Utvikling Av Chitosan Nanopartikler Som En Stabil Drug Delivery System For Protein / siRNA

Abstract

Chitosan nanopartikler (CS NPs) viser gode fysisk-kjemiske egenskaper som drug delivery systems. Målet med denne studien er å bestemme moduleringen av preparative parametere på de fysiske egenskapene og kolloidal stabilitet AV CS NPs. CS NPs ble fremstilt ved ionisk interaksjon med dekstransulfat (DS) før bestemmelse av deres lagringsstabilitet. De minste CS NPs av nm med en overflateladning på mV ble produsert når CS OG DS ble blandet ved pH 4 og MED ET DS : CS masseforhold på 0,5: 1. En innfangingseffektivitet på 98% ble oppnådd når BSA / siRNA ble lastet inn i nanopartiklene. Resultatene viste også at partikkelstørrelse og overflateladning av CS NPs ble litt endret opp til 2 uker når de ble lagret ved 4°C. Større partikkelstørrelse og overflateladning ble oppnådd ved å øke KONSENTRASJONEN AV DS. Til slutt var NPs tilstrekkelig stabile når de ble holdt ved 4°C og i stand til å bære og beskytte protein.

1. Innledning

Endogene peptider, protein og oligonukleotider er blant de viktigste stoffene som tiltrekker seg mye oppmerksomhet på grunn av deres store potensialer i behandling av kroniske sykdommer . Imidlertid har det ekstreme in vivo miljøet i menneskekroppen alltid begrenset terapeutiske anvendelser av disse stoffene . Polymere nanopartikler har tiltrukket seg mye oppmerksomhet som leveringssystemer på grunn av deres evne til å overvinne de fysiologiske barrierer og beskytte og målrette de lastede stoffene til bestemte celler . Naturlig forekommende polymerer som chitosan (CS) har blitt studert for å danne nanopartikler . CS ER et biologisk nedbrytbart polysakkarid, og det er avledet fra deacetylering av kitin . Bortsett fra dets biokompatibilitet bidrar de lave toksisitets -, hemostatiske og bakteriostatiske egenskapene også til dets forskjellige anvendelser innen farmasøytisk felt . Flere anioner har blitt undersøkt for å krysse CS som natriumsulfat og dekstransulfat (DS) . DS er i stand til å modifisere protein og siRNA entrapment efficiency (ee) uten bruk av herdemidler og kontrollere mengden av legemiddelfrigivelse på grunn av dens høye ladningstetthet . FORUTEN DS er et billig materiale, produserer det mekanisk mer stabile nanopartikler sammenlignet med pentasodium tripolyphosphate (tpp) .

Flere studier hadde rapportert de unike egenskapene til chitosan nanopartikler (CS NPs) ved HJELP AV DS. Imidlertid er moduleringen av preparative parametere på deres fysiske egenskaper fortsatt ikke fullt ut undersøkt, for eksempel PÅVIRKNING AV DS steric hindring på den elektrostatiske attraksjonen MELLOM CS og BSA . Videre er determinanten av et vellykket legemiddelleveringssystem avhengig av dets fysiske egenskaper og stabilitet. Derfor er målene for denne studien var å modulere preparative parametere for å oppnå nanosized partikler AV CS NPs og for å bestemme deres kolloidal stabilitet ved forskjellige lagringstemperaturer og i ulike suspending medier.

2. Materialer og Metoder

2.1. Materialer

kitosan Med lav molekylvekt (70 kDa med graden av deacetylering 75% -85%), iseddiksyre, fosfatbufret saltvann (PBS), bovint serumalbumin (BSA, 46 kDa) og Bradford reagens ble kjøpt Fra Sigma-Aldrich Inc., USA. Dobbelstrenget siRNA (sense: 5′-GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) ble kjøpt fra Thermoscientific Dharmacon, USA. Dextransulfat (DS) ble kjøpt fra Fisher Scientific, STORBRITANNIA. Protein ladder (High range), Laemmli prøvebuffer, 10x tris / glysin / natriumdodecylsulfatbuffer, ammoniumpersulfat, tetrametylendiamin (TEMED), 2% bis-løsning og 40% akrylamidoppløsning ble kjøpt fra Bio-Rad, USA. Tris-HCl buffer ble hentet fra Invitrogen, USA. Alle andre kjemikalier som ble brukt var av analytisk karakter.

