Frontiers in Genetics

az alkáli üstökös assay (egysejtű gélelektroforézis) a legszélesebb körben használt módszer az eukarióta sejtek DNS-károsodásának mérésére (Neri et al., 2015). Kimutatja a száltöréseket (SBS) és az alkáli labilis helyeket sejtenként néhány száztól több ezer törésig terjedő frekvencián-ez egy biológiailag hasznos tartomány, amely az alacsony endogén károsodási szinttől a károsodás mértékéig terjed, amelyet kísérletileg a sejtek elpusztítása nélkül lehet okozni. A nukleoidok emésztése lízis után bizonyos elváltozás-specifikus javító endonukleázokkal lehetővé teszi az SBs-től eltérő károsodás mérését; nevezetesen a formamidopirimidin DNS-glikozilázt (FPG) széles körben alkalmazták a megváltozott purinok kimutatására, amelyeket az enzim törésekké alakít át. A közelmúltban (Cortex Xhams-Guti Adaptrrez et al. 2014) kifejlesztett egy kétdimenziós Kétfarkú üstökös-vizsgálatot (TT-comet), amely meg tudja különböztetni az egyszálú (SSB) és a kettős szálú DNS-töréseket (DSB) ugyanazon üstökösökben a spermában.

Ostling és Johanson első jelentése (1984) óta a comet-vizsgálatot széles körben használják vegyi anyagok genotoxicitási vizsgálatában, mind in vitro, mind in vivo modellekben. Az utóbbi előnye, hogy a különböző szövetekből származó sejtek sokféle eukarióta organizmusban tanulmányozhatók. Az elmúlt 15 évben a comet assay-t széles körben alkalmazták a Drosophila melanogaster-ben a vegyi anyagok genotoxicitásának tesztelésére (Gaiv! és Sierra, 2014). Ez a megközelítés nagyon hasznos, mivel a Drosophila melanogaster értékes modell az emberi egészséggel kapcsolatos mindenféle folyamathoz, beleértve a DNS-károsodási válaszokat is.

a növények, valamint a szárazföldi és vízi fajok széles skálájának használata az üstökösvizsgálatban drámaian megnőtt az elmúlt évtizedben (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), különösen a környezeti kockázatértékelés (ERA). Egy nemrégiben végzett validációs tanulmány kimutatta, hogy az in vitro üstökös-vizsgálat az FPG-vel kombinálva hatékony kiegészítő bizonyíték lehet az ERA-ban még különösen kihívást jelentő természetes forgatókönyvekben is, mint pl torkolati környezetek (Costa et al., 2014).

az elmúlt évtizedben a nanoméretű anyagok gyártása és felhasználása jelentősen megnőtt, és ennek következtében az ilyen típusú anyagok emberi expozíciója is. A nanoanyagok (NMs) emberi egészséggel kapcsolatos veszélyeinek azonosítása és megértése nem egyszerű kérdés. Nem csak az NMs kémiai összetétele felelős a genotoxicitásukért, hanem az alak, a fajlagos felület, a méret, a méreteloszlás és a zéta-potenciál is meghatározza ezen anyagok genomra gyakorolt hatását. Bár még mindig vita folyik a standard genotoxicitási vizsgálatok alkalmasságáról az NMs hatásainak tanulmányozására, a nanogenotoxikológiában eddig a leggyakrabban használt módszer robusztusságának, sokoldalúságának és megbízhatóságának köszönhetően a comet assay (Azqueta and Dusinska, 2015). A sugárzás és a különböző vegyi anyagok genotoxicitásának vizsgálata mellett a plant comet assay-t a közelmúltban az NPs genotoxikus hatásának tanulmányozására is alkalmazták (Santos et al., 2015).

a comet-vizsgálat további alkalmazása értékes kísérleti eszköz az emberi biomonitoringhoz, valamint a klinikai vizsgálatokhoz. A vér vagy szövetek gyűjtése nem mindig lehetséges minden emberi alanyban, és más, nem invazív módon gyűjthető sejtforrásokat teszteltek a comet-vizsgálattal; például különböző típusú hámsejtek (Rojas et al., 2014), valamint a spermiumok (Cortex Xhams-Guti Xhamrrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

