Frontiers in Genetics

the alkaline comet assay (single cell Gel electroforesis) is the most widely used method for measurement DNA damage in eukariotic cells (Neri et al., 2015). Wykrywa pęknięcia nici (SBS) i miejsca labilne alkaliami z częstotliwością od kilkuset do kilku tysięcy przerw na komórkę-biologicznie użyteczny zakres, rozciągający się od niskich poziomów uszkodzeń endogennych do zakresu uszkodzeń, które mogą być zadane doświadczalnie bez zabijania komórek. Trawienie nukleoidów, po lizie, z pewnymi endonukleazami naprawczymi specyficznymi dla zmian, umożliwia pomiar uszkodzeń innych niż SBS; w szczególności, formamidopirymidynowa glikozylaza DNA (FPG) była szeroko stosowana do wykrywania zmienionych puryn, które są przekształcane w przerwy przez enzym. Ostatnio, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) opracował dwuwymiarowy test komet Dwuogonowych (TT-comet), który potrafi odróżnić jednoniciowe (SSBs) od dwuniciowych pęknięć DNA (dsbs) w tych samych kometach w plemnikach.

od pierwszego raportu Ostlinga i Johansona (1984) test komet był szeroko stosowany w badaniach genotoksyczności chemikaliów, zarówno w modelach in vitro, jak i In vivo. Zaletą tego ostatniego jest to, że komórki z różnych tkanek mogą być badane w wielu różnych organizmach eukariotycznych. W ciągu ostatnich 15 lat test komet był szeroko stosowany w Drosophila melanogaster do badania genotoksyczności substancji chemicznych (Gaivão and Sierra, 2014). Takie podejście jest bardzo przydatne, ponieważ Drosophila melanogaster jest cennym modelem dla wszystkich rodzajów procesów związanych ze zdrowiem człowieka, w tym odpowiedzi na uszkodzenia DNA.

wykorzystanie roślin, a także szerokiego zakresu gatunków lądowych i wodnych w teście komet znacznie wzrosło w ostatniej dekadzie (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), w szczególności w ocenie ryzyka środowiskowego (ERA). Niedawne badanie walidacyjne wykazało, że test komet in vitro w połączeniu z FPG może być skuteczną uzupełniającą linią dowodów w ERA nawet w szczególnie trudnych scenariuszach naturalnych, takich jak środowiska estuariów (Costa et al., 2014).

W ciągu ostatniej dekady produkcja i wykorzystanie materiałów o rozmiarach nano znacznie wzrosły, a w konsekwencji ekspozycja ludzi na tego typu materiały. Identyfikacja i zrozumienie zagrożeń nanomateriałów (NMs) w odniesieniu do zdrowia ludzkiego nie jest prostą sprawą. Nie tylko skład chemiczny NMs jest odpowiedzialny za ich Genotoksyczność, ale także kształt, powierzchnia właściwa, rozmiar, rozkład wielkości i potencjał zeta determinują wpływ tych materiałów na Genom. Chociaż nadal trwa debata na temat przydatności standardowych testów genotoksyczności do badania skutków NMs, do tej pory najczęściej stosowaną metodą w nanogenotoksykologii, dzięki swojej solidności, wszechstronności i niezawodności, był test komety (Azqueta i Dusińska, 2015). Oprócz badania genotoksyczności promieniowania i różnych substancji chemicznych, test komet roślinnych został ostatnio również wykorzystany do badania genotoksycznego wpływu NPs(Santos et al., 2015).

dalsze zastosowanie testu komet jest cennym narzędziem eksperymentalnym do biomonitorowania człowieka, jak również w badaniach klinicznych. Zbieranie krwi lub tkanek nie zawsze jest możliwe u wszystkich ludzi, a inne źródła komórek, które mogą być zbierane nieinwazyjnie, zostały przetestowane za pomocą testu comet; na przykład różne typy komórek nabłonkowych (Rojas et al., 2014), a także spermy (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

