Frontiers in Genetics

alkalinen comet-määritys (single cell gel electroforesis) on yleisimmin käytetty menetelmä eukaryoottisten solujen DNA-vaurioiden mittaamiseen (Neri et al., 2015). Se havaitsee strand breaks (SBS) ja alkali-labile sivustoja taajuuksilla muutaman sadan useita tuhansia taukoja solua kohti—biologisesti hyödyllinen alue, joka ulottuu alhaisista endogeenisistä vauriotasoista laajuuteen vaurioita, jotka voidaan aiheuttaa kokeellisesti tappamatta soluja. Nukleoidien pilkkoutuminen lyysin jälkeen tiettyjen leesiokohtaisten korjaus-endonukleaasien avulla mahdollistaa muiden vaurioiden kuin SBs: n mittaamisen; erityisesti formamidopyrimidiinin DNA-glykosylaasia (FPG) on käytetty laajalti muuntuneiden puriinien havaitsemiseen, jotka entsyymi muuntaa tauoiksi. Äskettäin (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) kehitti kaksiulotteisen Two-Tailed comet-testin (TT-comet), jolla voidaan erottaa yksijuosteiset (SSBs) ja kaksijuosteiset DNA-katkokset (DSBs) samoissa komeetoissa siittiöissä.

ostlingin ja Johansonin ensimmäisen raportin (1984) jälkeen comet-määritystä on käytetty laajalti kemikaalien genotoksisuustesteissä sekä in vitro että In vivo-malleissa. Jälkimmäisen etuna on, että eri kudosten soluja voidaan tutkia, monenlaisissa eukaryoottisissa eliöissä. Viimeisen 15 vuoden aikana comet-määritystä on käytetty laajasti Drosophila melanogasterissa kemikaalien genotoksisuuden testaamiseen (Gaivão and Sierra, 2014). Tämä lähestymistapa on erittäin hyödyllinen, koska Drosophila melanogaster on arvokas malli kaikenlaisille ihmisten terveyteen liittyville prosesseille, mukaan lukien DNA-vauriovasteet.

kasvien sekä monien maalla ja vedessä elävien lajien käyttö comet-määrityksessä on lisääntynyt dramaattisesti viimeisen vuosikymmenen aikana (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), erityisesti ympäristöriskien arvioinnissa (ERA). Tuore validointitutkimus on osoittanut, että in vitro comet-määritys yhdistettynä FPG: hen voi olla tehokas täydentävä todistusaineisto ERA: ssa jopa erityisen haastavissa luonnollisissa skenaarioissa, kuten suistoympäristöissä (Costa et al., 2014).

kuluneen vuosikymmenen aikana nanokokoisten materiaalien tuotanto ja käyttö on lisääntynyt merkittävästi, minkä seurauksena myös ihmisten altistuminen tällaisille materiaaleille on lisääntynyt. Nanomateriaalien ihmisten terveyteen liittyvien vaarojen tunnistaminen ja ymmärtäminen ei ole yksinkertaista. NMS: n kemiallinen koostumus ei ole ainoastaan vastuussa niiden genotoksisuudesta, vaan myös muoto, erityinen pinta-ala, koko, kokojakauma ja zeta-potentiaali määrittävät näiden materiaalien vaikutukset genomiin. Vaikka standardoitujen genotoksisuusmääritysten soveltuvuudesta NMs: n vaikutusten tutkimiseen on vielä väittelyä, toistaiseksi käytetyin menetelmä nanogenotoksikologiassa on ollut comet-määritys (Azqueta and Dusinska, 2015). Säteilyn ja erilaisten kemikaalien genotoksisuuden tutkimisen lisäksi plant comet-määritystä on viime aikoina käytetty myös NPs: n genotoksisen vaikutuksen tutkimiseen (Santos et al., 2015).

comet-määrityksen jatkokäyttö on arvokas kokeellinen työkalu ihmisen biomonitoroinnissa sekä kliinisissä tutkimuksissa. Veren tai kudosten kerääminen ei ole aina mahdollista kaikilla ihmisillä, ja comet-määrityksellä on testattu muita solulähteitä, joita voidaan kerätä ei-invasiivisesti; esimerkiksi erilaisia epiteelisoluja (Rojas et al., 2014)sekä spermaa (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg ym., 2015).

