ontwikkeling van Chitosan nanodeeltjes als een stabiel Geneesmiddelafgiftesysteem voor proteïne/siRNA

Abstract

Chitosan nanodeeltjes (CS NPs) vertonen goede fysisch-chemische eigenschappen als geneesmiddelafgiftesysteem. Het doel van deze studie is het bepalen van de modulatie van preparatieve parameters op de fysische eigenschappen en colloïdale stabiliteit van CS NPs. CS NPs werden gefabriceerd door ionische interactie met dextraansulfaat (DS) voorafgaand aan de bepaling van hun opslagstabiliteit. De kleinste CS NPs van nm met een oppervlakte lading van mV werden geproduceerd wanneer CS en DS werden gemengd bij pH 4 en met een DS : CS massaverhouding van 0,5 : 1. Een bekneldingsefficiency van 98% werd bereikt toen BSA / siRNA in nanoparticles werd geladen. De resultaten toonden ook aan dat de deeltjesgrootte en de oppervlakte lading van CS NPs lichtjes tot 2 weken werden veranderd wanneer opgeslagen bij 4°C. grotere deeltjesgrootte en oppervlakte lading werden verkregen met het verhogen van de concentratie van DS. Concluderend was NPs voldoende stabiel bij 4°C en in staat om eiwitten te dragen en te beschermen.

1.

endogene peptiden, eiwitten en oligonucleotiden behoren tot de belangrijkste geneesmiddelen die veel aandacht trekken vanwege hun grote potentieel voor de behandeling van chronische ziekten . Echter, de extreme in vivo omgeving van het menselijk lichaam heeft altijd beperkt de therapeutische toepassingen van deze stoffen . Polymere nanoparticles hebben veel aandacht aangetrokken als leveringssystemen toe te schrijven aan hun capaciteit in het overwinnen van de fysiologische barrières en het beschermen en richten van de geladen substanties aan specifieke cellen . Natuurlijk voorkomende polymeren zoals chitosan (CS) zijn bestudeerd om nanoparticles te vormen . CS is een biologisch afbreekbaar polysaccharide, en het wordt afgeleid van deacetylation van chitine . Afgezien van zijn biocompatibiliteit, dragen de lage giftigheid, hemostatische, en bacteriostatische eigenschappen ook bij aan zijn diverse toepassingen op farmaceutisch gebied . Verschillende anionen zijn onderzocht om CS zoals natriumsulfaat en dextraansulfaat (DS) te crosslinkeren . DS kan proteã ne en siRNA entrapment efficiency (EE) zonder het gebruik van verhardende agenten wijzigen en het tarief van drugversie wegens zijn hoge ladingsdichtheid controleren . Naast DS is een goedkoop materiaal, produceert het mechanisch stabielere nanodeeltjes in vergelijking met het pentanatriumtripolyfosfaat (TPP) .

verschillende studies hadden melding gemaakt van de unieke kenmerken van chitosan nanodeeltjes (CS NPs) met behulp van DS. Echter, de modulatie van preparatieve parameters op hun fysieke kenmerken is nog niet volledig onderzocht, bijvoorbeeld de invloed van dS sterische belemmering op de elektrostatische aantrekking tussen CS en BSA . Voorts is de determinant van een succesvol systeem van de druglevering afhankelijk van zijn fysieke kenmerken en stabiliteit. Daarom waren de doelstellingen van deze studie het moduleren van preparatieve parameters om nanosized deeltjes van CS NPs te verkrijgen en hun colloïdale stabiliteit te bepalen bij verschillende opslagtemperaturen en in verschillende suspensiemedia.

2. Materialen en methoden

2.1. Materialen

laagmoleculaire chitosan (70 kDa met de deacetyleringsgraad van 75% -85%), ijsazijn, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), runderserumalbumine (BSA, 46 kDa) en Bradford-reagens werden gekocht bij Sigma-Aldrich Inc., VERENIGDE. Double-stranded siRNA (sense: 5′-GAUAUGUCCGGUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGACAUAAUCUU-5′) werd aangeschaft bij Thermoscientific Dharmacon, USA. Dextraan sulfaat (DS) werd gekocht bij Fisher Scientific, UK. Protein ladder (High range), laemmli sample buffer, 10x tris/glycine/sodium dodecyl sulfate buffer, ammonium persulfate, tetramethyleendiamine (TEMED), 2% bis oplossing, en 40% acrylamide oplossing werden gekocht bij Bio-Rad, USA. Tris-HCl-buffer werd verkregen uit Invitrogen, VS. Alle andere gebruikte chemische stoffen waren van analytische kwaliteit.