równolegle z rozwojem testu komety do pomiaru uszkodzeń DNA, opracowano testy naprawy DNA—istotnego elementu w genotoksycznej odpowiedzi komórkowej—. Najprostszym podejściem do pomiaru naprawy DNA jest leczenie komórek środkiem uszkadzającym DNA, a następnie inkubacja ich w celu umożliwienia naprawy, mierząc ilość uszkodzeń pozostałych w odstępach czasu. Alternatywne, biochemiczne podejście do oceny zdolności naprawczych zostało opisane w 1994 roku (Collins et al., 1994) i od tego czasu opublikowano różne zmodyfikowane wersje testu do pomiaru zarówno naprawy wycięć zasadowych (BER), jak i naprawy wycięć nukleotydowych (Ner) (recenzowane przez Azqueta et al., 2014). To biochemiczne podejście zostało zastosowane do badania wpływu środowiska, odżywiania, stylu życia i zawodu na zdolność naprawy DNA, oprócz badań klinicznych (Azqueta et al., 2014).

to alternatywne podejście in vitro do naprawy DNA ocenia aktywność naprawczą ekstraktu komórkowego na podłożu DNA zawierającym określone zmiany. Test komet jest używany do śledzenia nagromadzenia przerw DNA (półproduktów naprawczych) z czasem inkubacji. Niedawno Slyskova i współpracownicy byli pierwszymi, którzy z powodzeniem zastosowali testy naprawy DNA in vitro dla BER i NER na próbkach tkanek ludzkich; w szczególności biopsje raka jelita grubego (Slyskova i wsp ., 2012, 2014).

niedawno przyjęto inny rodzaj testu naprawy DNA, pozwalający komórkom osadzonym w żelu na naprawę przed Lizą, aby dokładniej zbadać kinetykę naprawy DNA; w szczególności, aby zbadać regulację białek BER przez modyfikacje Post-transkrypcyjne (Nickson and Parsons, 2014). Jeszcze innym sposobem badania naprawy DNA, na poziomie specyficznych genów, jest technika Comet-FISH, która wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane sondy DNA, które hybrydyzują z jednoniciowym DNA w ogonie komety. McAllister et al. (2014) zastosował tę metodę do badania preferencyjnej naprawy przerwania nici w masowym DNA, a także w wybranych regionach z aktywnie transkrybowanymi genami.

badanie kinetyki naprawy wywołanych uszkodzeń pomoże w naszym zrozumieniu odpowiedzi komórkowych na genotoksyczne chemikalia. Co więcej, Znaczenie naprawy DNA jako gracza w procesie (anty)rakotwórczym można wyjaśnić, patrząc na naprawę na poziomie określonych tkanek docelowych raka. Regulacja naprawy-i innych aspektów odpowiedzi komórkowej na związki genotoksyczne-prawdopodobnie obejmie mechanizmy epigenetyczne, a test comet został pomyślnie przyjęty do pomiaru zmian w globalnym schemacie metylacji DNA w poszczególnych komórkach w różnych warunkach wzrostu(Lewies et al., 2014).

% DNA ogona jest zalecane jako najlepszy opis dla częstotliwości przerwania DNA, ponieważ komety, o których mowa-i zakres uszkodzeń-można łatwo zobrazować. Jednak wielu badaczy nadal preferuje użycie momentu ogonowego(Møller et al., 2014). W rzeczywistości oba deskryptory mają podobny wpływ na warunki testu (Azqueta et al., 2011; Ersson i Möller, 2011).

zmienność w teście komet jest ważną kwestią, niezależnie od tego, czy wynika z zastosowania różnych protokołów, czy też z niekontrolowanej lub przypadkowej zmienności eksperymentalnej. Zaleca się włączenie wzorców referencyjnych we wszystkich eksperymentach, zwłaszcza gdy duża liczba próbek—na przykład z badania biomonitoringowego—jest analizowana przy różnych okazjach. Wzorcami odniesienia są komórki o znanej ilości uszkodzeń DNA; nieleczone komórki (Kontrola negatywna), komórki narażone na promieniowanie rentgenowskie (kontrola pozytywna) lub komórki poddane działaniu fotouczulacza plus światło (kontrola pozytywna w testach obejmujących inkubację FPG), przygotowywane w partiach i mrożone jako podliczniki. Jeśli znaczna zmienność występuje w normach w serii eksperymentów, wyniki próbki mogą być znormalizowane (Collins et al., 2014). W przypadku wymiany wzorców między laboratoriami wyniki tych laboratoriów można łatwiej porównać.

