mutanty promotorowe CMV o zmniejszonej skłonności do utraty produktywności w komórkach CHO

w celu monitorowania wpływu miejsc CPG podatnych na metylację z regionu promotora wzmacniającego, proksymalnego i rdzenia, zdecydowaliśmy się zbadać nie tylko C-179, ale także cytozyny w pozycjach -508 (C-508) i -41 (C-41). Żadne z wybranych miejsc CpG nie pokrywa się ze znanymi miejscami wiążącymi czynnik transkrypcyjny u gatunków Cricetidae. Aby utrzymać ogólną zawartość GC, wykonaliśmy transwersje od C do G (rys. 1a). Oprócz C-41, C-13 jest drugą cytozyną w regionie głównego promotora, która wydaje się być często metylowana. Ponieważ mutacja C-13 do G stworzy nowe miejsce CpG, wolelibyśmy zbadać C-41G. zmutowane warianty promotorów zostały skrócone za pomocą trzyliterowego kodu, np. wariant GCC ma guaninę zamiast cytozyny w pozycji -508, podczas gdy zasady cytozyny w pozycji -179 i -41 są zachowane. CCC jest unmutated kontroli hCMV-MIE (rys. 1a). Zmutowane lub natywne promotory zostały wprowadzone do różnych plazmidów i umieszczone przed różnymi genami reporterowymi.

aby sprawdzić, czy mutacje wpływają na siłę promotora, przeprowadziliśmy dwa niezależne eksperymenty polegające na przejściowej transfekcji plazmidów reporterowych ekspresji wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej (SEAP) do komórek CHO-K1 i zbadaliśmy ekspresję SEAP pięć dni po transfekcji. Jako punkt odniesienia użyto niemutowanego promotora (rys. 1B). Ekspresja SEAPU z promotorów GGG, GCG i CGC była konsekwentnie o około 20% niższa niż z promotora niezmutowanego, z niewielkimi różnicami między eksperymentami replikacyjnymi. Ogólnie mutacje od C do G wykazywały tendencję do umiarkowanego zmniejszania siły promotora, co jednak wydawało się akceptowalne.

następnie zapytaliśmy, czy warianty promotorów hCMV-MIE wpływają na stabilność ekspresji trwale transfekowanych komórek CHO podczas długotrwałej hodowli. W tym celu wybraliśmy reportera eGFP, który umożliwia analizę cytometryczną ekspresji genów reporterowych na poziomie pojedynczych komórek. plazmidy reporterowe eGFP transfekowano do komórek CHO-K1 i wybrano trzy do czterech niezależnych pul trwale transfekowanych komórek metotreksatem (MTX). Były one uprawiane przez trzy miesiące w obecności czynnika selekcyjnego MTX. Trzydzieści cztery i osiemdziesiąt siedem dni po transfekcji oznaczono ekspresję eGFP cytometrią (dwie pule zostały utracone między 34 A 87 dniem z powodu zanieczyszczenia). Środki geometryczne intensywności fluorescencji 10 000 zdarzeń na pomiar obliczono dla każdej puli komórek i wykreślono dla obu punktów czasowych (Fig. 1c). Trzydzieści cztery dni po transfekcji nie było różnicy między konstrukcjami. Tylko jedna pula CGC wykazała podwyższony poziom ekspresji. Osiemdziesiąt siedem dni po transfekcji, dwie z czterech pul transfekowanych CGC i dwie z trzech pul transfekowanych CCG wykazywały wyraźnie wyższe wartości eGFP niż wszystkie inne pule, transfekowane za pomocą niezmutowanej kontroli lub pozostałych wariantów promotora. Obserwacje te sugerowały stabilizujący wpływ pojedynczych mutacji C-41g lub C-179g na ekspresję eGFP. Aby utrwalić ten wynik, powtórzyliśmy eksperyment zarówno z wariantami promotora, jak i z większą liczbą pul. Wygenerowaliśmy dziesięć pul z CCG lub CCC, odpowiednio i osiem pul z CGC (dwie pule zostały utracone z powodu zanieczyszczenia). Komórki hodowano jak wcześniej i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej od dnia 42 do dnia 69 po transfekcji (Fig. 1D i dodatkowe rys. S1 online). Po 42 dniach ekspresja eGFP była znacznie zwiększona w czterech pulach CCG w porównaniu z pulami kontrolnymi CCC, podczas gdy dwie pule CGC wykazały umiarkowany wzrost ekspresji eGFP (Fig. 1D, lewy panel). Po 69 dniach trzy pule CCG nadal wykazywały wysoki poziom eGFP, podczas gdy ekspresja EGFP pul CGC spadła do poziomu kontroli CCC (rys. 1D, prawy panel). Różnice między grupami były badane w każdym punkcie czasowym nieparametrycznym testem Steel-Dwass. Poziom alfa został ustawiony na 0.05. W 56. dniu po transfekcji obserwowano istotną różnicę pomiędzy CCG a CCC (p = 0,0305; patrz dodatkowe rys. S1 online). Razem wzięte, wyniki Fig. 1c, d sugeruje, że obie mutacje C-41g i C-179g mogą opóźnić utratę ekspresji rekombinowanego genu napędzanego hCMV-MIE.