2.2. Fremstilling Av Blank OG BSA-Lastet CS NPs

CS og DS-oppløsning ble oppløst i henholdsvis 1% v/v eddiksyre og destillert vann. pH I CS-oppløsningen ble justert til pH 4 ved å tilsette 1 M NaOH eller 1 M HCl. DS-løsning (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% og 0,25% w / v) ble tilsatt dråpevis I CS-løsning (0,1% w/v) under magnetisk omrøring (WiseStir Digital Multipoint Magnetic Stirrer MS-MP8, DAIHAN Scientific, Korea) ved 250 rpm i 15 min for å danne nanopartikler. Alle prøver ble laget i tre eksemplarer. De resulterende nanopartiklene ble vasket og høstet ved ultracentrifugering (Optima L-100 XP Ultracentrifuge med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) to ganger ved 12 500 rpm i 15 min ved 10°c. FOR bsa-tilknytning TIL CS NPs ble BSA oppløst I CS-oppløsning (0,1% w / v, pH 4) for å produsere en endelig konsentrasjon på 1 mg / mL. BSA-lastet CS NPs ble deretter fremstilt ved fremgangsmåten ovenfor. FOR siRNA-tilknytning TIL CS-NPs ble det lagt til 3 µ av siRNA (15 µ/µ) i avionisert vann (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, og 0,25% w / v) før du legger denne dråpevis TIL CS-løsningen (0,1% w / v).

2.3. Elektroforetisk Mobilitetsstudie

Elektroforetiske mobilitetsmålinger () AV CS NPs ble utført Med En Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) og ble målt mot ventetid. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer.

2.4. Nanopartikler Karakterisering

Partikkelstørrelse, overflateladning og polydispersitetsindeks (pdi) av ferskt tilberedte CS NPs ble målt ved Hjelp Av En Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), basert på fotonkorrelasjonsspektroskopi (PCS) teknikker. Ingen fortynninger ble utført under analysen. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer. Målingene ble gjort ved 25°C.

2.5. Morfologisk Analyse

Morfologisk karakterisering av losset CS NPS, BSA / siRNA lastet CS NPs (DS: CS vektforhold på 0,5: 1, 1 : 1) ble utført ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Nederland).

2.6. Bsa / siRNA Entrapment Effektivitet

BSA / siRNA lastet CS NPS ble separert fra løsningen ved ultracentrifugering (Optima L-100 XP Ultracentrifuge med en rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) ved 14000 rpm i 30 min. Supernatanter gjenvunnet fra sentrifugering ble dekantert. BSA-innhold i supernatanten ble analysert VED ET UV-Vis-spektrofotometer ved 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japan) ved Hjelp Av Bradford – proteinanalysen i henhold til produsentens instruksjon. siRNA-innholdet i supernatanten ble analysert VED ET UV-Vis-spektrofotometer ved 260 nm. Prøvene ble utarbeidet og målt i tre eksemplarer. Bsa / siRNA entrapment efficiency (ee) ble beregnet ved hjelp av følgende ligning:

2.7. Stabilitet AV CS NPs

nylaget CS NPS (laget av 0,05% og 0,1% w/v AV DS og CS løsning, resp.) ble sentrifugert ved 12 500 rpm i 15 min før lagring. Etter ultracentrifugering ble de oppnådde pellets resuspendert i enten destillert vann (målt pH på 6,6) eller PBS pH 7,4. Partikkelstørrelsen og overflateladningen ble målt ved forhåndsbestemte lagringstidsvarigheter (0, 1, 2, 3, 5, 8, og 14 dager), og ved enten omgivelsestemperatur Eller 4°C.

