Frontiers in Genetics

Il test alkaline comet (single cell gel electrophoresis) è il metodo più utilizzato per misurare il danno al DNA nelle cellule eucariotiche (Neri et al., 2015). Rileva rotture di filamenti (SBs) e siti alcalini-labili a frequenze da poche centinaia a diverse migliaia di rotture per cellula—un intervallo biologicamente utile, che si estende da bassi livelli di danno endogeno all’entità del danno che può essere inflitto sperimentalmente senza uccidere le cellule. La digestione dei nucleoidi, dopo lisi, con alcune endonucleasi di riparazione specifiche per lesione consente la misurazione di danni diversi da SBs; in particolare, la formamidopirimidina DNA glicosilasi (FPG) è stata ampiamente utilizzata per rilevare le purine alterate, che vengono convertite in rotture dall’enzima. Recentemente, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) ha sviluppato un test di cometa bidimensionale a due code (TT-comet) che può distinguere tra single-stranded (SSBs) e double-stranded DNA breaks (DSBs) nelle stesse comete nello sperma.

Dal primo rapporto di Ostling e Johanson (1984) il saggio comet è stato ampiamente utilizzato nei test di genotossicità di sostanze chimiche, sia in vitro che in vivo modelli. Un vantaggio con quest’ultimo è che le cellule di vari tessuti possono essere studiate, in un’ampia varietà di organismi eucariotici. Negli ultimi 15 anni, il test comet è stato ampiamente utilizzato in Drosophila melanogaster per testare la genotossicità delle sostanze chimiche (Gaivão e Sierra, 2014). Questo approccio è molto utile poiché Drosophila melanogaster è un modello prezioso per tutti i tipi di processi relativi alla salute umana, comprese le risposte al danno del DNA.

L’uso di piante e di una vasta gamma di specie terrestri e acquatiche nel saggio comet è aumentato drammaticamente nell’ultimo decennio (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), in particolare nella valutazione del rischio ambientale (ERA). Un recente studio di validazione ha indicato che il saggio comet in vitro combinato con FPG può essere un’efficace linea complementare di prove in ERA anche in scenari naturali particolarmente impegnativi come gli ambienti estuari (Costa et al., 2014).

Nell’ultimo decennio la produzione e l’uso di materiali di dimensioni nanometriche sono notevolmente aumentati, e di conseguenza anche l’esposizione umana a questi tipi di materiali. Identificare e comprendere i rischi dei nanomateriali (SMN) in relazione alla salute umana non è una questione semplice. Non solo la composizione chimica degli SMN è responsabile della loro genotossicità, ma anche la forma, la superficie specifica, le dimensioni, la distribuzione dimensionale e il potenziale zeta determinano gli effetti di questi materiali sul genoma. Sebbene ci sia ancora un dibattito sull’idoneità dei saggi di genotossicità standard per studiare gli effetti della NMs, finora il metodo più utilizzato in nanogenotossicologia, grazie alla sua robustezza, versatilità e affidabilità, è stato il saggio comet (Azqueta e Dusinska, 2015). Oltre a studiare la genotossicità delle radiazioni e varie sostanze chimiche, il saggio plant comet è stato recentemente utilizzato anche per studiare l’impatto genotossico di NPs (Santos et al., 2015).

Un’ulteriore applicazione del saggio comet è un valido strumento sperimentale per il biomonitoraggio umano e negli studi clinici. La raccolta di sangue o tessuti non è sempre fattibile in tutti i soggetti umani e altre fonti di cellule che possono essere raccolte in modo non invasivo sono state testate con il saggio comet; ad esempio, vari tipi di cellule epiteliali (Rojas et al., 2014) così come lo sperma (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