a DNS—károsodás mérésére szolgáló comet—teszt kifejlesztésével párhuzamosan kifejlesztették a DNS-javítás-a genotoxikus sejtválasz alapvető eleme-vizsgálatát. A DNS-javítás mérésének legegyszerűbb megközelítése a sejtek DNS-károsító szerrel történő kezelése, majd inkubálása, hogy a javítás folytatódhasson, mérve az időközönként fennmaradó károsodás mértékét. A javítási kapacitás értékelésének alternatív, biokémiai megközelítését 1994-ben írták le (Collins et al., 1994), és azóta a vizsgálat különböző módosított változatai mind az alapkivágás javítása (BER), mind a nukleotidkivágás javítása (ner) mérésére megjelentek (azqueta et al., 2014). Ezt a biokémiai megközelítést alkalmazták a környezet, a táplálkozás, az életmód és a foglalkozás DNS-javító képességre gyakorolt hatásainak tanulmányozására, a klinikai vizsgálatok mellett (Azqueta et al., 2014).

a DNS-javítás ezen alternatív in vitro megközelítése egy meghatározott elváltozásokat tartalmazó DNS-szubsztráton lévő sejtkivonat javítási aktivitását értékeli. A comet-vizsgálatot a DNS-szünetek (javító köztitermékek) felhalmozódásának követésére használják az inkubációs idővel. A közelmúltban Slyskova és kollégái elsőként alkalmazták az in vitro DNS-javító vizsgálatokat a ber és a NER esetében sikeresen az emberi szövetmintákon; különösen a colorectalis carcinoma biopsziák (Slyskova et al., 2012, 2014).

egy másfajta DNS-javító vizsgálatot, amely lehetővé teszi a gélbe ágyazott sejtek helyreállítását a lízis előtt, nemrégiben fogadták el a DNS-javító kinetika részletesebb tanulmányozására; pontosabban a ber fehérjék szabályozásának tanulmányozása poszt-transzkripciós módosításokkal (Nickson and Parsons, 2014). A DNS-javítás tanulmányozásának másik módja a specifikus gének szintjén a comet-FISH technika, amely fluoreszcens jelölésű DNS-próbákat használ, amelyek hibridizálódnak az üstökös farkában lévő egyszálú DNS-sel. McAllister és munkatársai. (2014) ezt a módszert alkalmazta a preferenciális szálszakadás javításának tanulmányozására ömlesztett DNS-ben, valamint kiválasztott régiókban, aktívan átírt génekkel.

az indukált károsodás javításának kinetikájának tanulmányozása segít megérteni a genotoxikus vegyi anyagokra adott sejtes válaszokat. Ezenkívül a DNS-javítás jelentősége az (anti)rákkeltő folyamat szereplőjeként tisztázható, ha a specifikus rákos célszövetek szintjén vizsgáljuk a javítást. A javítás szabályozása—és a genotoxikus vegyületekre adott sejtes válasz egyéb aspektusai-valószínűleg epigenetikus mechanizmusokat foglal magában, és a comet-vizsgálatot sikeresen alkalmazták az egyes sejtek globális DNS-metilációs mintázatának változásainak mérésére különböző növekedési körülmények között (Lewies et al., 2014).

a DNS törési frekvenciájának legjobb leírójaként a farokdna százalékos aránya ajánlott, mivel az említett üstökösök—és a károsodás mértéke—könnyen láthatóvá válnak. Sok kutató azonban továbbra is inkább a faroknyomaték használatát részesíti előnyben (M) 6ller et al., 2014). Valójában a két leírót hasonlóan befolyásolják a vizsgálati feltételek (Azqueta et al., 2011; Ersson és M! (2011).

az üstökösvizsgálat változékonysága fontos kérdés, függetlenül attól, hogy különböző protokollok használatából, vagy ellenőrizhetetlen vagy véletlenszerű kísérleti variációból származik. Ajánlott a referencia-szabványok beépítése minden kísérletbe, különösen akkor, ha nagyszámú mintát—például egy biomonitoring vizsgálatból—elemeznek különböző alkalmakkor. A referencia standardok olyan sejtek, amelyek ismert mennyiségű DNS-károsodást okoznak; vagy kezeletlen sejtek (negatív kontroll), röntgensugárzásnak kitett sejtek (pozitív kontroll), vagy fényérzékenyítő plusz fénnyel kezelt sejtek (pozitív kontroll a vizsgálatokhoz, beleértve az FPG-inkubációt is), tételesen elkészítve és fagyasztva alikvotként. Ha a kísérletek során jelentős eltérések fordulnak elő a szabványokban, a minta eredményei normalizálhatók (Collins et al., 2014). Ha a referencia-szabványokat laboratóriumok között cserélik, e laboratóriumok eredményei könnyebben összehasonlíthatók.