2.2. Bereiding van Blanco en BSA-geladen CS NPS

CS en DS-oplossing werden opgelost in respectievelijk 1% v/v azijnzuur en gedestilleerd water. de pH van de CS-oplossing werd aangepast aan pH 4 door toevoeging van 1 m NaOH of 1 m HCl. DS-oplossing (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0.2%, en 0.25% w / v) werd druppelsgewijs toegevoegd in CS-oplossing (0.1% w / v) onder het magnetische bewegen (WiseStir digitale Multipoint magnetische roerder MS-MP8, Daihan Scientific, Korea) bij 250 rpm gedurende 15 min om nanoparticles te vormen. Alle monsters werden in drievoud gemaakt. De resulterende nanodeeltjes werden gewassen en geoogst door ultracentrifugatie (Optima l-100 XP Ultracentrifuge met een rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) tweemaal bij 12 500 rpm gedurende 15 min bij 10°C. Voor BSA associatie in CS NPs, werd BSA opgelost in CS-oplossing (0,1% w/v, pH 4) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL. BSA-geladen CS NPs werden vervolgens bereid door de bovenstaande methode. Voor siRNA-associatie in CS NPs werd 3 µL siRNA (15 µg/µL) in gedeïoniseerd water toegevoegd aan DS-oplossing (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, en 0,25% w / v) alvorens deze druppelsgewijs toe te voegen aan CS-oplossing (0,1% w / v).

2.3. Elektroforetische Mobiliteitsstudie

elektroforetische mobiliteitsmetingen () van CS NPs werden uitgevoerd met een Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) en werden gemeten tegen de wachttijd. Elk monster werd geanalyseerd in drievoud.

2.4. Nanodeeltjes karakterisatie

deeltjesgrootte, oppervlakte lading en polydispersity index (PDI) van vers bereide CS NPs werden gemeten met behulp van een Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), gebaseerd op de Foton correlatie spectroscopie (PCS) technieken. Tijdens de analyse werden geen verdunningen uitgevoerd. Elk monster werd geanalyseerd in drievoud. De metingen werden verricht bij 25°C.

2,5. Morfologische analyse

morfologische karakterisering van onbelaste CS NPs, BSA / siRNA geladen CS NPS (DS: CS gewichtsverhouding van 0,5: 1, 1 : 1) werd uitgevoerd met behulp van transmission electron microscopy (tem), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Nederland).

2.6. BSA/siRNA Entrapment Efficiency

BSA / siRNA geladen CS NPS werden gescheiden van de oplossing door ultracentrifugatie (Optima l-100 XP Ultracentrifuge met een rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) bij 14000 toeren per minuut gedurende 30 minuten. De Supernatants die uit centrifugering werden verkregen, werden gedecanteerd. BSA-gehalte in het supernatant werd geanalyseerd met een UV-Vis spectrofotometer bij 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japan) met behulp van de Bradford protein assay volgens de instructies van de fabrikant. het siRNA-gehalte in het supernatans werd geanalyseerd met een UV-Vis spectrofotometer bij 260 nm. De monsters werden bereid en gemeten in drievoud. De BSA / siRNA entrapment efficiency (EE) werd berekend met behulp van de volgende vergelijking:

2,7. Stabiliteit van CS NPs

vers bereide CS NPs (gemaakt van 0,05% en 0,1% m / v DS-en CS-oplossing, resp.) werden gecentrifugeerd bij 12 500 rpm gedurende 15 minuten voorafgaand aan de opslag. Na ultracentrifugatie werden de verkregen pellets geresuspendeerd in gedestilleerd water (ph 6,6 gemeten) of PBS pH 7,4. De deeltjesgrootte en de lading van het oppervlak werden gemeten bij vooraf bepaalde bewaartijd (0, 1, 2, 3, 5, 8, en 14 dagen), en bij omgevingstemperatuur of 4°C.

