuación, preguntamos si las variantes promotoras del VHC-MIE influyen en la estabilidad de expresión de las células CHO transfectadas permanentemente durante el cultivo a largo plazo. Para este propósito, elegimos un reportero eGFP que permite el análisis citométrico de la expresión génica del reportero a nivel de una sola célula. Los plásmidos reporteros de eGFP se transfectaron a células CHO-K1 y se seleccionaron de tres a cuatro grupos independientes de células transfectadas permanentemente con metotrexato (MTX). Estos se cultivaron durante tres meses en presencia del agente de selección MTX. Treinta y cuatro y ochenta y siete días después de la transfección, la expresión de eGFP se midió por citometría (se perdieron dos piscinas entre el día 34 y el 87 debido a la contaminación). Se calcularon las medias geométricas de la intensidad de fluorescencia de 10.000 eventos por medición para cada grupo celular y se trazaron para ambos puntos de tiempo (Fig. 1c). Treinta y cuatro días después de la transfección hubo poca diferencia entre los constructos. Solo un grupo de CGC mostró niveles de expresión elevados. Ochenta y siete días después de la transfección, dos de cada cuatro grupos transfectados con CGC y dos de cada tres grupos transfectados con CCG mostraron valores claramente más altos de eGFP que todos los demás grupos, transfectados con el control no mutado o con las variantes promotoras restantes. Estas observaciones sugirieron un efecto estabilizador de las mutaciones únicas de C-41G o C-179G en la expresión de eGFP. Para consolidar este resultado, repetimos el experimento con ambas variantes promotoras y con un mayor número de piscinas. Generamos diez piscinas con CCG o CCC, respectivamente, y ocho piscinas con CGC (se perdieron dos piscinas por contaminación). Las células se cultivaron como antes y se analizaron por citometría de flujo desde el día 42 hasta el día 69 después de la transfección (Fig. 1d y Suplemento Fig. S1 en línea). Después de 42 días, la expresión de eGFP se incrementó fuertemente en cuatro grupos de CCG en comparación con los grupos de control de CCC, mientras que dos grupos de CGC mostraron un aumento moderado en la expresión de eGFP (Fig. 1d, panel izquierdo). Después de 69 días, tres grupos de CCG todavía mostraban niveles altos de eGFP, mientras que la expresión de eGFP de los grupos de CGC había descendido a los niveles de control de CCC (Fig. 1d, panel derecho). Las diferencias entre los grupos se probaron en cada momento con la prueba no paramétrica de Steel-Dwass. El nivel alfa se fijó en 0,05. Se observó una diferencia significativa entre CCG y CCC el día 56 después de la transfección (p = 0,0305; ver Suplemento Fig. S1 en línea). Tomados en conjunto, los resultados de la Fig. 1c, d sugirió que ambas mutaciones C-41G y C-179G pueden retrasar la pérdida de la expresión génica recombinante impulsada por el VHC-MIE.

Las mutaciones C-41G y C-179G inhiben completamente la metilación del ADN en el sitio respectivo, ya que la guanina no se puede metilar. Nos preguntamos si estas mutaciones también se ven afectados los niveles de metilación en otros sitios CpG dentro de hCMV MIE. Por lo tanto, medimos los niveles de metilación de todos los sitios de GpC en las variantes individuales de MIE-VCM mediante conversión de bisulfito junto con secuenciación de próxima generación. Para ello, se extrajo ADN genómico de los grupos celulares del segundo experimento 42 y 69 días después de la transfección y se trató con bisulfito para discriminar entre citosina metilada y no metilada. El ADN del VHC-MIE fue amplificado y secuenciado con el sistema Illumina MiSeq (Fig. 1e). El C-179 se metiló con mayor fuerza en todos los grupos transfectados con CCC o CCG, lo que confirma observaciones previas con el VCM-MIE12 sin mutar. Además, observamos un patrón de metilación distinto que era muy similar con todas las piscinas, pero difería en la intensidad general. En particular, los C-508 y C-41 sin mutar se encontraban sistemáticamente entre los sitios metilados con más frecuencia. La mutación de C-41 en la variante promotora CCG, particularmente la mutación de C-179 en la variante CGC, parece disminuir uniformemente la metilación de todos los sitios de CpG en lugar de cambiar el patrón de metilación. Cuando calculamos los niveles de metilación promedio en todos los sitios de GpC para cada grupo, detectamos una metilación general más baja con las variantes promotoras mutadas(ver Fig. Suplementaria. S2 en línea). La diferencia fue más pronunciada con la variante CGC, pero no alcanzó significación estadística con la prueba de Dwass de acero (α = 0,05). En promedio, la metilación aumentó con el tiempo con todos los constructos.