2.8. In Vitro Legemiddelfrigivelsesstudie

frigivelsen Av BSA/siRNA ble bestemt ut fra CS NPs med høyest EE (DS : CS ratio 1 : 1, EE = 98% ± 0,2 og , resp.). BSA / siRNA-ladede CS-Np-er ble suspendert I Tris-HCl-bufferløsning (pH 7,4, 4 mL) og plassert på en magnetisk omrører med en omrøringshastighet på 100 o / min ved 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Tyskland) i 48 timer ved 37°C. ved forhåndsbestemte tidsintervaller (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, og 48 timer) ble prøvene sentrifugert ved 14 000 rpm i 30 min ved 10°C. deretter ble supernatanten dekantert og erstattet med et tilsvarende volum fersk bufferløsning. Mengden frigjort BSA / siRNA i supernatanten ble analysert av ET UV-Vis spektrofotometer (U. V-1601; Shimadzu, Japan) ved en bølgelengde på henholdsvis 280 og 260 nm.

2.9. BSA Integritet

integriteten TIL BSA frigjort FRA CS NPs ble bestemt AV SDS-SIDE (12% oppløsning og 10% stabling gel) Ved Hjelp Av Mini-Protein System (Bio-Rad, USA). BSA-prøver ble blandet Med laemmli-prøvebuffer i forholdet 1: 1 og oppvarmet til 95°C i 5 min. Prøver (15 µ) ble lastet inn i brønnene og gelen ble kjørt ved Hjelp Av En Mini-Protein System Tetra Celle ved en konstant spenning på 150 V i 90 min med en løpende buffer inneholdende 25 mM Tris, 192 mM glysin, og 0,1% SDS ved pH 8,3. Prøvebåndene ble farget i 40 min med 0,1% Coomassie blå oppløsning inneholdende 40% eddiksyre og 10% metanol, etterfulgt av farging over natten med en løsning av 40% eddiksyre og 10% metanol.

2.10. Statistisk Analyse

Alle data ble presentert som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Statistisk analyse (ANOVA test og Tukeys posthoc analyse) ble utført ved Hjelp Av Statistikkpakken FOR Social (SPSS) programversjon 15. En verdi < 0,05 viste signifikant forskjell mellom gjennomsnittet av testede grupper.

3. Resultater

3.1. Partikkelstørrelse Og Overflatelading

Figur 1 (a) viser resultatene av elektrisk mobilitet () mot ventetid. Fra grafen kunne det observeres at det gjenværende platået og konstant etter 30 min. Dette viser at dannelsen av stabilt elektrisk dobbeltlag (e.d.l.) ikke var øyeblikkelig, men krevde noen øyeblikk. Effektene MELLOM CS-konsentrasjon og DS – sluttkonsentrasjoner på STØRRELSEN PÅ CS NPs er presentert I Figur 1 (b). Det ble observert at de fleste CS NPs med størrelsen mindre enn 500 nm ble oppnådd ved lav CS-konsentrasjon (0,1% w/v). DS-konsentrasjonen påvirket også størrelsen på nanopartikler (). EN økende trend i partikkelstørrelse kan observeres ved å øke DS-konsentrasjonen fra 0,05 til 0,25% w / v. GENERELT SETT ER DS-konsentrasjonen på 0.05% w/v (lav konsentrasjon) produserte nanopartikler med partikkelstørrelse mindre enn 500 nm. I motsetning til dette ble store nanopartikler (>1000 nm) oppnådd når konsentrasjonen av begge polymerer ble økt til 0,25% eller høyere. BASERT PÅ resultatene BLE DS-konsentrasjoner fra 0,05 til 0,20% w/v valgt for følgende studier. Videre førte en økning I DS : CS-vektforholdet (høyere tetthet av negative ladninger fra DS til stede i systemet) til en økning i partikkelstørrelse, men en reduksjon i partikkeloverflateladningen (Tabell 1 (ovenfor)). DA CS-vekten oversteg DS-MASSEN, ble det oppnådd en positiv verdi på +56,2 ± 1,5 mV. Partikkeloverflateladningen ble imidlertid redusert til-mV når mer negativt ladet DS ble tilsatt. DET ble kontinuerlig avtagende da DS: CS vektforholdet hadde nådd til 2,5: 1. Dette var forventet å skyldes et overskudd AV DS-molekyler akkumulert på overflaten av nanopartikler.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

Elektroforetisk mobilitet som en funksjon av tid (a) og effekt av de endelige konsentrasjonene AV CS og DS på partikkelstørrelsen av nanopartikler (b), .