2,8. In Vitro Geneesmiddelvrijgavestudie

de afgifte van BSA/siRNA werd bepaald aan de hand van CS NPs met de hoogste EE (DS : CS ratio 1 : 1, EE = 98% ± 0,2 en resp.). BSA / siRNA geladen CS NPs werden gesuspendeerd in Tris-HCl bufferoplossing (pH 7,4, 4 mL) en geplaatst op een magnetische roerder met een roersnelheid van 100 rpm bij 37°C (MS MP8 Wise roer Wertheim, Duitsland) gedurende 48 uur bij 37°C. Op vooraf bepaalde tijdsintervallen (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, vervolgens werd het supernatans gedecanteerd en vervangen door een equivalent volume verse bufferoplossing. De hoeveelheid vrijgekomen BSA / siRNA in het supernatant werd geanalyseerd met een UV-Vis spectrofotometer (U. V-1601; Shimadzu, Japan) bij een golflengte van respectievelijk 280 en 260 nm.

2.9. BSA-integriteit

de integriteit van BSA dat vrijkomt uit CS NPs werd bepaald door SDS-PAGE (12% oplossend en 10% stapelend gel) met behulp van het Mini-Eiwitsysteem (Bio-Rad, USA). BSA monsters werden gemengd met laemmli monsterbuffer in 1: 1 verhouding en verwarmd bij 95°C gedurende 5 min. Monsters (15 µL) werden geladen in de putten en de gel werd uitgevoerd met behulp van een mini-Eiwitsysteem Tetra-cel bij een constante spanning van 150 V gedurende 90 minuten met een lopende buffer met 25 mM Tris, 192 mM glycine, en 0,1% SDS bij pH 8,3. De monsterbanden werden gedurende 40 minuten gekleurd met 0,1% coomassie blauwe oplossing die 40% azijnzuur en 10% methanol bevatte, gevolgd door een nachtkleur met een oplossing van 40% azijnzuur en 10% methanol.

2.10. Statistische analyse

alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyse (ANOVA test en Tukey ‘ s posthoc analyse) werd uitgevoerd met behulp van het statistische pakket voor het sociale (SPSS) programma Versie 15. Een waarde < 0,05 vertoonde een significant verschil tussen het gemiddelde van de geteste groepen.

3. Resultaten

3.1. Deeltjesgrootte en oppervlaktelading

figuur 1 (a) toont de resultaten van elektrische mobiliteit () tegen wachttijden. Uit de grafiek kon worden opgemerkt dat het bleef plateau en constant na 30 min. Dit toont aan dat de vorming van stabiele elektrische dubbele laag (e.d.l.) niet onmiddellijk was, maar enkele momenten vereiste. De effecten tussen CS-concentratie en DS-uiteindelijke concentraties op de grootte van CS-NPs worden weergegeven in Figuur 1(b). Opgemerkt werd dat de meeste CS NPs met een grootte van minder dan 500 nm werden verkregen bij een lage CS-concentratie (0,1% w/v). DS-concentratie beïnvloedde ook de grootte van nanoparticles (). Een stijgende tendens in deeltjesgrootte kon worden waargenomen met het verhogen van de DS-concentratie van 0,05 tot 0,25% w/V In het algemeen, DS-concentratie van 0.05% w / v (lage concentratie) produceert nanodeeltjes met een deeltjesgrootte van minder dan 500 nm. Daarentegen werden grote nanodeeltjes (>1000 nm) verkregen wanneer de concentratie van beide polymeren werd verhoogd tot 0,25% of meer. Op basis van de resultaten werden DS-concentraties van 0,05 tot 0,20% g/v geselecteerd voor de volgende studies. Bovendien leidde een toename van de gewichtsverhouding DS : CS (hogere dichtheid van negatieve ladingen van dS aanwezig in het systeem) tot een toename van de deeltjesgrootte, maar een afname van de deeltjesoppervlaktelading (Tabel 1 (hierboven)). Aangezien het CS-gewicht de massa van DS overschreed, werd een positieve waarde van + 56,2 ± 1,5 mV verkregen. Nochtans, verminderde de lading van het deeltjesoppervlak tot − mV toen meer negatief geladen DS werd toegevoegd. De gewichtsverhouding DS : CS nam voortdurend af tot 2,5: 1. Dit werd verwacht om aan een overmaat van dS molecules toe te schrijven te zijn die op de oppervlakte van nanoparticles worden geaccumuleerd.

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 1

Elektroforetische mobiliteit als functie van de tijd (a) en het effect van de uiteindelijke concentraties van CS en DS op de deeltjesgrootte van nanodeeltjes (b), .