a referencia standard cellákat általában gélekben állítják be a mintagélekkel párhuzamosan. Belső szabványok—pl., a standard sejtek ugyanabban a gélben, mint a mintasejtek—ideális lenne; de természetesen elengedhetetlen a két sejttípus megkülönböztetése. Az emberi sejtekhez képest nagyobb vagy kisebb genomméretű halsejteket sikeresen elfogadták erre a célra (Brunborg et al., 2015). Ezek a referenciasejtek standard vagy kalibrációs görbével kombinálva használhatók (különböző dózisú ionizáló sugárzással rendelkező sejtekkel létrehozva), lehetővé téve a DNS-elváltozások pontosabb számszerűsítését DNS-törési gyakoriságként kifejezve, nem pedig a farok DNS % – ában.

a statisztika fontos eszköz a comet-vizsgálat minden alkalmazásában annak ellenőrzésére, hogy a kis különbségek véletlenül fordulnak-e elő. A statisztikai elemzés és a tesztekre vonatkozó ajánlások tömör leírása megjelent (Lovell et al., 1999; Lovell és Omori, 2008). M ons and loft (2014) emlékeztet arra, hogy a comet assay statisztikai elemzése egyszerű, a megfelelő tanulmányi tervezést és a statisztikai teljesítményt gondosan figyelembe kell venni a kísérletek tervezésekor.

mint minden biológiai vizsgálatnál, az adatintegráció döntő fontosságú az üstökösvizsgálat eredményeinek a nagyobb képen belüli értelmezéséhez. A comet-vizsgálat által szolgáltatott információk integrálása más DNS-károsodási mutatókkal és sejtválaszokkal (például oxidatív stressz, sejtosztódás vagy sejthalál) mind az ERA-ban (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015), valamint az emberi (biomonitoring) vizsgálatok (például Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Az “omics” adatok felvétele elősegíti a genotoxikus vegyületek hatásmechanizmusának feltárását is (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – bár érdemes rámutatni, hogy számos tanulmány kimutatta, hogy a DNS-javítás fenotípusos mértéke nem feltétlenül korrelál a genomi vagy transzkriptomi adatokkal (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); a különböző megközelítéseket kiegészítőnek kell tekinteni.

még három évtizedes fejlesztés és módosítás után is meglehetősen egyszerű, sokoldalú, de munkaigényes vizsgálat. A vizsgálat különböző nagy áteresztőképességű módosításait nemrégiben felülvizsgálták (Brunborg et al., 2014). Mind az in vivo, mind az in vitro alkalmazások nagy előnyt élveznének a hatékonyság további javításával, a protokoll szabványosításával és az áteresztőképességgel. Az automatizálás és a miniatürizálás a biológia számos területén közös stratégiák, amelyek lehetővé teszik a nagyságrendek változását a kísérletenként elemzett minták számában, csökkentve a szubjektív elfogultságot és növelve a reprodukálhatóságot.

tehát-mit remélhetünk a következő 30 évben? Az in vitro üstökösvizsgálat elfogadása a genotoxicitás vizsgálatához, olcsó automatizált üstökös pontozás, hogy megmentse a kutatókat a végeláthatatlan mikroszkóp megtekintéstől, protokoll szabványosítás (talán) és megbízható belső referencia standardok, a DNS-javítás több emberi biomonitoring vizsgálata (elfogadva, hogy a fenotípusos vizsgálatok fontos helyet foglalnak el a genomika és a transzkriptomika mellett), környezeti monitorozás különféle Állat-és növényfajok felhasználásával; és még sok más kiszámíthatatlan fejlesztés és alkalmazás.

összeférhetetlenségi nyilatkozat

a szerzők kijelentik, hogy a kutatást olyan kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolatok hiányában végezték, amelyek potenciális összeférhetetlenségnek tekinthetők.

Köszönetnyilvánítás

ezúton szeretnénk köszönetet mondani mindazoknak a szerzőknek, bírálóknak és szerkesztőknek, akik hozzájárultak ehhez a Frontiers kutatási témához. Az SL az AXA Kutatási Alap és a Cefic-LRI Innovative Science Award 2013 posztdoktori támogatásának kedvezményezettje. AA köszönetét fejezi ki a spanyol kormány gazdasági Minisztériumának (Ministerio de Economic Enterprises, 2013) A személyes támogatásért.