Promotore CMV mutanti con una ridotta propensione alla perdita di produttività in cellule CHO

al fine di monitorare gli effetti di metilazione-incline siti CpG dal enhancer, prossimale e la regione del promotore di nucleo, abbiamo scelto di indagare non solo C-179, ma anche il cytosines a posizioni -508 (C-508) e -41 (C-41). Nessuno dei siti CpG selezionati si sovrappone a siti noti di legame del fattore di trascrizione nelle specie Cricetidae. Al fine di mantenere il contenuto generale di GC, abbiamo eseguito le transversioni da C a G (Fig. 1 bis). Oltre a C-41, C-13 è la seconda citosina nella regione del promotore del nucleo che sembra essere frequentemente metilata. Poiché la mutazione da C-13 a G creerebbe un nuovo sito CpG, abbiamo preferito indagare su C-41G. Le varianti del promotore mutato sono state abbreviate con un codice di tre lettere, ad esempio la variante GCC ha guanina anziché citosina nella posizione -508, mentre le basi della citosina a -179 e -41 sono conservate. CCC è il controllo non mutato hCMV-MIE (Fig. 1 bis). I promotori mutati o nativi sono stati introdotti in vari plasmidi e posti a monte di diversi geni reporter.

Per vedere se le mutazioni influenzano la forza del promotore, abbiamo eseguito due esperimenti indipendenti trasferendo transitoriamente plasmidi reporter che esprimono fosfatasi alcalina embrionale secreta (SEAP) in cellule CHO-K1 ed esaminato l’espressione di SEAP cinque giorni dopo la trasfezione. Il promotore non mutato è stato utilizzato come riferimento (Fig. 1 ter). L’espressione del PAES da parte dei promotori GGG, GCG e CGC era costantemente inferiore di circa il 20% rispetto al promotore non mutato, con variazioni minori tra gli esperimenti replicati. In generale, le mutazioni da C a G hanno mostrato una tendenza verso una forza promotrice modestamente ridotta che, tuttavia, sembrava essere accettabile.

Successivamente, abbiamo chiesto se le varianti del promotore hCMV-MIE influenzano la stabilità dell’espressione delle cellule CHO permanentemente trasfette durante la coltivazione a lungo termine. A questo scopo, abbiamo scelto un reporter eGFP che consente l’analisi citometrica dell’espressione genica reporter a livello di singola cellula. I plasmidi reporter di eGFP sono stati trasfettati in cellule CHO-K1 e da tre a quattro pool indipendenti di cellule trasfettate permanentemente sono stati selezionati con metotrexato (MTX). Questi sono stati coltivati per tre mesi in presenza dell’agente di selezione MTX. Trentaquattro e ottantasette giorni dopo la trasfezione, l’espressione di eGFP è stata misurata mediante citometria (due pool sono stati persi tra il giorno 34 e l ‘ 87 a causa della contaminazione). I mezzi geometrici dell’intensità di fluorescenza di 10.000 eventi per misura sono stati calcolati per ogni pool di celle e tracciati per entrambi i punti temporali (Fig. 1c). Trentaquattro giorni dopo la trasfezione c’era poca differenza tra i costrutti. Solo un pool CGC ha mostrato livelli di espressione elevati. Ottantasette giorni dopo la trasfezione, due piscine su quattro trasfettate con CGC e due piscine su tre trasfettate con CCG hanno mostrato valori eGFP distintamente più alti di tutti gli altri pool, trasfettati con il controllo non mutato o con le restanti varianti del promotore. Queste osservazioni hanno suggerito un effetto stabilizzante delle singole mutazioni C-41G o C-179G sull’espressione di eGFP. Per consolidare questo risultato, abbiamo ripetuto l’esperimento con entrambe le varianti del promotore e con un numero maggiore di pool. Abbiamo generato dieci piscine con CCG o CCC, rispettivamente e otto piscine con CGC (due piscine sono state perse a causa della contaminazione). Le cellule sono state coltivate come prima e analizzate mediante citometria a flusso dal giorno 42 al giorno 69 dopo la trasfezione (Fig. 1d e supplementari Fig. S1 online). Dopo 42 giorni, l’espressione eGFP è stata fortemente aumentata in quattro pool CCG rispetto ai pool di controllo CCC, mentre due pool CGC hanno dimostrato un moderato aumento dell’espressione eGFP (Fig. 1d, pannello sinistro). Dopo 69 giorni, tre pool CCG mostravano ancora livelli elevati di eGFP, mentre l’espressione eGFP dei pool CGC era scesa ai livelli di controllo CCC (Fig. 1d, pannello destro). Le differenze tra i gruppi sono state testate in ogni momento con il test Steel-Dwass non parametrico. Il livello alfa è stato impostato su 0.05. Una differenza significativa è stata osservata tra CCG e CCC al giorno 56 dopo la trasfezione (p = 0,0305; vedere Fig. S1 online). Presi insieme, i risultati di Fig. 1c, d ha suggerito che entrambe le mutazioni C-41G e C-179G possono ritardare la perdita di espressione genica ricombinante guidata hCMV-MIE.

