Kromi Release Assay: vanhan koulukunnan tapa testata sytotoksisia T-soluja

on olemassa useita menetelmiä, joilla voidaan nähdä, ovatko T-solut sytotoksisia, mutta Kromi release assay käyttäen radioaktiivista 51chromiumia (51Cr) on yksi vanhimmista. Se antaa hyviä tuloksia, ja on hyvä laboratorioissa, joilla ei ole varaa tai ei ole virtaussytometriaa helposti saatavilla.

tässä hahmottelen yksinkertaisen menetelmän T-solujen tappotoiminnon testaamiseksi 51Cr: n avulla. Mutta ennen kuin aloitat määrityksen, muista perehtyä asianmukaisiin turvatoimenpiteisiin radioaktiivisten aineiden käsittelyssä.

valitse kohde ja Efektorit

tehdäksesi krominvapautusmäärityksen, inkuboi kohdesolut (T) ensin 51Cr: llä. Sen jälkeen kohdesoluja inkuboidaan efektorisoluilla (T-solut; E). Jos efektorisolut tappavat kohteet, ne vapauttavat 51Cr: n, jonka havaitset gammalaskurilla.

käyttämäsi kohteet ja efektorit riippuvat täysin sovelluksestasi. Kohdesolut ovat mitä testaat T-solujen toimintaa vastaan. Saatat haluta tappaa kohde (mitata sytotoksisuus) tai voit etsiä onko T-solut ovat suvaitsevaisia (kuten testaus valmistettu soluja ennen kuin ne menevät potilaan turvallisuuden!). Efector T-solut voidaan myös johtaa eri lähteistä. Voit käyttää esimerkiksi valmistettuja t-solulinjoja tai eläimestä juuri eristettyjä T-soluja.

hommataan radioaktiivinen

kun on koonnut kohteet ja efektit, on aika ryhtyä kokkaamaan.

1. laske solusi. Voit käyttää hemosytometriä tai automaattista solulaskuria. Solujen määrä tarvitset riippuu useita ehtoja ja kuinka monta kopiota kunkin ehdon teet. Tyypillisesti suoritan määritykseni kolmena kappaleena ja niissä on neljä suhdelukua (5:1, 10:1, 20:1 ja 40: 1 E: T). Aliquot kohdesolut (minun tapauksessani 500,000 – noin 25,000 per hyvin) sisään 15ml kartiomainen putket, pitää jokainen kokeellinen tila erillään! Varmista, että suspendoit solusi pieneen tilavuuteen, jotta niillä on mahdollisuus joutua kosketuksiin kromin kanssa.

1. lisää 51Cr (noin 50 µCi) ja inkuboi kohteesi kromilla tunnin ajan. Flick putket noin 20 minuutin välein lisätä mahdollisuuksia solujen ottaa Kromi.

1. kun sinä Hautot … Tämä pitkä haudonta on hyvä aika perustaa efektorisoluja. Pese T-solut kaksi kertaa PBS: llä poistaaksesi ylimääräiset sytokiinit, jotka voivat vääristää tuloksesi. Sekoita ne sitten sopivaan väliaineeseen.

1. kun olet pessyt pesut, olet valmis laittamaan efektorit lautaselle! Käytän yleensä 96 hyvin levy, koska määrät ovat melko pieniä. Levittele efektorit eri suhteissa kohteisiin tappamisen kynnyksen määrittämiseksi. Yleensä suoritan määrityksen kolmena kappaleena, mutta se riippuu siitä, kuinka monta solua sinulla on käytettävissä. 40, 20, 10 ja 5-1 suhteet (Efektorit tavoitteisiin) ovat hyvä malli, jos sinulla on riittävästi käytettävissä olevia soluja.

näiden testien lisäksi asetetaan kaksi kontrolliolosuhdetta:

• spontaani vapautumiskontrolli, joka sisältää vain kohdesoluja (periaatteessa negatiivinen kontrolli, koska ilman efektoreita ei pitäisi tappaa) ja
• maksimaalinen vapautumiskontrolli, jossa kohdesolut lyseerataan (positiivinen kontrolli, joka osoittaa solujen ottaman kromin enimmäismäärän).

1. Takaisin kohdesoluihin … kun kohdesolut on inkuboitu, pese ne kolme kertaa soluviljelyaineella ylimääräisen kromin poistamiseksi. Pyöritä kennoja kevyesti 400 g: n painolla 5 minuutin ajan kutakin pesua varten. Dekantoi supernatantti jäteastiaan, joka voidaan siirtää turvalliseen hajoamisalueeseen sen sijaan, että yrittäisit pipetoida sen pois. Tämä auttaa vähentämään mahdollista saastumista, koska sinun ei tarvitse käsitellä mitään vinkkejä.

1. kun pesut, sekoita solut 5000 solua 100?l. sitten lisätä 100?l solujen jokaiseen hyvin, jopa spontaani ja maksimi kuopat. Soluja inkuboidaan yhdessä vähintään 4 tuntia 37°C: n lämpötilassa.

1. neljä tuntia myöhemmin … Ota lautasesi keskoskaapista. Lisää 100?l 1% Triton-x-liuosta soluihisi maksimikuoppiin, jotta solut lyseerataan ja kaikki kromi vapautuu.

1. pyöräytä levyä 1250rpm: ssä kymmenen minuutin ajan kennojen pelletoimiseksi.

1. supernatantti siirretään jokaisesta kaivosta imukykyisen levyn kaivoon (esim.Luma-levyt) varoen koskemasta kaivon pohjalla olevaan pellettiin.

1. jätä levy kuivumaan yön yli. Aamulla, pop se lautasenlukija ja saada tuloksia.

näkemäsi tulokset riippuvat käyttötarkoituksestasi

kromin Vapautumismäärityksen tulosten laskeminen

kun olet saanut lukemat, sinun on suoritettava yksinkertainen laskelma solujen sytotoksisuuden määrittämiseksi.

ensin lasketaan kolmoisluvut kunkin ehdon mukaan. Sitten otetaan ne keskiarvot ja liitetään ne tähän kaavaan:

(kromin vapautuminen kiinnostavan tilan vuoksi – kromin vapautuminen spontaanikaivoissa) / (kromin enimmäisvapautuminen – kromin vapautuminen spontaanikaivoissa)

kerro arvo 100: lla, jotta saadaan prosentuaalinen hajoaminen.