mutacje C-41g i C-179g całkowicie hamują metylację DNA w odpowiednim miejscu, ponieważ guanina nie może być metylowana. Zastanawialiśmy się, czy te mutacje wpłynęły również na poziomy metylacji w innych miejscach CpG w obrębie hCMV-MIE. Dlatego mierzyliśmy poziomy metylacji wszystkich miejsc CpG w poszczególnych wariantach hCMV-MIE przez konwersję wodorosiarczynową połączoną z sekwencjonowaniem nowej generacji. W tym celu wyodrębniliśmy genomowy DNA z puli komórek drugiego eksperymentu 42 i 69 dni po transfekcji i potraktowaliśmy go wodorosiarczynem w celu rozróżnienia między metylowaną i niemetylowaną cytozyną. dna hCMV-MIE Amplifikowano i zsekwencjonowano za pomocą systemu Illumina MiSeq (Fig. 1e). C-179 najsilniej metylowano we wszystkich pulach transfekowanych CCC lub CCG, potwierdzając wcześniejsze obserwacje z niezmutowanym hCMV-MIE12. Ponadto zaobserwowaliśmy wyraźny wzór metylacji, który był bardzo podobny we wszystkich basenach, ale różnił się ogólną intensywnością. W szczególności niezmutowane C-508 I C-41 były niezmiennie jednymi z najczęściej metylowanych miejsc. Mutacja C-41 w promotorowym wariancie CCG, szczególnie mutacja C-179 w wariancie CGC, wydaje się równomiernie zmniejszać metylację wszystkich miejsc CpG zamiast zmieniać wzór metylacji. Kiedy obliczyliśmy średnie poziomy metylacji we wszystkich miejscach CpG dla każdej puli, wykryliśmy niższe całkowite metylowanie zmutowanymi wariantami promotora(patrz dodatkowe rys. S2 online). Różnica była najbardziej wyraźna w przypadku wariantu CGC, ale nie osiągnęła istotności statystycznej w teście Steel-Dwass (α = 0,05). Średnio metylacja wzrastała z czasem przy wszystkich konstrukcjach.

oprócz wyciszania promotora epigenetycznego, utrata kopii transgenu jest główną przyczyną niestabilności produkcji komórek rekombinowanych20. W celu oszacowania względnego udziału, mierzyliśmy liczby kopii plazmidu za pomocą qPCR 42 i 69 dni po transfekcji. Średnia liczba kopii plazmidów zmniejszała się w czasie, bez wyraźnej różnicy między konstrukcjami (Patrz dodatkowe rys. S2 online). Co ciekawe, rozkład numerów kopii został przesunięty w kierunku niższych wartości w grupie CGC. Jednak kiedy testowaliśmy istotność statystyczną za pomocą testu Steel-Dwass, różnice między konstrukcjami nie okazały się znaczące (α = 0,05).

Pule trwale transfekowanych komórek są wysoce niejednorodnymi mieszaninami klonów różniącymi się ekspresją transgenu i tempem wzrostu. Wysoce produktywne klony mają zwykle niższy wskaźnik wzrostu21. Dlatego komórki o niskiej produkcji, z których wiele jest obecnych w kulturze po transfekcji, prawie nieuchronnie wcześniej czy później zarastają wysokimi producentami. Aby zminimalizować to odchylenie, zbadaliśmy mutacje C – 179g i C-41g w liniach komórkowych klonalnych. Ponieważ dążyliśmy do oceny wpływu na produkcję potencjalnego produktu komercyjnego, przeszliśmy na białko fuzyjne IgG-IL2 jako reporter. Tak więc, warianty promotorów zawierające obie mutacje albo same (CGC lub CCG) albo w połączeniu (CGG) wstawiono przed łańcuchem lekkim i genem łańcucha ciężkiego plazmidu ekspresyjnego IgG-IL2.