samanaikaisesti DNA-vaurioiden mittaamiseen tarkoitetun comet-määrityksen kanssa on kehitetty DNA: n korjausmenetelmiä, jotka ovat olennainen osa genotoksista soluvastetta. Yksinkertaisin tapa DNA: n korjausmittaukseen on käsitellä soluja DNA: ta vaurioittavalla aineella ja sitten inkuboida ne, jotta korjaus voi edetä, mittaamalla jäljellä olevien vaurioiden määrä säännöllisin väliajoin. Vaihtoehtoinen, biokemiallinen lähestymistapa korjauskyvyn arviointiin kuvattiin vuonna 1994 (Collins et al., 1994), ja sen jälkeen on julkaistu useita muunnettuja versioita määrityksestä sekä base excision repair (BER) että nucleotide excision repair (ner) (tarkistettu Azqueta et al., 2014). Tätä biokemiallista lähestymistapaa on sovellettu tutkittaessa ympäristön, ravitsemuksen, elämäntavan ja ammatin vaikutuksia DNA: n korjauskykyyn kliinisten tutkimusten lisäksi (Azqueta et al., 2014).

tässä vaihtoehtoisessa in vitro-menetelmässä DNA-korjaukseen arvioidaan soluuutteen korjausaktiivisuutta DNA-substraatissa, joka sisältää määriteltyjä leesioita. Comet-määritystä käytetään seuraamaan DNA-katkosten (korjausväliaineiden) kertymistä inkubaation ajan kanssa. Äskettäin Slyskova ja kollegat olivat ensimmäisiä, jotka soveltivat in vitro DNA-korjausmäärityksiä BER: lle ja NER: lle onnistuneesti ihmisen kudosnäytteistä; erityisesti paksusuolen karsinooman biopsiat (Slyskova et al., 2012, 2014).

toisenlainen DNA-korjausmääritys, jonka avulla geeliin upotetut solut voivat korjautua ennen lyysiä, hyväksyttiin äskettäin tutkimaan DNA: n korjauskinetiikkaa yksityiskohtaisemmin.; erityisesti tutkimaan Ber-proteiinien säätelyä transcriptionaalisilla muutoksilla (Nickson and Parsons, 2014). Vielä yksi tapa tutkia DNA: n korjautumista tiettyjen geenien tasolla on comet-FISH-tekniikka, jossa käytetään fluoresoivia DNA-koettimia, jotka risteytyvät komeetan pyrstön yksijuosteisen DNA: n kanssa. McAllister ym. (2014) käytti tätä menetelmää tutkittaessa etuoikeutettua juosteen katkeamiskorjausta irtotavarana DNA: ssa sekä valituilla alueilla, joilla on aktiivisesti litteroituja geenejä.

indusoitujen vaurioiden korjaamisen kinetiikan tutkiminen auttaa ymmärtämään soluvasteita genotoksisille kemikaaleille. Lisäksi DNA: n korjauksen merkitys (anti)karsinogeenisen prosessin toimijana voidaan selvittää tarkastelemalla korjaamista tiettyjen syövän kohdekudosten tasolla. Korjaus—ja muiden solujen genotoksisten yhdisteiden aiheuttaman vasteen näkökohtien säätelyyn liittyy todennäköisesti epigeneettisiä mekanismeja, ja comet-määritys on hyväksytty onnistuneesti yksittäisten solujen globaalin DNA: n metylaatiomallin muutosten mittaamiseksi erilaisissa kasvuolosuhteissa (Lewies et al., 2014).

hännän DNA: ta suositellaan parhaaksi kuvaukseksi DNA: n katkeamistaajuuksille, sillä mainitut komeetat—ja vaurion laajuus—voidaan helposti hahmottaa. Kuitenkin monet tutkijat edelleen mieluummin käyttää häntä moment (Møller et al., 2014). Itse asiassa määritysehdot (Azqueta et al., 2011; Ersson ja Möller, 2011).

comet-määrityksen vaihtelu on tärkeä asia riippumatta siitä, johtuuko se erilaisten protokollien käytöstä vai hallitsemattomasta tai satunnaisesta kokeellisesta vaihtelusta. Vertailustandardien sisällyttämistä kaikkiin kokeisiin suositellaan erityisesti silloin, kun suuri määrä näytteitä—esimerkiksi biomonitorointikokeesta—analysoidaan eri yhteyksissä. Vertailustandardit ovat soluja, joiden DNA-vaurion tiedetään olevan suuri; joko käsittelemättömät solut (negatiivinen kontrolli), Röntgensäteilylle altistuneet solut (positiivinen kontrolli) tai solut, jotka on käsitelty valoherkkyysaineella ja valolla (positiivinen kontrolli määrityksiä varten, mukaan lukien FPG-inkubaatio), erävalmisteina ja pakastettuina osakootteina. Jos mittauksissa esiintyy huomattavaa vaihtelua, näytteiden tulokset voidaan normalisoida (Collins et al., 2014). Jos vertailustandardeja vaihdetaan laboratorioiden välillä,näiden laboratorioiden tuloksia on helpompi vertailla.