Tabel 1 (hieronder) laat zien dat DS 0,2% w/v de grootste deeltjesgrootte had na geladen te zijn met BSA. De deeltjesgrootte was nm. Deeltjesgrootte voor DS bij een concentratie van 0,1 en 0.15% w / v was ook groter dan de lege (). Anderzijds, werden de hogere positieve waarden van oppervlaktelast waargenomen voor bsa geladen nanoparticles in vergelijking met lege degenen. Dit werd waargenomen voor alle DS-concentraties. Bovendien kunnen hogere EE-waarden worden bereikt door de gewichtsverhouding DS : CS boven 0,5 : 1 te verhogen. De EE van nanoparticles bij DS: CS gewichtsverhouding van 1: 1, 1.5 : 1, en 2: 1 was%,%, en%, respectievelijk. De hoogste EE werd verkregen bij een gewichtsverhouding DS : CS 1: 1 (Tabel 1 (hieronder)).

Tabel 2 laat zien dat DS 0.2% w / v bezat de grootste deeltjesgrootte (900 ± 60 nm) na geladen te zijn met siRNA. siRNA geladen CS NPs bij verschillende DS concentraties (0,05, 0,1, 0,15, en 0,2% w/v) toonde kleinere deeltjesgrootte. De EE van nanoparticles bij DS: CS gewichtsverhouding van 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, en 2: 1 was respectievelijk%,%, % en%.

3.2. Morfologie

de beelden van de CS NPs werden verkregen door TEM (Figuur 2). Figuur 2 (A) en 2(b) laten zien dat onbelaste CS NPs een bolvormige structuur vertoonde. De beelden toonden aan dat nanodeeltjes gegenereerd uit siRNA(figuren 2(e) en 2 (f)) een onregelmatige morfologie vertoonden; echter, BSA geladen nanodeeltjes vertoonden verlengde morfologieën(figuren 2(c) en 2 (d)).

(een)

b)

c)

d)

e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figuur 2

TEM beelden van CS NPs. (A) en (b) ongeladen CS NPs bij 0,5: 1 en 1: 1, (c) en (d) BSA geladen CS NPS bij 0,5: 1 en 1 : 1, en (e) en (f) siRNA geladen CS NPs op 0.5 : 1 en 1 : 1, respectievelijk. Alle beelden werden genomen met 60 kX vergroting.

3.3. Opslagstabiliteit van CS NPs

beide nanodeeltjes gemaakt van 0,05 en 0,10% w/v DS werden in de loop van de tijd groter, zoals weergegeven in Figuur 3(a) bij opslag bij omgevingstemperatuur. Een significante toename van de deeltjesgrootte werd waargenomen na dag 14 van opslag, met name voor 0,05% g/v DS. Dit zou te wijten zijn aan de vorming van aggregaten. Deze bevinding werd bevestigd door de resultaten van de oppervlakte-lading, die een afname van de oppervlakte-lading tot bijna neutraal toonde. In tegenstelling, toen zij bij 4°C werden opgeslagen, bleven hun deeltjesgrootte en oppervlaktelast onveranderd tot 14 dagen voor nanoparticles die van 0.10% w/v DS worden gemaakt. Een lichte verandering werd waargenomen voor 0,05% w / v DS(figuren 4(A) en 4 (b)). Anderzijds, toen deze nanoparticles in PBS pH 7.4 werden opgeschort, werden alle formuleringen aan grotere grootte van meer dan 1 µm met PDI waarden meer dan 0.5 samengevoegd. Hun deeltjes oppervlakte ladingen waren ook bijna neutraal, variërend van +0.2 tot + 2,5 mV.

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 3

(a) afmetingen van de Deeltjes, en (b) de oppervlakte lading van CS NPs voorbereid op 0,05 en 0,01% w/v DS oplossing en bewaard bij 25°C. Nanodeeltjes werden zweven in gedistilleerd water (pH-waarde in het bereik van 6-7), .

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 4

(a) afmetingen van de Deeltjes, en (b) de oppervlakte lading van CS NPs voorbereid op 0,05 en 0,10% w/v en bewaard bij 4°C. Nanodeeltjes werden zweven in gedistilleerd water (pH-waarde in het bereik van 6-7), .

3.4. BSA in Vitro Release and Integrity

Figuur 5 (a) illustreert dat de release van BSA in twee fasen kan worden onderverdeeld op basis van de release rate. In de eerste fase, werd het BSA snel vrijgegeven van de CS NPs en toonde een burst release in de eerste 6 h. dit resulteerde in een 45% ± 5 cumulatieve release van BSA. In de tweede fase werd BSA langzaam vrijgegeven van 6 uur tot 48 uur, wat resulteerde in een cumulatieve BSA-afgifte van meer dan 60%. De integriteit van BSA dat vrijkomt uit CS NPS werd beoordeeld door SDS-PAGE en wordt weergegeven door Figuur 5(b). De waargenomen banden bevestigden dat het BSA dat na dag 1 en dag 2 de laad-en losprocessen bij 37°C had doorstaan, niet verschilde van die van vers bereide BSA-normen. Daarom kon worden geconcludeerd dat BSA in zijn oorspronkelijke vorm in de CS NPs bleef onder de experimentele omstandigheden.

