CMV-promoottorimutantit, joilla on pienempi taipumus tuottavuuden menetykseen CHO-soluissa

seurataksemme metylaatioon taipuvaisten CPC-alueiden vaikutuksia tehostajan, proksimaalisen alueen ja ydinpromoottori-alueen osalta päätimme tutkia C-179: n lisäksi sytosiineja kohdissa -508 (C-508) ja -41 (C-41). Mikään valituista CPC-alueista ei ole päällekkäinen Cricetidae-lajien tunnettujen transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtien kanssa. Säilyttääksemme GC: n kokonaispitoisuuden suoritimme C-G transversioita (Kuva. 1 A). C-41: n lisäksi C-13 on toinen sytosiini ydinpromoottori-alueella, joka näyttää usein metyloituvan. Koska C-13: n mutaatio g: ksi loisi uuden CpG-alueen, halusimme mieluummin tutkia C-41g: tä. mutatoituneet promoottorimuunnokset lyhennettiin kolmikirjaimisella koodilla, esim.muunnoksessa GCC on guaniini sytosiinin sijaan asemassa -508, kun taas sytosiiniemäkset -179 ja -41 säilyvät. CCC on muuntamaton ohjaus hCMV-MIE (Kuva. 1 A). Mutatoituneita tai syntyperäisiä promoottoreita kulkeutui erilaisiin plasmideihin ja sijoitettiin eri reportterigeenien yläjuoksulle.

selvittääksemme, vaikuttavatko mutaatiot promoottorin vahvuuteen, teimme kaksi itsenäistä koetta transfektiolla transfektoimalla transfestiivisesti reporteriplasmideja, jotka ilmentävät cho-K1-soluihin erittyviä alkioalkioisia alkalisia fosfataaseja (SEAP), ja tutkimme SEAPIN ilmentymistä viisi päivää transfektion jälkeen. Muuntamatonta promoottoria käytettiin viitteenä (Kuva. 1b). GGG: n, GCG: n ja CGC: n promoottoreiden SEAP-arvo oli jatkuvasti noin 20% pienempi kuin muuntamattomalla promoottorilla, ja toistokokeiden välillä oli vain vähän vaihtelua. Yleensä C-G-mutaatioissa ilmeni taipumusta alentuneeseen promoottorilujuuteen, joka kuitenkin vaikutti hyväksyttävältä.