Tabell 1 (under) viser AT DS 0.2% w / v hadde den største partikkelstørrelsen etter å ha blitt lastet MED BSA. Partikkelstørrelsen er nm. Partikkelstørrelse FOR DS ved konsentrasjon på 0,1 og 0.15% w / v var også større enn de tomme (). På den annen side ble høyere positive verdier av overflateladning observert for bsa-lastede nanopartikler sammenlignet med de tomme. Dette ble observert for ALLE DS-konsentrasjoner. Videre kan høyere ee-verdier oppnås ved å øke DS: CS vektforholdet over 0,5 : 1. EE av nanopartikler VED DS : CS vektforhold på 1 : 1, 1,5 : 1 og 2: 1 var henholdsvis%, % og%. Den høyeste EE ble oppnådd VED ET DS: CS vektforhold 1: 1 (Tabell 1 (under)).

Tabell 2 viser AT DS 0.2% w / v hadde den største partikkelstørrelsen (900 ± 60 nm) etter å ha blitt lastet med siRNA. siRNA lastet CS NPs ved forskjellige DS-konsentrasjoner (0,05, 0,1, 0,15 og 0,2% w/v) viste mindre partikkelstørrelse. EE av nanopartikler VED DS: CS vektforhold av 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, og 2: 1 var henholdsvis%,%, % og%.

3.2. Morfologi

bildene AV CS NPs ble oppnådd VED TEM (Figur 2). Figur 2 (a) og 2 (b) viser at lossede CS NPs viste en sfærisk struktur. Bildene viste at nanopartikler generert fra siRNA(Figur 2(e) og 2 (f)) viste uregelmessig morfologi; IMIDLERTID viste bsa-lastede nanopartikler langstrakte morfologier(Figur 2(c) og 2 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 2

TEM bilder AV CS NPs. (a) Og (b) Lastet CS NPs ved 0,5: 1 og 1: 1, (c) og (d) bsa lastet CS NPs ved 0,5 : 1 og 1 : 1, og (e) og (f) siRNA lastet CS NPs på henholdsvis 0,5 : 1 og 1 : 1. Alle bildene ble tatt ved 60 kX forstørrelse.

3.3. Lagringsstabilitet AV CS NPs

begge nanopartikler laget av 0,05 og 0,10% w / V DS ble økt i størrelse over tid som vist i Figur 3 (a) når de ble lagret ved omgivelsestemperatur. En signifikant økning i partikkelstørrelse ble observert etter dag 14 av lagring spesielt for 0.05% w / V DS. Dette ble antatt å skyldes dannelsen av aggregater. Dette funnet bekreftet med resultatene av overflateladning som viste en reduksjon i overflateladning til nesten nøytral. Derimot, da de ble lagret på 4°C, ble partikkelstørrelsen og overflateladningen uendret i opptil 14 dager for nanopartikler laget av 0,10% w / V DS. En liten endring ble observert for 0,05% w / V DS(Figur 4(a) og 4 (b)). På den annen side, da disse nanopartiklene ble suspendert I PBS pH 7,4, ble alle formuleringer samlet til større størrelser på mer enn 1 µ med PDI-verdier mer enn 0,5. Deres partikkeloverflateavgifter var også nesten nøytrale, alt fra + 0.2 til +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b))

Figur 3

(A) Partikkelstørrelse og (b) overflateladning AV CS NPs fremstilt ved 0,05 og 0,01% W/V DS oppløsning og lagret ved 25°C. Nanopartikler ble suspendert i destillert vann (pH i området 6-7),.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 4

(A) Partikkelstørrelse og (b) overflateladning AV CS NPs fremstilt ved 0,05 og 0,10% w / v og lagret ved 4°C. Nanopartikler ble suspendert i destillert vann (pH i området 6-7),.