Le mutazioni C-41G e C-179G inibiscono completamente la metilazione del DNA nel rispettivo sito poiché la guanina non può essere metilata. Ci siamo chiesti se queste mutazioni influenzassero anche i livelli di metilazione in altri siti CpG all’interno di hCMV-MIE. Pertanto, abbiamo misurato i livelli di metilazione di tutti i siti CpG nelle singole varianti hCMV-MIE mediante conversione di bisolfito accoppiata con sequenziamento di prossima generazione. A tal fine, abbiamo estratto il DNA genomico dai pool cellulari del secondo esperimento 42 e 69 giorni dopo la trasfezione e lo abbiamo trattato con bisolfito per discriminare tra citosina metilata e non metilata. hCMV-MIE DNA è stato amplificato e sequenziato con il sistema Illumina MiSeq (Fig. 1e). C-179 è stato fortemente metilato all’interno di tutti i pool trasfettati con CCC o CCG, confermando le precedenti osservazioni con hCMV-MIE12 non mutato. Inoltre, abbiamo osservato un modello di metilazione distinto che era molto simile a tutti i pool ma differiva nell’intensità complessiva. In particolare, C-508 e C-41 non mutati erano costantemente tra i siti metilati più frequentemente. La mutazione di C-41 nella variante CCG del promotore, particolarmente la mutazione di C-179 nella variante CGC, sembra diminuire uniformemente la metilazione di tutti i siti di CpG piuttosto che cambiare il modello di metilazione. Quando abbiamo calcolato i livelli medi di metilazione in tutti i siti CpG per ciascun pool, abbiamo rilevato una metilazione complessiva inferiore con le varianti del promotore mutato (vedere Fig. S2 online). La differenza è stata più pronunciata con la variante CGC, ma non ha raggiunto la significatività statistica con il test Steel-Dwass (α = 0,05). In media, la metilazione è aumentata nel tempo con tutti i costrutti.

Oltre al silenziamento del promotore epigenetico, la perdita di copie di transgene è una delle principali cause di instabilità della produzione nelle cellule ricombinanti20. Al fine di stimare il contributo relativo, abbiamo misurato i numeri di copia plasmidica da qPCR 42 e 69 giorni dopo la trasfezione. Il numero medio di copie plasmidiche è diminuito nel tempo, senza alcuna differenza evidente tra i costrutti (vedi Fig. S2 online). È interessante notare che la distribuzione dei numeri di copia è stata spostata verso valori più bassi nel gruppo CGC. Tuttavia, quando abbiamo testato la significatività statistica con il test Steel-Dwass, le differenze tra i costrutti non si sono dimostrate significative (α = 0,05).