seuraavaksi kysyimme, vaikuttavatko hCMV-MIE-promoottorivariantit pysyvästi transfektoitujen CHO-solujen ilmaisun stabiilisuuteen pitkän aikavälin viljelyn aikana. Tätä tarkoitusta varten valitsimme eGFP-Reporterin, joka mahdollistaa reporter-geenin ilmentymisen sytometrisen analyysin yksisolutasolla. eGFP reporter-plasmidit siirrettiin CHO-K1-soluihin ja kolmesta neljään itsenäistä ryhmää pysyvästi transfektoituja soluja valittiin metotreksaatilla (MTX). Näitä viljeltiin kolmen kuukauden ajan valinta-aineen MTX läsnä ollessa. Kolmekymmentäneljä ja kahdeksankymmentäseitsemän päivää verensiirron jälkeen eGFP-ekspressio mitattiin sytometrialla (kaksi poolia menetettiin 34.ja 87. päivän välillä kontaminaation vuoksi). Kullekin solupoolille laskettiin 10 000 tapahtuman fluoresenssin intensiteetin geometriset keskiarvot mittausta kohti ja piirrettiin molemmille aikapisteille (Kuva. 1c). Kolmekymmentäneljä päivää verensiirron jälkeen konstruktioiden välillä ei ollut juuri eroa. Vain yhdessä CGC-poolissa näkyi kohonneita ilmaisutasoja. Kahdeksankymmentäseitsemän päivän kuluttua siirrosta kaksi neljästä CGC: llä transfektoidusta poolista ja kaksi kolmesta CCG: llä transfektoidusta poolista näyttivät selvästi korkeampia eGFP-arvoja kuin kaikki muut poolit, transfektoituina joko muuntamattomalla kontrollilla tai muilla promoottori-muunnoksilla. Nämä havainnot viittasivat yksittäisten C-41G-tai C-179g-mutaatioiden stabiloivaan vaikutukseen eGFP: n ilmentymisessä. Vahvistaaksemme tämän tuloksen, toistimme kokeen sekä promoottori variantteja ja suurempi määrä pooleja. Tuotimme kymmenen allasta CCG: llä tai CCC: llä vastaavasti ja kahdeksan allasta CGC: llä (kaksi allasta menetettiin saastumisen vuoksi). Soluja viljeltiin entiseen tapaan ja analysoitiin virtaussytometrialla päivästä 42 päivään 69 verensiirron jälkeen (kuva. 1d ja täydentävä Kuva. S1 online). 42 päivän kuluttua eGFP: n ilmentymä kasvoi voimakkaasti neljässä CCG-ryhmässä verrattuna CCC-kontrolliryhmään, kun taas kahdessa CGC-ryhmässä eGFP: n ilmentymä kasvoi kohtalaisesti (Kuva. 1D, vasen paneeli). 69 päivän jälkeen kolmessa CCG-ryhmässä oli edelleen korkeita eGFP-tasoja, kun taas CGC-poolien EGFP-ilmentymä oli laskenut CCC-kontrollitasoille (Kuva. 1D, oikea paneeli). Ryhmien väliset erot testattiin jokaisena ajankohtana ei-parametrisella teräs-Dwass-testillä. Alfa-tasolle asetettiin 0,05. Verensiirron jälkeisenä päivänä 56 havaittiin merkittävä ero CCG: n ja CCC: n välillä (p = 0, 0305; KS.täydentävä Kuva. S1 online). Yhdessä tulokset Fig. 1c, d ehdotti, että sekä C-41G-että C-179g-mutaatiot voivat viivästyttää hCMV-MIE-vetoisen rekombinanttigeenin ekspression häviämistä.

mutaatiot C-41g ja C-179g estävät DNA: n metylaation täysin kyseisessä kohdassa, koska guaniinia ei voida metyloida. Pohdimme, vaikuttivatko nämä mutaatiot myös muiden Hcmv-MIE: n CPC-kohtien metylaatiotasoihin. Siksi mittasimme yksittäisten hCMV-MIE-varianttien kaikkien CPC-alueiden metylaatiotasot bisulfiittikonversiolla yhdistettynä seuraavan sukupolven sekvensointiin. Tätä varten otimme toisen kokeen solualtaista genomista DNA: ta 42 ja 69 päivän kuluttua siirrosta ja käsittelimme sitä bisulfiitilla erotellaksemme metyloidun ja metyloimattoman sytosiinin. hCMV-MIE-DNA monistettiin ja sekvensoitiin Illumina MiSeq-järjestelmällä (Kuva. 1 e). C-179 metyloitui voimakkaimmin kaikissa yhteenliittymissä, joissa transfektoitiin joko CCC: llä tai CCG: llä, mikä vahvistaa aiemmat havainnot muuntamattomalla hCMV-MIE12: lla. Lisäksi havaitsimme erillisen metylaatiomallin, joka oli hyvin samanlainen kaikilla altailla, mutta poikkesi kokonaisvoimakkuudeltaan. Erityisesti muuttamattomat C-508 ja C-41 kuuluivat johdonmukaisesti useimmin metyloituneisiin kohtiin. C-41: n mutaatio promoottorin muunnoksessa CCG, erityisesti C-179: n mutaatio muunnoksessa CGC, näyttää vähentävän tasaisesti kaikkien CPC-alueiden metylaatiota sen sijaan, että se muuttaisi metylaatiomallia. Kun laskimme keskimääräiset metylaatiotasot kaikilla CpG-alueilla kullekin altaalle, havaitsimme alhaisemman metylaation mutatoituneilla promoottorivarianteilla (Katso täydentävä Kuva. S2 online). Ero oli suurin variantti CGC: llä, mutta se ei saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä Steel-Dwass-testillä (α = 0,05). Keskimäärin metylaatio lisääntyi ajan myötä kaikilla konstruktioilla.