3.4. Bsa In Vitro Utgivelse Og Integritet

Figur 5 (a) illustrerer at utgivelsen AV BSA kan deles inn i to trinn basert på utgivelsesraten. I første fase ble BSA raskt frigjort FRA CS NPs og viste en burst-utgivelse i den første 6 h. dette resulterte i en 45% ± 5 kumulativ utgivelse AV BSA. I andre trinn ble BSA langsomt frigjort fra 6 h opp til 48 h, noe som resulterte i en kumulativ bsa-frigjøring på mer enn 60%. Integriteten TIL BSA frigjort FRA CS NPS ble evaluert AV SDS-PAGE og er vist Ved Figur 5 (b). Bandene observert bekreftet AT BSA som hadde tålt lasting og frigjøring prosesser på 37°C etter dag 1 og 2 var ikke forskjellig fra den nylagde BSA standarder. Derfor kan DET konkluderes med AT BSA forblir i sin opprinnelige form i CS NPs under eksperimentelle forhold.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

(a) utgivelsesprofilen til BSA lastet CS NPs ved DS: CS-forhold på 1: 1 ved pH 7.4, . (b) SDS – SIDEANALYSE av BSA frigjort fra CS NPs: (M) SDS-sidestandarder (BIO-RAD); (A) BSA-standard 1 mg/mL; (B) BSA-standard 0,2 mg/mL; (C) blank; (D) losset CS NPs; (E) og (F) BSA frigjort fra CS NPs (DS : CS-forhold på 1 : 1) ved dag 1 og 2.

3.5. siRNA In Vitro Release

Figur 6 illustrerer at utgivelsen av siRNA kan deles inn i to trinn basert på release rate. I første fase ble siRNA raskt frigjort FRA CS NPs og viste en burstutgivelse i den første 6 h. Dette resulterte i en 58% ± 5 kumulativ utgivelse av siRNA. I andre trinn ble siRNA langsomt frigjort fra 6 h opp til 48 h, noe som resulterte i en kumulativ bsa-frigjøring på mer enn 85%.

Figur 6

utgivelsen profilen til siRNA lastet CS NPs PÅ DS: CS forholdet 1: 1 på pH 7.4,.

4. Diskusjoner

metoden som brukes til å produsere CS NPs i denne studien er en mild prosess, og den muliggjør kontroll av partikkelstørrelsen ved å variere visse parametere, for eksempel konsentrasjon av tilsatte salter, viskositet, mengde ikke-solvent og molekylvekt av polymer. Denne studien ble startet med undersøkelsen for å få informasjon om elektrisk tilstand av ioniserbare grupper AV CS NPs ved å bestemme stabiliseringstiden for e.d. l. Dette trinnet er viktig for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultater. De oppnådde data antydet at dannelsen av stabil e.d.l. under nanopartikler forberedelse kreves noen øyeblikk etter å ha stoppet omrøring. Disse øyeblikkene var nødvendig for at elektrolyttene skulle trenge inn i partikkelkjernen. Dermed var ventetid på 40 min nødvendig før CS NPs kunne måles nøyaktig. Dette funnet var lik CS-tripolyphosphate (CS-TPP) NPs som foreslo samme ventetid .

en studie ble også utført for å bestemme påvirkning av polymerkonsentrasjon på partikkeldannelse. Studien var rettet mot å etablere rekkevidden av polyelektrolytkonsentrasjon for å produsere nanopartikler med ønsket størrelse. FOR å studere effektene av de varierende konsentrasjonene AV CS og DS på dannelsen av nanopartikler, BLE CS og DS-oppløsning på 0,1, 0,25 og 0,5% w/v fremstilt. Variable volumer AV DS-løsning (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, og 10 mL) ble blandet med 5 mL AV HVER CS-konsentrasjon (0,1-0,5% w / v). Den endelige konsentrasjonen AV CS og DS ble beregnet, og prøvestørrelser ble kategorisert enten som 100-500, 501-1000 eller mer enn 1000 nm. Det ble funnet at partikkelstørrelsen ble påvirket av DS-konsentrasjonen. Dette funnet bekreftet med resultatene AV CS-TPP NPs . Generelt er den ønskede størrelsen på nanopartikler begrenset mellom 100 og 1000 nm. Tidligere studier har imidlertid vist at de lastede nanopartiklene normalt vil produsere en større størrelse enn de tomme. Størrelsen på under 500 nm er derfor gunstig.

