Analisi del rilascio del cromo: Il modo della vecchia scuola di testare le cellule T citotossiche

Ci sono diversi metodi che è possibile utilizzare per vedere se le cellule T sono citotossici, ma un test di rilascio del cromo utilizzando radioattivo 51chromium (51Cr) è uno dei più antichi. Dà buoni risultati ed è grande per i laboratori che non possono permettersi o non hanno citometria a flusso prontamente disponibile.

Qui, descriverò un metodo semplice per testare la funzione di uccisione delle cellule T usando 51Cr. Ma prima di iniziare il test, assicurati di leggere le misure di sicurezza adeguate quando maneggi materiali radioattivi.

Scegli il tuo target e gli effettori

Per eseguire un test di rilascio del cromo, incubare prima le cellule bersaglio (T) con 51Cr. Quindi incubare le cellule bersaglio con cellule effettrici (le cellule T; E). Se le cellule effettore uccidono i bersagli, rilasceranno il 51Cr, che rileverai con un contatore gamma.

Gli obiettivi e gli effettori utilizzati dipendono interamente dall’applicazione. Le tue cellule bersaglio sono ciò contro cui stai testando la funzione delle cellule T. Potresti voler uccidere il tuo obiettivo (misurare la citotossicità) o potresti cercare di vedere se le cellule T sono tolleranti (come testare le cellule fabbricate prima che entrino in un paziente per sicurezza!). Le cellule T effettori possono anche essere derivate da fonti diverse. Ad esempio, è possibile utilizzare linee di cellule T prodotte o cellule T appena isolate da un animale.

Let’s Get Radioactive

Una volta che hai raccolto i tuoi obiettivi e gli effettori, è il momento di cucinare.

1. Conta le tue celle. È possibile utilizzare un emocitometro o un contatore automatico di celle. Il numero di celle necessarie dipende dal numero di condizioni e dal numero di repliche di ciascuna condizione. In genere, eseguo i miei saggi in triplice copia e ho quattro rapporti (5:1, 10:1, 20:1 e 40: 1 E: T). Aliquote le cellule bersaglio (nel mio caso 500.000-circa 25.000 per pozzetto) in tubi conici da 15 ml, mantenendo separate ogni condizione sperimentale! Assicurati di sospendere le cellule in un piccolo volume in modo che abbiano la possibilità di entrare in contatto con il cromo.

1. Aggiungere il 51Cr (circa 50 µCi) e incubare i vostri obiettivi con il cromo per un’ora. Flick i tubi circa ogni 20 minuti per aumentare le opportunità per le cellule di assorbimento del cromo.

1. Mentre stai incubando.Questa lunga incubazione è un ottimo momento per impostare le cellule effettore. Lavare le cellule T due volte con PBS per rimuovere le citochine in eccesso che potrebbero distorcere i risultati. Quindi risospenderli nel supporto appropriato.

1. Una volta che hai finito i lavaggi, sei pronto a mettere i tuoi effettori sul piatto! Io di solito uso un 96 bene piatto in quanto i volumi sono piuttosto piccoli. Piastra gli effettori in diversi rapporti con gli obiettivi per determinare la soglia di uccisione. Di solito eseguo il test in triplicati, ma dipende da quante celle hai a disposizione. 40, 20, 10, e 5 a 1 rapporti (Effettori ai bersagli) sono un buon modello se si dispone di abbastanza celle disponibili.

Oltre a questi test, impostare due condizioni di controllo:

• un controllo di rilascio spontaneo contenente solo cellule bersaglio (fondamentalmente un controllo negativo perché non dovrebbe esserci uccisione senza gli effettori) e
• un controllo di rilascio massimo in cui si lizzano le cellule bersaglio (un controllo positivo che mostra la quantità massima di cromo assorbita dalle cellule).

1. Tornando a quelle cellule bersaglio Once Una volta che le cellule bersaglio sono state incubate, lavale tre volte con il mezzo di coltura cellulare per rimuovere il cromo in eccesso. Spin le cellule delicatamente a 400g per 5 min per ciascuno di questi lavaggi. Decantare il surnatante in un contenitore di rifiuti che può essere trasferito in un’area di decadimento sicura piuttosto che cercare di pipettarlo. Ciò contribuirà a ridurre la possibile contaminazione poiché non dovrai affrontare alcun suggerimento.

1. Dopo i lavaggi, risospendi le tue cellule a 5000 cellule per 100?l. Quindi aggiungere 100?l di cellule ad ogni pozzo, anche i pozzi spontanei e massimi. Incubare le cellule insieme per un minimo di 4 ore a 37°C, esattamente quanto tempo dipende dall’applicazione.

1. Quattro ore dopo….Togli il piatto dall’incubatrice. Aggiungere 100?l di una soluzione triton-x all ‘ 1% alle cellule nei pozzetti massimi per lisare le cellule e rilasciare tutto il cromo.

1. Girare la piastra verso il basso a 1250 rpm per dieci minuti per pellet le cellule.

1. Trasferire il surnatante da ciascun pozzetto al pozzetto di una piastra assorbente (ad es. piastre Luma) facendo attenzione a non toccare il pellet sul fondo del pozzetto.

1. Lasciare asciugare la piastra durante la notte. Al mattino, pop nel lettore piatto e ottenere i risultati.

I risultati che vedi dipenderanno dalla tua applicazione specifica

Calcolo dei risultati del tuo test di rilascio di cromo

Una volta che hai le letture, devi eseguire un semplice calcolo per determinare la citotossicità delle tue cellule.

Innanzitutto, media i tuoi triplicati per ogni condizione. Quindi prendi quelle medie e inseriscile in questa formula:

(Rilascio di cromo per condizione di interesse – Rilascio di cromo in pozzi spontanei)/ (max rilascio di cromo – Rilascio di cromo in pozzi spontanei)

Moltiplicare il valore per 100 per ottenere la lisi percentuale.