Test uwalniania chromu: stary szkolny sposób testowania cytotoksycznych komórek T
istnieje kilka metod, których możesz użyć, aby sprawdzić, czy twoje komórki T są cytotoksyczne, ale test uwalniania chromu przy użyciu radioaktywnego 51chromu (51cr) jest jednym z najstarszych. Daje dobre wyniki i jest świetny dla laboratoriów, które nie mogą sobie pozwolić lub nie mają cytometrii przepływowej łatwo dostępne.
tutaj przedstawię prostą metodę testowania funkcji zabijania komórek T przy użyciu 51Cr. Ale przed rozpoczęciem testu, należy zapoznać się z odpowiednimi środkami bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi.
wybierz cel i efektory
aby wykonać test uwalniania chromu, najpierw inkubujesz komórki docelowe (T) za pomocą 51Cr. Następnie inkubujesz komórki docelowe z komórkami efektorowymi (komórkami T; E). Jeśli komórki efektorowe zabiją cele, uwolnią 51Cr, który wykryjesz za pomocą licznika gamma.
które cele i efektory, których używasz, są całkowicie zależne od twojej aplikacji. Twoje komórki docelowe są tym, przed czym testujesz funkcję komórek T. Możesz chcieć zabić swój cel (zmierzyć cytotoksyczność) lub możesz szukać, aby sprawdzić, czy komórki T są tolerancyjne (jak testowanie wyprodukowanych komórek, zanim trafią do pacjenta dla bezpieczeństwa!). Efektorowe limfocyty T mogą również pochodzić z różnych źródeł. Na przykład można użyć wyprodukowanych linii komórek T lub komórek T świeżo wyizolowanych od zwierzęcia.
Let ‘ s Get Radioactive
po zebraniu celów i efektorów nadszedł czas na gotowanie.
- Policz swoje komórki. Możesz użyć hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Liczba potrzebnych komórek zależy od liczby warunków i liczby replikatów każdego warunku. Zazwyczaj przeprowadzam testy w trzech egzemplarzach i mam cztery współczynniki (5:1, 10:1, 20:1 i 40:1 E: T). Podziel komórki docelowe (w moim przypadku 500 000-około 25 000 na studnię) do 15 ml stożkowych rurek, zachowując każdy eksperymentalny stan osobno! Upewnij się, że zawiesisz swoje komórki w małej objętości, aby miały szansę wejść w kontakt z chromem.
- Dodaj 51Cr (około 50 µCi) i inkubuj cele z chromem przez godzinę. Przesuwaj rurki co około 20 minut, aby zwiększyć możliwości absorpcji chromu przez komórki.
- podczas inkubacji….Ta długa inkubacja to świetny czas na skonfigurowanie komórek efektorowych. Umyć komórki T dwa razy z PBS, aby usunąć nadmiar cytokin, które mogą przekrzywiać wyniki. Następnie wymieszać je w odpowiednich mediach.
- po zakończeniu mycia, jesteś gotowy, aby umieścić swoje efektory na talerzu! Zazwyczaj używam płytki 96 dobrze, ponieważ woluminy są raczej małe. Umieść efektory w różnych proporcjach do celów, aby określić próg zabijania. Zazwyczaj przeprowadzam test w triplicates, ale to zależy od tego, ile komórek masz dostępnych. Współczynniki 40, 20, 10 i 5 do 1 (efektory do celów) są dobrym szablonem, jeśli masz wystarczającą ilość dostępnych komórek.
oprócz tych badań skonfiguruj dwa warunki kontrolne:
- Kontrola spontanicznego uwalniania zawierająca tylko komórki docelowe (w zasadzie Kontrola negatywna, ponieważ nie powinno być zabijania bez efektorów) i
- Kontrola maksymalnego uwalniania, w której lizyje się komórki docelowe (kontrola pozytywna, która pokazuje maksymalną ilość chromu pobranego przez komórki).
- Wracając do tych komórek docelowych … gdy komórki docelowe zostaną inkubowane, umyj je trzy razy pożywką do hodowli komórkowej, aby usunąć nadmiar chromu. Obracaj komórki delikatnie w 400g przez 5 minut dla każdego z tych prań. Zdekantować supernatant do pojemnika na odpady, który można przenieść do bezpiecznego obszaru rozpadu, zamiast próbować go pipetować. Pomoże to zmniejszyć ewentualne zanieczyszczenia, ponieważ nie będziesz musiał radzić sobie z żadnymi wskazówkami.
- po płukaniu wymieszać komórki do 5000 komórek na 100?l. następnie dodać 100?l komórek do każdej studni, nawet spontanicznej i maksymalnej studni. Inkubować komórki razem przez minimum 4 godziny w temperaturze 37°C, dokładnie jak długo zależy od zastosowania.
- cztery godziny później….Wyjmij talerz z inkubatora. Dodać 100?l 1% roztworu triton-x do komórek w maksimum studzienek w celu lizy komórek i uwolnienia całego chromu.
- obróć płytkę w dół przy 1250 obr. / min przez dziesięć minut, aby granulować komórki.
- przenieść supernatant z każdej studzienki do studzienki płyty chłonnej (np. płyty Luma), uważając, aby nie dotknąć osadu na dnie studzienki.
- pozostaw talerz do wyschnięcia na noc. Rano włóż go do czytnika płyt i uzyskaj wyniki.
wyniki, które widzisz, zależą od Twojego konkretnego zastosowania
obliczanie wyników testu uwalniania chromu
gdy masz odczyty, musisz wykonać proste obliczenia, aby określić cytotoksyczność komórek.
po pierwsze, uśredniaj swoje triplikaty dla każdego warunku. Następnie weź te średnie i podłącz je do tego wzoru:
(uwalnianie chromu w stanie zainteresowania – uwalnianie chromu w szybach spontanicznych)/ (maksymalne uwalnianie chromu – uwalnianie chromu w szybach spontanicznych)
pomnóż wartość przez 100, aby uzyskać procentową lizę.