videre viste resultatene at BARE DS-konsentrasjon på 0,05% w / v var i stand til å produsere nanopartikler med partikkelstørrelse mindre enn 500 nm som vist i Tabell 1. Det var forventet som når begge polymerer var i lave konsentrasjoner, tilsetningen AV DS TIL CS resulterte i små coacervate kjerner. I motsetning til det, store coacervates som oversteg 1000 nm i størrelse tendens til å danne når begge polymerer konsentrasjonen økt til 0,25% eller høyere. Chitosans evne til spontant å danne coacervate skyldes samspillet mellom motsatt ladede polyelektrolytter for å danne et polyelektrolytkompleks med redusert oppløselighet. Blandingen av HØY konsentrasjon AV DS MED CS er derfor mer sannsynlig å påvirke forstyrrelsen AV CS-kjedene og oppløseligheten av det resulterende komplekset. Som et resultat vil en høy grad av kompleksering og coacervate bli produsert . Den reduserte viskositeten ved lavere KONSENTRASJON AV CS resulterte også i bedre oppløselighet. Dette tillot en mer effektiv interaksjon mellom kationiske CS og motsatt ladede ioner, og dermed en mindre partikkelstørrelse ble produsert . I tillegg resulterte en økning og overskudd i den molare massen av polyanionen som ble brukt, i større partikler fordi svært nøytraliserte komplekser ble dannet og de hadde en tendens til å flokkulere . I denne studien var partikkeloverflateladningen av nanopartikulatsystemet avhengig av vektforholdet MELLOM DS og CS. Partikkeloverflateladningen ble funnet å økes ettersom forholdet ble redusert. Dette forholdet kan være nyttig for å oppnå ønsket partikkeloverflateladningstetthet for å lette adhesjons-og transportegenskapene til nanopartiklene.

i denne studien ble inkorporeringen AV BSA i CS NPs oppnådd ved ganske enkelt å blande den sure CS-løsningen som inneholder oppløste bsa-molekyler med DS-løsningen ved romtemperatur uten tilsetning av stabilisator. BSA brukes ofte som et modellprotein fordi det omfatter den generelle egenskapen til andre proteiner, og det er biokompatibelt for mennesker. DET ble funnet AT CS NPs var relativt større i størrelse etter lasting MED BSA. Partikkelstørrelsen ble forventet å øke når BSA ble vellykket lastet inn i nanopartikler. Denne trenden kan muligens skyldes molekylvekten og størrelsen på de tilsatte bsa-molekylene. Disse store partikkelstørrelsene kan begrense bruken av protein. Nanopartikler på 150-300 nm finnes hovedsakelig i leveren og milten . Dessuten, ifølge enkelte rapporter, er det” ideelle ” størrelsesbehovet for nanopartikler utviklet for kreftbehandling mellom 70 og 200 nm . Selv om nanopartikler ikke skal være større enn 150 nm for å krysse endotelbarrieren, rapporterer litteraturen alltid penetrasjon av partikler større enn grensene for fenestrasjoner. Faktisk kan fenestrasjon og vaskulaturen gjennomgå modifikasjon under ulike patologiske forhold .

for eksempel vil tumorvekst indusere utviklingen av neovaskulatur preget av diskontinuerlig endotel med store fenestrasjoner på 200-780 nm . Dessuten ble det observert at partikkeloverflateladningen AV bsa-lastet nanopartikkel var høyere enn de tomme. Dette kan skyldes kationisk karakteristikk besatt AV BSA når den er tilstede i sur tilstand. De positive ladningene FRA CS-og BSA-molekyler har derfor bidratt til en høyere verdi av partikkeloverflateladning for de lastede nanopartiklene.

Positivt ladede kationiske polymerer kan effektivt binde seg til og beskytte nukleinsyrer som DNA, oligonukleotider og siRNA . I denne studien ble inkorporeringen av siRNA i CS NPs oppnådd ved ganske enkelt å blande den sure CS-løsningen med DS-løsningen som inneholdt siRNA ved romtemperatur. Det ble funnet at partikkelstørrelsen PÅ CS NPs var relativt mindre i størrelse etter lasting med siRNA. DEN mindre størrelsen PÅ CS NPs lastet med siRNA kan skyldes nøytralisering av negative ladninger av nukleinsyre av kationisk polymer som resulterer i kondenserte mindre nanopartikler. SiRNA lastet CS NPs viste også høyere zeta potensial enn blank CS NPs, etter samme trend som FOR BSA lastet CS NPs.