I pool di cellule permanentemente trasfette sono miscele altamente eterogenee di cloni che differiscono nell’espressione del transgene e nel tasso di crescita. I cloni altamente produttivi tendono ad avere un tasso di crescita più basso21. Pertanto, le cellule a bassa produzione, molte delle quali sono presenti nella cultura dopo la trasfezione, quasi inevitabilmente invadono i produttori alti prima o poi. Al fine di minimizzare questo pregiudizio, abbiamo studiato le mutazioni C-179G e C-41G nelle linee cellulari clonali. Poiché miravamo a valutare gli effetti sulla produzione di un potenziale prodotto commerciale, siamo passati a una proteina di fusione IgG-IL2 come reporter. Pertanto, le varianti del promotore contenenti entrambe le mutazioni da sole (CGC o CCG) o in combinazione (CGG) sono state inserite a monte del gene della catena leggera e del gene della catena pesante di un plasmide di espressione IgG-IL2.

I plasmidi di espressione che trasportano CCG, CGC, CGG o hCMV-MIE non mutate sono stati trasfettati in cellule CHO-K1 e cloni trasfettati stabilmente sono stati isolati in piastre a 384 pozzetti. Trenta linee cellulari clonali per costrutto sono state selezionate casualmente ed espanse in piastre a sei pozzetti. Dopo che le linee cellulari avevano mostrato una crescita stabile, abbiamo studiato la loro produttività per circa due mesi, dal giorno 68 al giorno 134 dopo la trasfezione. Alcune linee cellulari sono state perse a causa della contaminazione o della ridotta vitalità, tuttavia sono stati esaminati da 23 a 29 cloni per costrutto per l’intero periodo di tempo.

Durante l’intero studio abbiamo determinato le concentrazioni di IgG-IL2 nei supernatanti di coltura cellulare e la produttività per cellula e giorno (produttività specifica qP). All’inizio (giorno 68) e alla fine (giorno 134) dello studio, le linee cellulari trasfettate con CGC hanno mostrato titoli significativamente più alti rispetto ai transfettori di controllo (α = 0,05; Fig. 2 bis). Linee cellulari con titoli notevolmente elevati sono state osservate anche tra i trasfettori CGG al giorno 68 e tra i trasfettori CCG e CGG al giorno 134. Quando abbiamo confrontato specifiche produttività tra linee cellulari trasfettate con costrutti diversi, abbiamo fatto osservazioni simili (Fig. 2 ter). Per compensare l’imprecisione nel conteggio delle cellule, abbiamo calcolato la media delle produttività specifiche qP di due passaggi all’inizio (giorno 68-71 e 83-86 dopo la trasfezione che rappresentano i primi punti di dati disponibili) e tre passaggi alla fine della coltivazione a lungo termine (giorno 124-127, giorno 127-131 e giorno 131-134 dopo la trasfezione). Differenze significative tra le linee cellulari trasfette con CGC o CCC sono state osservate alla fine della coltivazione a lungo termine (α = 0,05).

Titoli più elevati e produttività specifica delle linee cellulari che trasportano G-179 o G-41 hanno suggerito un effetto stabilizzante di queste mutazioni sull’espressione genica guidata da hCMV-MIE. Per documentare questo effetto, abbiamo calcolato l’alterazione percentuale di qP durante la coltivazione a lungo termine per ogni singola linea cellulare come misura più appropriata della sua stabilità di produzione (Fig. 2 quater). Naturalmente, questo era fattibile solo con linee cellulari che producevano ancora IgG-IL2 il giorno 68 dopo la trasfezione. One control transfectant ha aumentato la sua produttività specifica del 500% ed è stato identificato come un outlier dall’analisi outlier jackknife (Fig. 2c, trama sinistra). Pertanto questa linea cellulare è stata esclusa da ulteriori analisi (Fig. 2c, trama destra). Le linee cellulari trasfettate con CGC o CCG erano significativamente più stabili delle linee cellulari di controllo trasfettate con CCC (α = 0,05). Sorprendentemente, il doppio mutante CGG non differiva dal controllo.

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