plazmidy ekspresyjne przenoszące CCG, CGC, CGG lub niezmutowany hCMV-MIE transfekowano do komórek CHO-K1, a stabilnie transfekowane klony izolowano w płytkach 384-studzienkowych. Trzydzieści klonalnych linii komórkowych na konstrukcję wybrano losowo i rozszerzono na sześć płyt. Po tym, jak linie komórkowe wykazały stabilny wzrost, badaliśmy ich wydajność przez około dwa miesiące, od dnia 68 do dnia 134 po transfekcji. Niektóre linie komórkowe zostały utracone z powodu zanieczyszczenia lub zmniejszonej żywotności, ale przez cały okres czasu zbadano 23 do 29 klonów na konstrukcję.

podczas całego badania oznaczaliśmy stężenia IgG-IL2 w supernatantach hodowli komórkowej oraz wydajność na komórkę i dzień (wydajność właściwa qP). Na początku (dzień 68) i na końcu (dzień 134) badania linie komórkowe transfekowane CGC wykazywały znacznie wyższe miana niż transfektanty kontrolne (α = 0,05; Fig. 2A). Linie komórkowe o niezwykle wysokich mianach obserwowano również u transfektantów CGG w dniu 68 oraz u transfektantów CCG i CGG w dniu 134. Porównując specyficzne produktywności między liniami komórkowymi transfekowanymi różnymi konstrukcjami, poczyniliśmy podobne obserwacje (rys. 2b). Aby zrekompensować nieprecyzyjność w liczeniu komórek, uśredniliśmy specyficzną produktywność qP dwóch fragmentów na początku (dzień 68-71 i 83-86 po transfekcji, co odpowiada najwcześniejszym dostępnym punktom danych) i trzech fragmentów na końcu długotrwałej uprawy (dzień 124-127, dzień 127-131 i dzień 131-134 po transfekcji). Znaczące różnice między liniami komórkowymi transfekowanymi CGC lub CCC obserwowano pod koniec długotrwałej uprawy (α = 0,05).

warianty hCMV-MIE CGC i CCG stabilizują produkcję rekombinowanego białka w klonalnych liniach komórkowych CHO.

(a) miana IgG-IL2 klonów CHO 68 dni (lewy panel) i 134 dni (prawy panel) po transfekcji. B) specyficzna wydajność qP klonów CHO na początku (lewy panel) i na końcu (prawy panel) długotrwałej uprawy. Wczesne wartości qP obliczono uśredniając wartości qP dwóch wczesnych fragmentów reprezentujących dwa najwcześniejsze punkty danych (dni 68-71 i dni 83-86 po transfekcji). Późne wartości qP obliczano uśredniając trzy ostatnie przejścia (dni 124-127, dni 127-131 i dni 131-134 po transfekcji) (c) procentową zmianę specyficznej produktywności ∆qP podczas długotrwałej uprawy na podstawie danych przedstawionych w (b) z (lewym panelem) i bez (prawym panelem) jednym odstającym zidentyfikowanym w analizie scyzoryków. Uwzględniono tylko klony wytwarzające wykrywalne poziomy produktu w dniu 68. (a–c) tożsamość wariantów promotorowych i liczba (N) niezależnych pul komórek jest wskazana poniżej osi X. Górny i dolny koniec pól reprezentuje pierwszy i trzeci kwartyl każdej grupy. Końce wąsów reprezentują najniższe i najwyższe wartości jeszcze w 1,5-krotnym przedziale międzykwartylowym. Szara linia wskazuje ogólną średnią zmiennej y na wykresie. Znaczące różnice (α = 0,05)między grupami według testu Steel-Dwass są oznaczone wartościami P.

wyższe miana i specyficzna produkcja linii komórkowych przenoszących G – 179 lub g-41 sugerowały stabilizujący wpływ tych mutacji na ekspresję genów napędzanych hCMV-MIE. Aby udokumentować ten efekt, obliczyliśmy procentową zmianę qP podczas długotrwałej uprawy dla każdej linii komórkowej jako najbardziej odpowiednią miarę jej stabilności produkcji (rys. 2c). Oczywiście, było to możliwe tylko w przypadku linii komórkowych nadal wytwarzających IgG-IL2 w dniu 68 po transfekcji. Jeden kontrolny transfektant zwiększył swoją specyficzną wydajność o 500% i został zidentyfikowany jako odstający przez Analizę odstających jackknife(rys. 2C, lewa działka). Dlatego ta linia komórkowa została wyłączona z dalszej analizy (Fig. 2C, prawa działka). Linie komórkowe transfekowane CGC lub CCG były znacznie bardziej stabilne niż linie komórkowe kontrolne transfekowane CCC (α = 0,05). Co zaskakujące, podwójny zmutowany CGG nie różnił się od kontroli.