Ideelt sett bør et vellykket leveringssystem ha en høy grad av assosierende legemidler. SiRNA lastet CS NPs viste høyere entrapment effektivitet (< 90%) for ALLE DS: CS vektforhold. Innfangingseffektiviteten av nanopartikler VED DS: CS vektforhold på 1: 1, 1,5 : 1 og 2: 1 var høyere enn vektforholdet på 0,5: 1. Dette fenomenet var mest sannsynlig på grunn av høyere andel DS presentert i nanopartikler. Som MER DS lagt til, ville det legge til rette for MER BSA å bli innesluttet i nanopartikler. DETTE kan forklares ved AT BSA er et zwitterionisk molekyl. Ved ph i formuleringsmediet på 3,5-4,0, kan oppløseligheten AV BSA økes sterkt på grunn av økte positive ladninger besatt av den . DERMED VIL BSA kunne elektrostatisk feste og stabilt laste inn i nanopartiklene. I sur løsning KAN BSA ha positiv ladning og konkurrere MED CS for å interagere med DS elektrostatisk. Dette funnet ble bekreftet med økte positive overflateavgifter AV BSA-lastet CS NPS sammenlignet med lossede. Videre er det multi-ioniske steder PÅ BSA, og denne funksjonen kan lette inkorporeringen AV BSA i nanopartikler. Dette funnet er forskjellig fra funnet MED CS-TPP NPs .

i studien var den elektrostatiske interaksjonen tilstede mellom BSA og CS, i stedet FOR BSA og TPP. DET ble også foreslått AT BSA skulle oppløses i en løsning med pH høyere enn det isoelektriske punktet for AT BSA skulle ha negativ ladning og interagere med de positivt ladede CS-molekylene. Dette funnet viste derfor at elektrostatisk interaksjon er den viktigste medvirkende faktor for å fremme inkorporering AV BSA i nanopartikler enten VIA CS-protein interaksjon eller DS-protein interaksjon.

TEM tillater nanoskala visualisering av individuelle nanopartikler og gir informasjon av både størrelse og morfologi. Partikkelmorfologien er en viktig faktor for kolloidal og kjemisk stabilitet, samt bioaktiviteten til nanopartikler. siRNA lastet CS NPs viste uregelmessig morfologi; IMIDLERTID viste BSA lastet CS NPs langstrakt morfologi. Dette kan skyldes større STØRRELSE AV BSA som kan forstyrre ELLER virke som et skjold TIL CS, og dermed begrense den totale eksponeringen AV CS innen struktur.