Parallelamente allo sviluppo del saggio comet per la misurazione del danno al DNA, sono stati sviluppati saggi per la riparazione del DNA, un elemento essenziale nella risposta cellulare genotossica. L’approccio più semplice alla misurazione della riparazione del DNA consiste nel trattare le cellule con un agente dannoso per il DNA e quindi incubarle per consentire alla riparazione di procedere, misurando la quantità di danno rimanente a intervalli. Un approccio biochimico alternativo per valutare la capacità di riparazione è stato descritto nel 1994 (Collins et al., 1994), e da allora sono state pubblicate varie versioni modificate del saggio per misurare sia la riparazione dell’escissione di base (BER) che la riparazione dell’escissione di nucleotidi (NER) (recensito da Azqueta et al., 2014). Questo approccio biochimico è stato applicato per studiare gli effetti dell’ambiente, della nutrizione, dello stile di vita e dell’occupazione sulla capacità di riparazione del DNA, oltre alle indagini cliniche (Azqueta et al., 2014).

Questo approccio alternativo in vitro alla riparazione del DNA valuta l’attività di riparazione di un estratto cellulare su un substrato di DNA contenente lesioni definite. Il saggio comet viene utilizzato per seguire l’accumulo di rotture di DNA (intermedi di riparazione) con il tempo di incubazione. Recentemente, Slyskova e colleghi sono stati i primi ad applicare i test di riparazione del DNA in vitro per BER e NER con successo su campioni di tessuto umano; in particolare, biopsie di carcinoma colorettale (Slyskova et al., 2012, 2014).

Un diverso tipo di test di riparazione del DNA, che consente alle cellule incorporate nel gel di riparare prima della lisi, è stato recentemente adottato per studiare la cinetica di riparazione del DNA in modo più dettagliato; in particolare, per studiare la regolazione delle proteine BER mediante modifiche post-trascrizionali (Nickson e Parsons, 2014). Ancora un altro modo per studiare la riparazione del DNA, a livello di geni specifici, è con la tecnica comet-FISH, che fa uso di sonde di DNA marcate a fluorescenza che si ibrideranno con il DNA a filamento singolo nella coda della cometa. McAllister et al. (2014) ha utilizzato questo metodo per studiare la riparazione preferenziale della rottura del filamento nel DNA sfuso e in regioni selezionate con geni attivamente trascritti.

Studiare la cinetica di riparazione del danno indotto aiuterà nella nostra comprensione delle risposte cellulari alle sostanze chimiche genotossiche. Inoltre, il significato della riparazione del DNA come attore nel processo (anti)cancerogeno può essere chiarito esaminando la riparazione a livello di specifici tessuti bersaglio del cancro. È probabile che la regolazione della riparazione—e altri aspetti della risposta cellulare ai composti genotossici—coinvolga meccanismi epigenetici e il saggio comet è stato adottato con successo per misurare i cambiamenti nel modello globale di metilazione del DNA nelle singole cellule in varie condizioni di crescita (Lewies et al., 2014).

Per cento il DNA di coda è raccomandato come il miglior descrittore per le frequenze di rottura del DNA, poiché le comete a cui si fa riferimento—e l’entità del danno—possono essere facilmente visualizzate. Tuttavia, molti ricercatori preferiscono ancora l’uso del momento della coda (Møller et al., 2014). In effetti i due descrittori sono influenzati in modo simile dalle condizioni del saggio (Azqueta et al., 2011; Erson e Möller, 2011).

La variabilità nel saggio della cometa è un problema importante, sia che derivi dall’uso di protocolli diversi, sia da variazioni sperimentali incontrollabili o casuali. Si raccomanda l’inclusione di standard di riferimento in tutti gli esperimenti, specialmente quando un gran numero di campioni—da uno studio di biomonitoraggio, ad esempio—vengono analizzati in diverse occasioni. Gli standard di riferimento sono cellule con una quantità nota di danni al DNA; cellule non trattate (controllo negativo), cellule esposte ai raggi X (controllo positivo) o cellule trattate con fotosensibilizzatore più luce (controllo positivo per i saggi inclusa l’incubazione di FPG), preparate in lotti e congelate come aliquote. Se si verificano variazioni sostanziali negli standard in una serie di esperimenti, i risultati del campione possono essere normalizzati (Collins et al., 2014). Se gli standard di riferimento vengono scambiati tra laboratori, i risultati di questi laboratori possono essere confrontati più facilmente.