Vertailustandardisolut asetetaan tavallisesti geeleihin samansuuntaisesti näytegeelien kanssa. Sisäiset standardit-ts., vakiosolut samassa geelissä kuin näytesolut – olisi ihanteellinen; mutta on tietenkin tärkeää pystyä erottamaan kaksi solutyyppiä. Kalasolut, jotka ovat joko suurempia tai pienempiä genomikooltaan verrattuna ihmisen soluihin, on onnistuneesti hyväksytty tähän tarkoitukseen (Brunborg et al., 2015). Näitä vertailusoluja voidaan käyttää yhdessä standardi-tai kalibrointikäyrän kanssa (joka määritetään soluilla, joille annetaan eri annoksia ionisoivaa säteilyä), jolloin DNA-leesiot voidaan määrittää täsmällisemmin DNA: n katkeamistaajuutena eikä hännän DNA: n prosentteina ilmaistuna.

tilastot ovat tärkeä työkalu kaikissa comet-määrityksen sovelluksissa, jotta voidaan tarkistaa, tapahtuvatko pienet erot sattumalta. Tilastollisen analyysin tiiviit kuvaukset ja testisuositukset on julkaistu (Lovell et al., 1999; Lovell ja Omori, 2008). Møller and Loft (2014) muistuttaa meitä siitä, että comet-määrityksen tilastollisen analyysin pitämiseksi yksinkertaisena, sopiva tutkimusrakenne ja tilastollinen teho on otettava huolellisesti huomioon kokeita suunniteltaessa.

kuten kaikissa biologisissa määrityksissä, tietojen integrointi on ratkaisevan tärkeää comet-määrityksen tulosten tulkitsemiseksi laajemmassa kuvassa. Comet-määrityksen antamien tietojen integrointia muihin DNA-vauriomittareihin ja soluvasteisiin (esim.oksidatiivinen stressi, solunjakautuminen tai solukuolema) on sovellettu sekä ERA: ssa (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015) sekä ihmisen (biomonitoring) tutkimukset (esim., Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Myös “omics” – tiedot auttavat selvittämään genotoksisten yhdisteiden vaikutustapaa (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos ym., 2015) – on kuitenkin syytä huomauttaa, että useat tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n korjauksen fenotyyppiset toimenpiteet eivät välttämättä korreloi genomisten tai transkriptomisten tietojen kanssa (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); eri lähestymistapoja olisi pidettävä toisiaan täydentävinä.

kolmen vuosikymmenen kehitystyön ja modifikaation jälkeenkin comet-määritys on edelleen melko yksinkertainen, monipuolinen mutta työläs määritys. Useita määrityksen suuren suoritustehon muutoksia tarkasteltiin äskettäin (Brunborg et al., 2014). Sekä in vivo-että in vitro-Sovellukset hyötyisivät suuresti tehokkuuden, protokollan standardoinnin ja läpimenon parantamisesta. Automaatio ja miniatyrisointi ovat yleisiä strategioita monilla biologian aloilla, mikä mahdollistaa suuruusluokan muutokset analysoitujen näytteiden määrissä per koe, vähentää subjektiivista vinoumaa ja parantaa toistettavuutta.

Joten-mitä voimme toivoa seuraavan 30 vuoden aikana? In vitro comet-määrityksen hyväksyminen genotoksisuustestausta varten, edullinen automatisoitu Comet-määritys tutkijoiden säästämiseksi loputtomalta mikroskoopin katselulta, protokollan standardointi (ehkä) ja luotettavat sisäiset vertailustandardit, DNA: n korjaamista koskevien ihmisten biomonitorointitutkimusten lisääminen (fenotyyppisten määritysten hyväksyminen tärkeäksi genomiikan ja transkriptomiikan rinnalla), ympäristön seuranta eri eläin-ja kasvilajien avulla sekä monet arvaamattomat kehitykset ja sovellukset.

Eturistiriitalausunto

kirjoittajat toteavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, joita voitaisiin pitää mahdollisena eturistiriitana.

kiitokset

haluamme kiittää kaikkia kirjoittajia sekä arvostelijoita ja toimittajia, jotka ovat osallistuneet tähän Rajatutkimuksen aiheeseen. SL on saanut AXA – Tutkimusrahaston tohtorintutkinnon jälkeisen apurahan ja Cefic-LRI Innovative Science Award 2013-palkinnon. AA kiittää Espanjan hallituksen Ministerio de Economía y Competitividad-ohjelmaa (Ramón y Cajal-ohjelma, 2013) henkilökohtaisesta tuesta.