(een)

b)

(a)
b)

Figuur 5

(a) De release profiel van BSA geladen CS NPs op DS : CS verhouding van 1 : 1 bij een pH van 7.4, . b) analyse van SDS-pagina ‘ s van uit CS NPs vrijkomende BSA: m) SDS-PAGE standards (BIO-RAD); a) BSA-standaard 1 mg/mL; B) BSA-standaard 0,2 mg/mL; C) blanco; D) onbelaste CS NPs; E) en F) BSA-vrijkomende BSA uit CS NPs (DS : CS-ratio van 1 : 1) op dag 1 en 2.

3.5. in Vitro afgifte van siRNA

Figuur 6 illustreert dat de afgifte van siRNA in twee fasen kan worden onderverdeeld op basis van de afgifte. In de eerste fase, de siRNA werd snel vrijgegeven van de CS NPs en toonde een burst release in de eerste 6 uur. Dit resulteerde in een 58% ± 5 cumulatieve afgifte van siRNA. In de tweede fase werd siRNA langzaam vrijgegeven van 6 uur tot 48 uur, wat resulteerde in een cumulatieve BSA-afgifte van meer dan 85%.

Figuur 6

het release profiel van siRNA geladen CS NPs bij DS : CS Verhouding van 1: 1 bij pH 7,4, .

4. Discussies

de methode die in deze studie wordt gebruikt om CS-NPs te produceren is een mild proces en maakt het mogelijk de deeltjesgrootte te regelen door bepaalde parameters te variëren, bijvoorbeeld concentratie van toegevoegde zouten, viscositeit, hoeveelheid niet-oplosbaar en Molecuulgewicht van polymeer. Deze studie werd gestart met het onderzoek naar het verkrijgen van informatie over de elektrische toestand van ioniseerbare groepen van CS NPs door het bepalen van de stabilisatietijd van e.d.l. Deze stap is belangrijk om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De verkregen gegevens suggereren dat de vorming van stabiele e.d.l. tijdens nanoparticles vereiste de voorbereiding enkele ogenblikken na het stoppen van het bewegen. Deze momenten waren nodig om de elektrolyten naar de kern van de deeltjes te laten doordringen. Er was dus een wachttijd van 40 minuten nodig voordat CS NPs nauwkeurig kon worden gemeten. Deze bevinding was vergelijkbaar met de CS-Tripolyfosfaat (CS-TPP) NPs die dezelfde wachttijd suggereerde .

er werd ook een studie uitgevoerd om de invloed van de polymeerconcentratie op de vorming van deeltjes te bepalen. De studie was gericht op het vestigen van de waaier van polyelectrolytes concentratie om nanoparticles met de gewenste grootte te produceren. Om de gevolgen van de variërende concentraties van CS en DS op de vorming van nanoparticles te bestuderen, werden CS en DS oplossing van 0.1, 0.25, en 0.5% w/v voorbereid. Variabele volumes van dS-oplossing (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, en 10 mL) werden gemengd met 5 mL van elke CS–concentratie (0,1-0,5% g/v). De uiteindelijke concentratie van CS en DS werd berekend, en de grootte van de monsters werden gecategoriseerd als 100-500, 501-1000, of meer dan 1000 nm. Het bleek dat de deeltjesgrootte werd beïnvloed door de DS-concentratie. Deze bevinding werd bevestigd door de resultaten van CS-TPP NPs . In het algemeen, de gewenste grootte van nanoparticles beperkt tussen 100 en 1000 nm. Nochtans, hebben de vorige studies aangetoond dat geladen nanoparticles normaal een grotere grootte dan lege zouden veroorzaken. De grootte van onder 500 nm is daarom gunstig.