epigeneettisen promoottorin hiljentymisen lisäksi transgeenikopioiden häviäminen on merkittävä syy rekombinanttisolu20: n tuotannon epävakauteen. Arvioidaksemme suhteellisen osuuden mittasimme plasmidikopioluvut qPCR: llä 42 ja 69 päivää verensiirron jälkeen. Plasmidien keskimääräiset kopioluvut vähenivät ajan myötä, eikä konstruktioiden välillä ollut selvää eroa(KS. S2 online). Mielenkiintoista on, että kopiolukujen jakauma siirtyi CGC-ryhmässä kohti alempia arvoja. Kun testasimme tilastollista merkitsevyyttä teräs-Dwass-testillä, konstruktioiden väliset erot eivät kuitenkaan osoittautuneet merkittäviksi (α = 0,05).

pysyvästi transfektoituneiden solujen poolit ovat erittäin heterogeenisiä kloonien seoksia, jotka eroavat transgeenin ilmentymisen ja kasvunopeuden suhteen. Erittäin tuottavilla klooneilla on yleensä matalampi kasvu21. Siksi heikosti tuottavat solut, joista monet ovat läsnä viljelmässä verensiirron jälkeen, kasvavat lähes väistämättä suurtuottajien eduksi ennemmin tai myöhemmin. Tämän vinouman minimoimiseksi tutkimme C-179g: n ja C-41g: n mutaatioita kloonisissa solulinjoissa. Koska pyrimme arvioimaan mahdollisen kaupallisen tuotteen tuotannon vaikutuksia, siirryimme toimittajana IgG-IL2-fuusioproteiiniin. Täten promoottorimuunnokset, jotka sisälsivät molemmat mutaatiot joko yksin (CGC tai CCG) tai yhdistelmänä (CGG), lisättiin kevyestä ketjusta ja Raskasketjugeenistä IgG-IL2-ekspressioplasmidilla.

Ekspressioplasmidit, joissa oli joko CCG: tä, CGC: tä, CGG: tä tai muuntamatonta hCMV-MIE: tä, transfektoitiin cho-K1-soluihin ja stabiilisti transfektoidut kloonit eristettiin 384-kuoppalevyihin. Kolmisenkymmentä kloonisolulinjaa konstruktiota kohti valittiin satunnaisesti ja laajennettiin kuusikaivolevyiksi. Kun solulinjat olivat osoittaneet vakaan kasvun, tutkimme niiden tuottavuutta noin kaksi kuukautta, päivästä 68 päivään 134 verensiirron jälkeen. Joitakin solulinjoja menetettiin saastumisen tai heikentyneen elinkelpoisuuden vuoksi, mutta silti 23-29 kloonia rakennusta kohti tutkittiin koko ajan.

koko tutkimuksen aikana määritimme IgG-IL2-pitoisuudet soluviljelmän supernatanteissa ja tuottavuuden solua ja päivää kohti (spesifinen tuottavuus qP). Tutkimuksen alussa (päivä 68) ja lopussa (päivä 134) CGC: llä transfektoitujen solulinjojen tiitterit olivat merkitsevästi korkeammat kuin verrokkisiirroilla (α = 0, 05; Kuva. 2 a). Solulinjoja, joiden tiitterit olivat huomattavan korkeat, havaittiin myös CGG-transfektanteilla päivänä 68 ja CCG-ja CGG-transfektanteilla päivänä 134. Kun vertasimme eri konstruktioilla transfektoitujen solulinjojen välisiä erityisiä tuottavuuksia, teimme samanlaisia havaintoja (Kuva. 2b). Kompensoidaksemme solulaskennan epätarkkuutta laskimme keskimäärin kahden alkuosan (päivät 68-71 ja 83-86 verensiirron jälkeen, jotka edustavat varhaisimpia saatavilla olevia datapisteitä) ja kolmen jakson (päivät 124-127, päivät 127-131 ja päivät131-134 verensiirron jälkeen) erityiset tuottavuus qP. CGC: llä tai CCC: llä transfektoitujen solulinjojen välillä havaittiin merkittäviä eroja pitkäaikaisen viljelyn lopussa (α = 0, 05).