Le celle standard di riferimento sono normalmente impostate in gel in parallelo ai gel campione. Standard interni-cioè, celle standard nello stesso gel come celle di campione – sarebbe ideale; ma è certamente essenziale per essere capace di distinguere i due tipi di cella. Le cellule di pesce che sono più grandi o più piccole nella dimensione del genoma rispetto alle cellule umane sono state adottate con successo a questo scopo (Brunborg et al., 2015). Queste cellule di riferimento possono essere utilizzate in combinazione con una curva standard o di calibrazione (stabilita con cellule date diverse dosi di radiazioni ionizzanti), consentendo una quantificazione più precisa delle lesioni del DNA espresse come frequenza di rottura del DNA piuttosto che % di DNA di coda.

Le statistiche sono uno strumento importante in tutte le applicazioni del test comet, per verificare se piccole differenze si verificano per caso. Sono state pubblicate descrizioni concise di analisi statistiche e raccomandazioni per i test (Lovell et al., 1999; Lovell e Omori, 2008). Møller e Loft (2014) ci ricordano che per mantenere l’analisi statistica del saggio comet semplice, la progettazione dello studio appropriata e la potenza statistica dovrebbero essere attentamente considerate durante la pianificazione degli esperimenti.

Come per tutti i saggi biologici, l’integrazione dei dati è fondamentale per interpretare i risultati del saggio comet nel quadro più ampio. L’integrazione delle informazioni fornite dal test comet con altri indicatori di danno al DNA e risposte cellulari (ad esempio, stress ossidativo, divisione cellulare o morte cellulare) è stata applicata sia in ERA (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015) così come gli studi umani (biomonitoring) (ad esempio, Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Anche i dati “omici” aiuteranno a svelare la modalità di azione dei composti genotossici (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015)—anche se vale la pena sottolineare che diversi studi hanno dimostrato che le misure fenotipiche di riparazione del DNA non sono necessariamente correlate con i dati genomici o trascrittomici (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); i diversi approcci dovrebbero essere considerati complementari.

Anche dopo tre decenni di sviluppo e modifica, il saggio comet è ancora un saggio piuttosto semplice, versatile ma ad alta intensità di lavoro. Varie modifiche ad alto rendimento del test sono state recentemente riviste (Brunborg et al., 2014). Sia le applicazioni in vivo che in vitro trarrebbero grande vantaggio da ulteriori miglioramenti in termini di efficienza, standardizzazione del protocollo e throughput. L’automazione e la miniaturizzazione sono strategie comuni in molte aree della biologia, consentendo cambiamenti di ordine di grandezza nel numero di campioni analizzati per esperimento, riducendo i pregiudizi soggettivi e migliorando la riproducibilità.

Quindi, cosa possiamo sperare nei prossimi 30 anni? Accettazione in vitro test della cometa per i test di genotossicità, poco costoso automatizzato cometa di punteggio per salvare i ricercatori interminabile di osservazione del microscopio, il protocollo di standardizzazione (forse) e affidabile interni, norme di riferimento, più biomonitoraggio umano studi di riparazione del DNA (accettando analisi fenotipiche hanno un posto importante al fianco di genomica e trascrittomica), il monitoraggio ambientale, utilizzando una varietà di specie animali e vegetali; e molti di più imprevedibili sviluppi e applicazioni.

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo tutti gli autori, i revisori e gli editori che hanno contribuito a questo tema di ricerca di Frontiers. SL è beneficiaria di una borsa post-dottorato del Fondo di ricerca AXA e del Cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA ringrazia il Ministerio de Economía y Competitividad (programma’ Ramón y Cajal’, 2013) del governo spagnolo per il sostegno personale.