Króm felszabadulási vizsgálat: a citotoxikus T-sejtek tesztelésének régi iskolai módja

számos módszer használható annak megállapítására, hogy a T-sejtek citotoxikusak-e, de a radioaktív 51króm (51cr) felhasználásával végzett króm felszabadulási vizsgálat az egyik legrégebbi. Jó eredményeket ad, és nagyszerű olyan laboratóriumok számára, amelyek nem engedhetik meg maguknak, vagy nem rendelkeznek áramlási citometriával.

itt felvázolok egy egyszerű módszert a T-sejtölő funkció tesztelésére az 51Cr használatával. De mielőtt elkezdené a vizsgálatot, feltétlenül olvassa el a megfelelő biztonsági intézkedéseket a radioaktív anyagok kezelésekor.

válassza ki a célt és az Effektorokat

a króm felszabadulási vizsgálat elvégzéséhez először inkubálja a célsejteket (T) 51Cr-rel. Ezután inkubálja a célsejteket effektor sejtekkel (a T-sejtjeivel; E). Ha az effektor sejtek megölik a célokat, akkor felszabadítják az 51Cr-t, amelyet gamma-számlálóval fog észlelni.

az, hogy mely célokat és effektorokat használja, teljes mértékben az alkalmazásától függ. A célsejtek az, amit tesztel T-sejt funkció ellen. Lehet, hogy meg akarja ölni a célpontját (mérje meg a citotoxicitást), vagy megnézheti, hogy a T-sejtek toleránsak-e (mint például a gyártott sejtek tesztelése, mielőtt biztonságba kerülnek a betegbe!). Az effektor T-sejtjei különböző forrásokból is származhatnak. Használhat például gyártott T-sejtvonalakat vagy egy állatból frissen izolált T-sejteket.

szerezzünk radioaktív anyagot

miután összegyűjtöttük a célpontokat és az effektorokat, itt az ideje, hogy szakács legyen.

1. számolja meg a celláit. Használhat hemocitométert vagy automatikus cellaszámlálót. A szükséges cellák száma függ a feltételek számától és az egyes állapotok hány ismétlésétől. Általában három példányban futtatom a vizsgálatokat, és négy arányom van(5:1, 10:1, 20:1 és 40:1 E: T). Aliquot a célsejtek (az én esetemben 500,000 – körülbelül 25,000 per jól) a 15 ml kúpos csövek, miközben minden kísérleti állapot külön! Ügyeljen arra, hogy kis mennyiségben függessze fel a celláit, hogy esélyük legyen érintkezni a krómmal.

1. adjuk hozzá az 51Cr-t (kb. 50 ft), és inkubáljuk a célpontokat a krómmal egy órán keresztül. 20 percenként rázza meg a csöveket, hogy növelje a sejtek lehetőségeit a króm felvételére.

1. amíg inkubálsz….Ez a hosszú inkubáció remek alkalom az effektor sejtek felállítására. Mossa le a T-sejteket kétszer PBS-sel, hogy eltávolítsa a felesleges citokineket, amelyek torzíthatják az eredményeket. Ezután reszuszpendálja őket a megfelelő médiába.

1. miután befejezte a mosást, készen áll arra, hogy az effektorokat a tányérra tegye! Általában 96 kútlemezt használok, mivel a kötetek meglehetősen kicsiek. Az effektorokat különböző arányban rendezze a célokhoz, hogy meghatározza a leölés küszöbét. Általában három példányban futtatom a vizsgálatot, de ez attól függ, hogy hány sejt áll rendelkezésre. A 40, 20, 10 és 5: 1 arány (effektorok a célokhoz) jó sablon, ha elegendő rendelkezésre álló cellával rendelkezik.

ezen vizsgálat mellett állítson be két ellenőrzési feltételt:

• spontán felszabadulási kontroll, amely csak célsejteket tartalmaz (alapvetően negatív kontroll, mert az effektorok nélkül nem szabad megölni) és
• maximális felszabadulási kontroll, amelyben a célsejteket lizáljuk (pozitív kontroll, amely megmutatja a sejtek által felvett króm maximális mennyiségét).

1. vissza azokhoz a célsejtekhez … miután a célsejtek inkubálódtak, háromszor mossuk meg sejttenyésztő táptalajjal, hogy eltávolítsuk a felesleges krómot. A cellákat óvatosan forgassa 400 g-on 5 percig mindegyik mosáshoz. Dekantálja a felülúszót egy hulladéktartályba, amelyet át lehet vinni egy biztonságos bomlási területre, ahelyett, hogy megpróbálná pipettázni. Ez segít csökkenteni a lehetséges szennyeződést, mivel nem kell semmilyen tippel foglalkoznia.

1. a mosás után reszuszpendálja a sejtjeit 5000 sejtre 100-ra?l. Ezután adjunk hozzá 100-at?l a sejtek minden jól, még a spontán és maximális kutak. Inkubálja a sejteket legalább 4 órán át 37cc-n, pontosan mennyi ideig függ az alkalmazásától.

1. négy órával később….Vegye ki a tányérját az inkubátorból. Adjunk hozzá 100-at?l egy 1%-os triton-x oldatot a sejtek a maximális kutak, hogy lyse a sejtek és engedje el az összes króm.

1. forgassa le a lemezt 1250 fordulat / perc sebességgel tíz percig a sejtek pelletálásához.

1. vigyük át a felülúszót minden kútból egy abszorbens lemez (pl. Luma lemezek) kútjába, ügyelve arra, hogy ne érjenek a kút alján lévő pellethez.

1. hagyja a lemezt egy éjszakán át száradni. Reggel tegye be a lemezolvasóba, és kapja meg az eredményeket.

a látott eredmények az adott alkalmazástól függenek

A króm felszabadulási vizsgálat eredményeinek kiszámítása

miután megkapta a leolvasásokat, egyszerű számítást kell végrehajtania a sejtek citotoxicitásának meghatározásához.

először átlagolja a triplikátumokat minden feltételhez. Ezután vegye be ezeket az átlagokat, és csatlakoztassa őket ehhez a képlethez:

(króm felszabadulás az érdeklődésre számot tartó feltételhez – króm felszabadulás spontán kutakban)/ (maximális króm felszabadulás – króm felszabadulás spontán kutakban)

szorozzuk meg az értéket 100-mal, hogy megkapjuk a százalékos lízist.