Además del silenciamiento del promotor epigenético, la pérdida de copias transgénicas es una de las principales causas de inestabilidad de la producción en células recombinantes20. Para estimar la contribución relativa, se midieron los números de copias de plásmidos por qPCR 42 y 69 días después de la transfección. El número medio de copias de plásmidos disminuyó con el tiempo, sin diferencias obvias entre los constructos (véase la Fig. S2 en línea). Curiosamente, la distribución de los números de copia se desplazó hacia valores más bajos en el grupo CGC. Sin embargo, cuando probamos la significancia estadística con la prueba de Dwass de acero, las diferencias entre los constructos no resultaron significativas (α = 0.05).

Los grupos de células transfectadas permanentemente son mezclas muy heterogéneas de clones que difieren en la expresión de transgénicos y la tasa de crecimiento. Los clones altamente productivos tienden a tener una tasa de crecimiento baja21. Por lo tanto, las células de producción baja, muchas de las cuales están presentes en el cultivo después de la transfección, casi inevitablemente crecen en exceso a los productores altos tarde o temprano. Para minimizar este sesgo, investigamos las mutaciones C-179G y C-41G en líneas celulares clonales. Dado que nuestro objetivo era evaluar los efectos en la producción de un producto comercial potencial, cambiamos a una proteína de fusión IgG-IL2 como reportera. Por lo tanto, las variantes promotoras que contenían ambas mutaciones solas (CGC o CCG) o en combinación (CGG) se insertaron aguas arriba de la cadena ligera y el gen de cadena pesada de un plásmido de expresión de IgG-IL2.

Los plásmidos de expresión que transportaban CCG, CGC, CGG o el EIM de VHC no mutado se transfectaron a células CHO-K1 y se aislaron clones transfectados de forma estable en placas de 384 pocillos. Treinta líneas celulares clonales por construcción fueron seleccionadas aleatoriamente y expandidas en placas de seis pocillos. Después de que las líneas celulares mostraran un crecimiento estable, estudiamos su productividad durante aproximadamente dos meses, desde el día 68 hasta el día 134 después de la transfección. Algunas líneas celulares se perdieron debido a la contaminación o la viabilidad reducida, sin embargo, se examinaron de 23 a 29 clones por construcción durante todo el período de tiempo.

Durante todo el estudio se determinaron las concentraciones de IgG-IL2 en sobrenadantes de cultivo celular y la productividad por célula y día (productividad específica qP). Al inicio (día 68) y al final (día 134) del estudio, las líneas celulares transfectadas con CGC mostraron títulos significativamente más altos que los transfectantes control (α = 0,05; Fig. 2a). También se observaron líneas celulares con títulos notablemente altos entre los transfectantes CGG el día 68 y entre los transfectantes CCG y CGG el día 134. Cuando comparamos productividades específicas entre líneas celulares transfectadas con diferentes constructos, hicimos observaciones similares (Fig. 2b). Para compensar la imprecisión en el recuento celular, promediamos las productividades específicas qP de dos pasajes al principio (día 68-71 y 83-86 después de la transfección, que representan los primeros puntos de datos disponibles) y tres pasajes al final del cultivo a largo plazo (día 124-127, día 127-131 y día 131-134 después de la transfección). Se observaron diferencias significativas entre líneas celulares transfectadas con CGC o CCC al final del cultivo a largo plazo (α = 0,05).

Títulos más altos y productividades específicas de líneas celulares portadoras de G-179 o G-41 sugirieron un efecto estabilizador de estas mutaciones en la expresión génica impulsada por el VHC-MIE. Para documentar este efecto, calculamos la alteración porcentual de qP durante el cultivo a largo plazo para cada línea celular individual como la medida más adecuada de su estabilidad de producción (Fig. 2c). Por supuesto, esto era factible solo con líneas celulares que aún producían IgG-IL2 el día 68 después de la transfección. Un transfectante de control aumentó su productividad específica en un 500% y se identificó como un valor atípico mediante el análisis de valores atípicos de jackknife (Fig. 2c, gráfico izquierdo). Por lo tanto, esta línea celular se excluyó del análisis posterior (Fig. 2c, parcela derecha). Las líneas celulares transfectadas con CGC o CCG fueron significativamente más estables que las líneas celulares de control transfectadas con CCC (α = 0,05). Sorprendentemente, el doble mutante CGG no se diferenció del control.

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