bovendien bleek uit de resultaten dat alleen DS-concentratie van 0,05% m/v nanodeeltjes met een deeltjesgrootte van minder dan 500 nm kon produceren, zoals weergegeven in Tabel 1. De verwachting was dat toen beide polymeren in lage concentraties waren, de toevoeging van DS aan de CS resulteerde in kleine coacervaatkernen. In tegenstelling tot dat, hadden grote coacervaten die groter waren dan 1000 nm de neiging zich te vormen wanneer de concentratie van beide polymeren steeg tot 0,25% of meer. Het vermogen van Chitosan om spontaan coacervaat te vormen is toe te schrijven aan de interactie van tegenovergesteld geladen polyelektrolyten om een polyelektrolytencomplex met verminderde oplosbaarheid te vormen. Het mengsel van hoge concentratie van DS met CS zal daarom eerder de verstrengeling van de CS-ketens en de oplosbaarheid van het resulterende complex beïnvloeden. Hierdoor wordt een hoge mate van complexatie en coacervaat geproduceerd . De verminderde viscositeit bij een lagere concentratie CS resulteerde ook in een betere oplosbaarheid. Dit stond voor een efficiëntere interactie tussen kationic CS en tegenovergesteld geladen ionen toe, en zo werd een kleinere deeltjesgrootte geproduceerd . Bovendien, een toename en overmaat in de molaire massa van het gebruikte polyanion resulteerde in grotere deeltjes omdat sterk geneutraliseerde complexen werden gevormd en ze de neiging om te flocculeren . In deze studie, was de lading van het deeltjesoppervlak van het nanoparticulate systeem afhankelijk van de gewichtsverhouding van DS en CS. De lading van het deeltjesoppervlak bleek te worden verhoogd aangezien de verhouding verminderde. Deze verhouding zou in het verkrijgen van de gewenste De ladingsdichtheid van de deeltjesoppervlakte nuttig kunnen zijn om adhesie en vervoereigenschappen van nanoparticles te vergemakkelijken.

in dit onderzoek werd de opname van BSA in CS NPs bereikt door eenvoudig de zure CS-oplossing met opgeloste BSA-moleculen te mengen met de DS-oplossing bij kamertemperatuur zonder toevoeging van stabilisator. BSA wordt vaak gebruikt als modelproteïne omdat het het algemene kenmerk van andere eiwitten omarmt en biocompatibel is voor mensen. Er werd vastgesteld dat CS NPs relatief groter waren na het laden met BSA. De deeltjesgrootte werd verwacht om toen BSA met succes in nanoparticles werd geladen te verhogen. Deze trend kan mogelijk te wijten zijn aan het molecuulgewicht en de grootte van de toegevoegde BSA-moleculen. Deze grote deeltjesgrootte kan hun gebruik in levering van proteã ne beperken. Nanoparticles van 150-300 nm worden hoofdzakelijk in de lever en de milt gevonden . Bovendien, volgens sommige rapporten, is de “ideale” groottevereiste voor nanodeeltjes die voor kankerbehandeling worden ontwikkeld tussen 70 en 200 nm . Hoewel nanoparticles niet groter dan 150 nm zou moeten zijn om de endothelial barrière te kruisen, rapporteert de literatuur altijd de penetratie van deeltjes groter dan de grenzen van fenestraties. Fenestratie en vasculatuur kunnen inderdaad onder verschillende pathologische omstandigheden modificatie ondergaan .

tumorgroei zal bijvoorbeeld de ontwikkeling van neovasculatuur veroorzaken die wordt gekarakteriseerd door discontinu endotheel met grote fenestraties van 200-780 nm . Bovendien, werd opgemerkt dat de lading van de deeltjesoppervlakte van geladen nanoparticle BSA hoger was dan de lege degenen. Dit kan te wijten zijn aan de kationische karakteristiek van BSA wanneer aanwezig in zure toestand. De positieve ladingen van CS en BSA molecules hebben daarom tot een hogere waarde van de lading van de deeltjesoppervlakte voor geladen nanoparticles bijgedragen.

positief geladen kationische polymeren kunnen zich effectief binden aan en beschermen tegen nucleïnezuren zoals DNA, oligonucleotiden en siRNA . In deze studie werd de integratie van siRNA in CS NPs bereikt door eenvoudig de zure CS-oplossing te mengen met de DS-oplossing die siRNA bij kamertemperatuur bevat. Men vond dat de deeltjesgrootte van CS NPs relatief kleiner in grootte was na het laden met siRNA. De kleinere die grootte van CS NPs met siRNA wordt geladen zou aan neutralisatie van negatieve ladingen van nucleic zuur door kationic polymeer kunnen zijn resulterend in gecondenseerde kleiner formaat nanoparticles. De siRNA geladen CS NPS toonde ook een hoger zeta potentieel dan blanco CS NPS, volgens dezelfde trend als die van BSA geladen CS NPS.