wzorcowe komórki są zwykle ustawiane w żelach równolegle do żeli próbnych. Standardy wewnętrzne-tj., standardowe komórki w tym samym żelu, co komórki próbki-byłoby idealne; ale to jest oczywiście niezbędne, aby być w stanie odróżnić dwa rodzaje komórek. Komórki rybne, które są większe lub mniejsze w rozmiarze genomu w porównaniu do komórek ludzkich, zostały pomyślnie przyjęte w tym celu (Brunborg et al., 2015). Te komórki referencyjne mogą być stosowane w połączeniu z krzywą wzorcową lub kalibracyjną (ustaloną z komórkami otrzymującymi różne dawki promieniowania jonizującego), umożliwiając bardziej precyzyjne oznaczanie zmian DNA wyrażonych jako częstotliwość przerwania DNA, a nie % dna ogonowego.

Statystyki są ważnym narzędziem we wszystkich zastosowaniach testu komet, aby sprawdzić, czy małe różnice występują przypadkowo. Opublikowano zwięzłe opisy analizy statystycznej i zalecenia dotyczące testów (Lovell et al., 1999; Lovell and Omori, 2008). Møller and Loft (2014) przypominają, że aby analiza statystyczna testu komet była prosta, przy planowaniu eksperymentów należy dokładnie rozważyć odpowiedni projekt badania i moc statystyczną.

podobnie jak w przypadku wszystkich testów biologicznych, integracja danych ma kluczowe znaczenie dla interpretacji wyników testu komet w szerszym ujęciu. Integracja informacji dostarczonych przez test comet z innymi wskaźnikami uszkodzenia DNA i odpowiedziami komórkowymi (np. stres oksydacyjny, podział komórek lub śmierć komórek) została zastosowana zarówno w ERA (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015), jak również badania nad człowiekiem (biomonitoring) (np. Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Również w tym” omics ” dane pomogą w rozwikłaniu sposobu działania związków genotoksycznych (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – choć warto zauważyć, że kilka badań wykazało, że fenotypowe miary naprawy DNA niekoniecznie korelują z danymi genomicznymi lub transkryptomicznymi (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); różne podejścia należy uznać za komplementarne.

nawet po trzech dekadach rozwoju i modyfikacji, test comet jest nadal dość prostym, wszechstronnym, ale pracochłonnym testem. Różne modyfikacje testu o wysokiej przepustowości zostały niedawno poddane przeglądowi (Brunborg et al., 2014). Zarówno aplikacje in vivo, jak i in vitro zyskałyby ogromną przewagę dzięki dalszej poprawie wydajności, standaryzacji protokołu i przepustowości. Automatyzacja i miniaturyzacja są powszechnymi strategiami w wielu dziedzinach biologii, umożliwiając zmiany rzędu wielkości w liczbie próbek analizowanych na eksperyment, zmniejszając subiektywne nastawienie i zwiększając odtwarzalność.

więc-na co możemy liczyć w ciągu najbliższych 30 lat? Akceptacja testu komet in vitro do badań genotoksyczności, niedrogi automatyczny scoring komet, aby uratować naukowców przed niekończącym się oglądaniem mikroskopu, standaryzacja protokołu (być może) i wiarygodne wewnętrzne Standardy referencyjne, więcej badań biomonitoringu ludzkiego naprawy DNA (przyjmując, że testy fenotypowe mają ważne miejsce obok genomiki i transkryptomiki), monitorowanie środowiska przy użyciu różnych gatunków zwierząt i roślin; i wiele innych nieprzewidywalnych zmian i zastosowań.

Oświadczenie o konflikcie interesów

autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek relacji handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

podziękowania

chcielibyśmy podziękować wszystkim autorom, a także recenzentom i redaktorom, którzy przyczynili się do tego tematu badań Frontiers. SL jest beneficjentem stypendium podoktorskiego z Funduszu Badawczego AXA oraz nagrody Cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA dziękuje Ministerio de Economía y Competitividad (program “Ramón y Cajal”, 2013) hiszpańskiego rządu za osobiste wsparcie.