hCMV-MIE-variantit CGC ja CCG stabiloivat rekombinanttiproteiinin tuotantoa kloonisissa CHO-solulinjoissa.

(a) cho-kloonien IgG-IL2-titterit 68 päivää (vasen paneeli) ja 134 päivää (oikea paneeli) verensiirron jälkeen. (b) pitkän aikavälin viljelyn alussa (vasen paneeli) ja lopussa (oikea paneeli) olevien cho-kloonien erityinen tuottavuus qP. Varhaiset qP-arvot laskettiin laskemalla kahden varhaisen kohdan qP-arvot, jotka edustivat kahta varhaisinta datapistettä (päivät 68-71 ja päivät 83-86 transfektion jälkeen). Myöhäiset qP-arvot laskettiin laskemalla kolmen viimeisen kohdan keskiarvo (päivät 124-127, päivät 127-131 ja päivät 131-134 verensiirron jälkeen) C) erityistuotteiden prosentuaalinen muutos ∆QP pitkäaikaisen viljelyn aikana b kohdassa esitettyjen tietojen perusteella, joissa on yksi jackknife–analyysillä tunnistettu poikkeava tekijä (vasen paneeli) ja ilman (oikea paneeli). Tutkimuksessa tarkasteltiin vain klooneja, jotka tuottivat havaittavia määriä tuotetta 68.päivänä. A-c) promoottorivarianttien tunnistetiedot ja riippumattomien solupoolien lukumäärä (n) ilmoitetaan x-akselin alapuolella. Laatikoiden ylä-ja alapäät edustavat kunkin ryhmän ensimmäistä ja kolmatta kvartiilia. Viiksien päät edustavat alimpia ja korkeimpia arvoja, jotka ovat edelleen 1,5-kertaisen kvartiilivälin sisällä. Harmaa viiva ilmaisee kaaviossa y-muuttujan kokonaiskeskiarvon. Merkittävät erot (α = 0,05) ryhmien välillä teräs-Dwass-testin mukaisesti ilmaistaan p-arvoilla.

G-179: ää tai G-41: tä kantavien solulinjojen korkeammat tiitterit ja erityiset tuottavuus viittasivat näiden mutaatioiden stabiloivaan vaikutukseen hCMV-MIE-vetoiseen geeniekspressioon. Tämän vaikutuksen dokumentoimiseksi laskimme QP: n prosentuaalisen muutoksen pitkäaikaisessa viljelyssä kullekin yksittäiselle solulinjalle sopivimpana sen tuotannon vakauden mittana (Kuva. 2c). Tämä oli tietenkin mahdollista vain, kun solulinjat tuottivat IgG-IL2: ta vielä 68.päivänä verensiirron jälkeen. Eräs verrokkitransfektantti lisäsi erityistä tuottavuuttaan 500 prosenttia, ja jackknife-analyysi osoitti sen poikkeavaksi (Kuva. 2c, vasen tontti). Tämän vuoksi tämä solulinja jätettiin lisäanalyysin ulkopuolelle (Kuva. 2c, oikea juoni). Joko CGC: llä tai CCG: llä transfektoidut solulinjat olivat huomattavasti stabiilimpia kuin CCC: llä transfektoidut kontrollisolulinjat (α = 0, 05). Yllättäen kaksoismutantti CGG ei poikennut kontrollista.