idealiter zou een succesvol toedieningssysteem een hoge mate van associatieve drugs moeten hebben. De met siRNA geladen CS NPs vertoonde een hogere entrapment-efficiëntie (<90%) voor alle gewichtsverhoudingen DS : CS. De bekneldingsefficiëntie van nanoparticles bij DS: CS gewichtsverhouding van 1: 1, 1,5 : 1, en 2: 1 was hoger dan de gewichtsverhouding van 0,5 : 1. Dit fenomeen was hoogstwaarschijnlijk toe te schrijven aan hoger aandeel van DS dat in nanoparticles wordt voorgesteld. Aangezien meer DS toegevoegd, zou het meer BSA vergemakkelijken om in nanoparticles worden gevangen. Dit kan worden verklaard door het feit dat BSA een zwitterionisch molecuul is. Bij de pH van het formuleringsmedium van 3,5-4,0 kan de oplosbaarheid van BSA sterk worden verhoogd door de verhoogde positieve ladingen die het bevat . Aldus, zou BSA elektrostatisch kunnen vastmaken en stabiel in nanoparticles Laden. In zure oplossing, kon BSA positieve lading bezitten en concurreren met CS om elektrostatisch met DS in wisselwerking te staan. Deze bevinding werd bevestigd door de verhoogde positieve oppervlaktelasten van BSA geladen CS NPS in vergelijking met ongeladen. Bovendien zijn er multi-Ionische plaatsen op BSA, en deze eigenschap zou de integratie van BSA in nanoparticles kunnen vergemakkelijken. Deze bevinding verschilt van de bevinding met CS-TPP NPs .

In de studie was de elektrostatische interactie aanwezig tussen BSA en CS, in plaats van BSA en TPP. Men stelde ook voor dat BSA in een oplossing met pH hoger dan zijn iso-elektrisch punt zou moeten oplossen opdat BSA negatieve lading bezit en met positief geladen CS molecules in wisselwerking staat. Dit vinden toonde daarom aan dat de elektrostatische interactie de belangrijkste bijdragende factor is om de integratie van BSA in nanoparticles of via CS-eiwitinteractie of DS-eiwitinteractie te bevorderen.

TEM maakt visualisatie op nanoschaal van individuele nanodeeltjes mogelijk en levert informatie over zowel grootte als morfologie. De deeltjesmorfologie is een belangrijke factor voor de colloïdale en chemische stabiliteit evenals de bioactiviteit van nanoparticles. siRNA geladen CS NPs toonde onregelmatige morfologie; echter, BSA geladen CS NPS toonde verlengde morfologie. Dit kan te wijten zijn aan een grotere omvang van BSA, die kan verstrengelen of als een schild kan fungeren voor CS, waardoor de totale blootstelling van CS binnen de structuur wordt beperkt.