Stabilitetsprofil FOR CS NPs ved lagring er også viktig. Denne informasjonen kan gi en visning om stabiliteten av nanopartikler under ulike medier og temperatur. Stabiliteten til nanopartikler ble undersøkt ved å vurdere deres variasjon i gjennomsnittlig partikkelstørrelse og overflateladning over tid. Først ble nanopartiklene resuspendert i destillert vann ved pH 6,6 som ble filtrert med 0,2 µ filter for å fjerne mulige forurensninger tilstede i vann. For denne studien ble bare nanopartikler laget av 0,05 og 0,10% w/v DS testet. ANDRE DS-konsentrasjoner ble ikke bestemt på grunn av økt partikkelstørrelse etter sentrifugering. Partikkelstørrelsen var opp til nm og nm for henholdsvis 0,15% og 0,20% W/V DS. Økningen av partikkelstørrelse kan på GRUNN AV CS nps selv erodere og miste sin sfæriske form i et vandig miljø, og følgelig vil partikkelens gjennomsnittlige diameter stige som respons på denne erosjonen . Videre ble partikkeloverflateavgifter for nanopartikler laget av begge konsentrasjoner avtagende over tid. DET ble antatt AT CS kan bli degradert i vandige medier, selv om det ikke er lysozymer. Resultatene viste at CS NPs var mer stabile når de ble lagret ved 4°C, da partikkelstørrelsen og overflateladningen var uendret eller litt endret i opptil 14 dager. Resultatene antydet også AT CS NPs ikke skal lagres ved omgivelsestemperatur da de er utsatt for nedbrytning. Resultatene antydet derfor AT CS NPs lagret ved romtemperatur er mer utsatt for nedbrytning enn de som ble lagret i kjølig miljø. Det var sannsynligvis på grunn av det kjølige miljøet som kan bremse den kinetiske bevegelsen av nanopartikler. Dermed kan nanopartiklene opprettholde sin sfæriske form og erosjon vil være mindre sannsynlig å forekomme. Videre ble det observert at disse nanopartikler ble aggregert I PBS ved pH 7.4. Dette kan tilskrives lavere partikkeloverflateladning av nanopartikler i PBS, nær nøytral. Partikkeloverflateladning som falt til null kan indikere AT CS NPs hadde gjennomgått ladningskansellering av fosfatgrupper AV PBS. Den nøytrale ladede statusen til disse nanopartiklene kan føre til tap av intra – og intermolekylære krefter, viktig for å opprettholde nanopartiklene individuelt. Som et resultat kan disse uladede nanopartiklene begynne å aggregere og destabilisere kolloidalsystemet. I motsetning til PBS kan destillert vann gi mange hydrogenioner for å danne hydrogenbindinger som kan bidra til å bryte aggregering av nanopartikler ved å interagere med ioniserbare grupper AV CS NPs.

in vitro release-studien av BSA og siRNA fra CS NPs ble utført I Tris-HCL buffer. Utgivelsen AV BSA og siRNA kan deles inn i to faser basert på utgivelsesraten. I første fase ble stoffet raskt frigjort FRA CS NPs. Utgivelsen AV BSA og siRNA på dette stadiet kan innebære diffusjon AV BSA / siRNA bundet på partikkeloverflaten. I andre trinn ble BSA/siRNA frigjort sakte på grunn av hevelse eller nedbrytning av polymeren. De resterende BSA / siRNA I CS NPs ville ikke helt bli frigjort før partiklene ble fullstendig erodert eller oppløst i frigjøringsmedium. Dette kan ha vært på grunn av samspillet mellom den gjenværende BSA / siRNA og fri aminogruppe PÅ CS segmenter . I tillegg sikret det syntetiserte systemet som tidligere er beskrevet som å kunne formuleres under milde forhold at stabiliteten av proteinene lastet inn I CS NPs var intakt som bestemt AV SDS-SIDE.

5. Konklusjoner

oppsummert viser denne studien AT CS og DS-konsentrasjon samt pH var parametrene som kontrollerte partikkelstørrelse og overflateladning AV CS NPs. Nanopartikler mindre enn 500 nm kan oppnås VED DS: CS vektforhold på 0,5: 1 ved pH 4. I TILFELLE AV BSA entrapment har nanopartikler med høyere DS: CS vektforhold hatt høyere entrapmenteffektivitet på mer enn 88%. Den høyeste prosentandelen av innfangingseffektivitet oppnådd var på 0,10% w / V DS (DS : CS-forhold på 1 : 1). CS NPs lastet med siRNA viste imidlertid høy entrapment effektivitet (> 90%) for ALLE DS: CS-forhold. Lagringstemperatur og suspensjonsmedium ble funnet å være faktorene som kunne påvirke STABILITETEN TIL CS NPs. CS NPs var labile og har en tendens til å destabilisere ved omgivelsestemperatur, men holde tilbake denne labile oppførselen når kjølig miljø (2-4°C) ble gitt. I TILLEGG HADDE CS NPs bedre stabilitet i destillert vann enn I PBS, noe som kan skyldes hydrogenbindinger som dannes mellom vannmolekyler og ioniserbare GRUPPER AV CS NPs.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at det ikke er noen personlig eller økonomisk interessekonflikt i dagens forskning.

Anerkjennelse

forfatterne takknemlig erkjenner “Dana Lonjakan Penerbitan” Av Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) for finansiering og støtte dagens forskningsprosjekt.