Stabiliteitsprofiel van CS NPs bij opslag is ook belangrijk. Deze informatie zou een mening over de stabiliteit van nanoparticles onder verschillende media en temperatuur kunnen verstrekken. De stabiliteit van nanoparticles werd onderzocht door hun variatie in gemiddelde deeltjesgrootte en oppervlaktelast in tijd te beoordelen. Aanvankelijk, werden nanoparticles geresuspendeerd in gedistilleerd water bij pH 6.6 dat door 0.2 µm filter werd gefilterd om mogelijke verontreinigende stoffen huidig in water te verwijderen. Voor deze studie, werden slechts nanoparticles gemaakt van 0,05 en 0,10% w/v van DS getest. Andere DS-concentraties werden niet bepaald vanwege een grotere deeltjesgrootte na centrifugering. De deeltjesgrootte was tot nm en nm voor respectievelijk 0,15% en 0,20% w/v DS. De toename van deeltjesgrootte kan toe te schrijven aan CS NPs zelf eroderen en verliezen hun sferische vorm in een waterig milieu, en bijgevolg de gemiddelde diameter van deeltje zou stijgen als reactie op deze erosie . Bovendien, de lasten van de deeltjesoppervlakte voor de nanoparticles die van beide concentraties worden gemaakt namen in de tijd af. Er werd vermoed dat CS kan worden afgebroken in waterige media, hoewel in afwezigheid van lysozymes. De resultaten toonden aan dat CS NPs stabieler waren bij opslag bij 4°C omdat hun deeltjesgrootte en oppervlaktelading tot 14 dagen onveranderd of licht gewijzigd waren. De resultaten suggereerden ook dat CS NPs niet bij omgevingstemperatuur zou moeten worden opgeslagen aangezien zij aan degradatie gevoelig zijn. De resultaten suggereerden daarom dat CS NPs die bij kamertemperatuur worden opgeslagen vatbaarder zijn voor degradatie dan die die in koele omgeving worden opgeslagen. Het was waarschijnlijk toe te schrijven aan het koele milieu dat de kinetische beweging van nanoparticles kan vertragen. Aldus, konden nanoparticles hun sferische vorm handhaven en zou de erosie minder waarschijnlijk voorkomen. Bovendien werd waargenomen dat deze nanoparticles in PBS bij pH 7,4 werden samengevoegd. Dit kan aan lagere lading van de deeltjesoppervlakte van nanoparticles in PBS, dichtbij neutraal toeschrijven. De deeltjesoppervlaktelading die tot nul is gedaald, kan erop wijzen dat CS NPs ladingsonderbreking door fosfaatgroepen van PBS had ondergaan. De neutrale geladen status van deze nanoparticles kan het verliezen van intra – en intermoleculaire krachten veroorzaken, belangrijk om nanoparticles individueel te handhaven. Dientengevolge, kunnen deze uncharged nanoparticles beginnen om het colloïdale systeem samen te voegen en te destabiliseren. In tegenstelling tot PBS, kan het gedistilleerde water talrijke waterstofionen verstrekken om waterstofbanden te vormen die in het breken van aggregatie van nanoparticles kunnen helpen door met ioniseerbare groepen van CS NPs in wisselwerking te staan.

het in vitro release-onderzoek van BSA en siRNA van CS NPs werd uitgevoerd in Tris-HCL-buffer. De release van BSA en siRNA kan worden onderverdeeld in twee fasen op basis van de release rate. In de eerste fase werd het medicijn snel vrijgegeven van CS NPs. De vrijgave van BSA en siRNA in dit stadium zou de verspreiding van BSA/siRNA kunnen impliceren die aan het deeltjesoppervlak wordt gebonden. In de tweede fase kwam BSA/siRNA langzaam vrij door zwelling of afbraak van het polymeer. De resterende BSA / siRNA in CS NPs zou niet volledig worden vrijgegeven totdat de deeltjes volledig werden geërodeerd of opgelost in release medium. Dit kan te wijten zijn aan de interactie tussen de resterende BSA/siRNA en vrije aminogroep op de CS-segmenten . Bovendien verzekerde het gesynthetiseerde systeem dat eerder als het kunnen onder milde voorwaarden worden beschreven kan worden geformuleerd dat de stabiliteit van de proteã nen die in CS NPs worden geladen intact was zoals bepaald door SDS-PAGE.

5. Conclusies

samenvattend toont deze studie aan dat zowel de CS-en DS-concentratie als de pH de parameters waren die de deeltjesgrootte en de oppervlakte-lading van CS-NPs bepaalden. Nanodeeltjes minder dan 500 nm kunnen worden verkregen bij DS: CS gewichtsverhouding van 0,5: 1 bij pH 4. In het geval van BSA entrapment, nanoparticles met hogere DS : CS gewichtsverhoudingen hebben hogere entrapment efficiency van meer dan 88% bezeten. Het hoogste percentage van de bekneldingsefficiëntie bereikt was 0,10% w / v DS (DS : CS ratio van 1: 1). Echter, CS NPs geladen met siRNA vertoonde een hoge entrapment efficiency (>90%) voor alle DS : CS ratio ‘ s. De opslagtemperatuur en het opschortende medium bleken de factoren te zijn die de stabiliteit van CS NPs konden beà nvloeden. CS NPs waren labiel en hebben de neiging om te destabiliseren bij omgevingstemperatuur, maar houden dit labiele gedrag wanneer koele omgeving (2-4°C) werd verstrekt. Bovendien had CS NPs een betere stabiliteit in gedestilleerd water dan in PBS, wat te wijten zou kunnen zijn aan waterstofbindingen die gevormd werden tussen watermoleculen en ioniseerbare groepen van CS NPs.

belangenverstrengeling

de auteurs verklaren dat er geen persoonlijke of financiële belangenverstrengeling is in het huidige onderzoek.

erkenning

de auteurs erkennen dankbaar De “Dana Lonjakan Penerbitan” van Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) voor de financiering en ondersteuning van het huidige onderzoeksproject.