CMV promotor de mutantes com uma reduzida propensão à perda de produtividade em células CHO
para monitorar os efeitos de metilação propensas a CpG sites do enhancer, a proximal e a principal região promotora, optamos por investigar não só o C-179, mas também o anti-inflamatórias em posições -508 (C-508) e -41 (C-41). Nenhum dos sítios de CpG seleccionados se sobrepõe a sítios de ligação do factor de transcrição conhecidos em espécies de Cricetidae. A fim de manter o conteúdo geral GC, realizamos transversões C A G (Fig. 1a). Além de C-41, C-13 é a segunda citosina na região do promotor principal que parece ser frequentemente metilada. Uma vez que a mutação de C-13 para G criaria um novo local de CpG, preferimos investigar o C-41G. as variantes do promotor mutante foram abreviadas com um código de três letras, por exemplo, a variante GCC tem guanina em vez de citosina na posição -508, enquanto as bases da citosina em -179 e -41 são preservadas. CCC é o HCM-MIE de controlo não modificado (Fig. 1a). Promotores mutantes ou nativos foram introduzidos em vários plasmídeos e colocados a montante de diferentes genes de repórter.
a fim de verificar se as mutações afectam a resistência do promotor, realizámos duas experiências independentes transferindo transitoriamente plasmídeos repórter que expressam fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) em células CHO-K1 e examinámos a expressão de SEAP cinco dias após a transfecção. O promotor não modificado foi utilizado como referência (Fig. 1b). A expressão do SEAP dos promotores da GGG, GCG e CGC foi consistentemente cerca de 20% inferior à do promotor não modificado, com pequenas variações entre os experimentos replicados. Em geral, as mutações C A G revelaram uma tendência para uma ligeira redução da força Promotora que, no entanto, pareceu ser aceitável.Em seguida, perguntámos se as variantes do promotor HCM-MIE influenciam a estabilidade de expressão das células-CHO permanentemente transfectadas durante o cultivo a longo prazo. Para este propósito, escolhemos um repórter eGFP que permite a análise citométrica da expressão do gene repórter no nível de uma única célula. os plasmídeos repórter do eGFP foram transfectados em células CHO-K1 e três a quatro grupos independentes de células permanentemente transfectadas foram seleccionados com metotrexato (MTX). Estes foram cultivados por mais de três meses na presença do agente de seleção MTX. Trinta e quatro e oitenta e sete dias após a transfecção, a expressão eGFP foi medida por citometria (duas piscinas foram perdidas entre o dia 34 e 87 devido à contaminação). A média geométrica da intensidade de fluorescência de 10 000 eventos por medição foi calculada para cada conjunto de células e traçada para ambos os pontos temporais (Fig. 1c). Trinta e quatro dias após a transfusão, havia pouca diferença entre as construções. Apenas um conjunto de CGC mostrou níveis de expressão elevados. Oitenta e sete dias após a transfecção, dois em cada quatro piscinas transfectadas com CGC e dois em cada três piscinas transfectadas com CCG apresentaram valores eGFP distintamente mais elevados do que todos os outros piscinas, transfectadas quer com o controlo não modificado quer com as restantes variantes do promotor. Estas observações sugeriram um efeito estabilizador das mutações C-41G ou C-179G únicas na expressão do eGFP. Para consolidar este resultado, repetimos a experiência com variantes promotoras e com um maior número de piscinas. Geramos dez piscinas com CCG ou CCC, respectivamente, e oito piscinas com CGC (duas piscinas foram perdidas devido à contaminação). As células foram cultivadas como antes e analisadas por citometria de fluxo do dia 42 ao dia 69 após a transfecção(Fig. 1D e Fig. suplementar. S1 online). Após 42 dias, a expressão do eGFP aumentou fortemente em quatro piscinas CCG em comparação com as piscinas de controlo CCC, enquanto duas piscinas CGC demonstraram um aumento moderado na expressão do eGFP (Fig. 1D, painel esquerdo). Após 69 dias, três piscinas CCG ainda apresentavam altos níveis de eGFP, enquanto a expressão do EGFP das piscinas CGC havia caído para níveis de controle CCC(Fig. 1d, painel direito). As diferenças entre os grupos foram testadas em cada ponto de tempo com o teste não paramétrico Dwass de aço. O nível alfa foi fixado em 0,05. Foi observada uma diferença significativa entre a CCG e a CCC no dia 56 após a transfecção (p = 0, 0305; ver Figura suplementar. S1 online). Juntos, os resultados da Fig. 1c, d sugeriu que ambas as mutações C-41G e C-179G podem atrasar a perda da expressão genética recombinante induzida pelo HCM-MIE.
as mutações C-41G e C-179G inibem completamente a metilação do ADN no respectivo local, uma vez que a guanina não pode ser metilada. Perguntávamo-nos se estas mutações também afectaram os níveis de metilação noutros locais de CpG no HCM-MIE. Portanto, medimos os níveis de metilação de todos os locais de CpG nas variantes hCMV-MIE individuais por conversão de bissulfito, juntamente com sequenciamento de próxima geração. Para este fim, extraímos ADN genómico das poças celulares do segundo experimento 42 e 69 dias após a transfecção e tratámo-lo com bissulfito para discriminar entre citosina metilada e citosina não metilada. o ADN HCM – MIE foi amplificado e sequenciado com o sistema Illumina MiSeq(Fig. 1e). O C-179 foi mais fortemente metilado em todas as piscinas transfectadas com CCC ou CCG, confirmando observações anteriores com o hCMV-MIE12 não modificado. Além disso, observamos um padrão de metilação distinto que era muito semelhante em todas as piscinas, mas diferia em intensidade geral. Em particular, C-508 e C-41 não cortados foram consistentemente entre os locais mais frequentemente metilados. A mutação de C-41 na variante Promotora CCG, particularmente a mutação de c-179 na variante CGC, parece diminuir uniformemente a metilação de todos os locais de CpG em vez de alterar o padrão de metilação. Quando calculámos os níveis médios de metilação em todos os locais de CpG para cada pool, detectámos menor metilação global com as variantes do promotor mutado (ver Figura suplementar). S2 online). A diferença foi mais pronunciada com a variante CGC, mas não atingiu significância estatística com o teste do aço-Dwass (α = 0,05). Em média, a metilação aumentou ao longo do tempo com todas as construções.
para além do silenciamento do promotor epigenético, a perda de cópias transgénicas é uma das principais causas de instabilidade da produção em células recombinantes20. Para estimar a contribuição relativa, medimos os números de cópias plasmídicas por qPCR 42 e 69 dias após a transferência. O número médio de cópias plasmídicas diminuiu ao longo do tempo, sem diferença óbvia entre as construções (ver Figura suplementar). S2 online). Curiosamente, a distribuição de números de cópias foi deslocada para valores mais baixos no grupo CGC. No entanto, quando testamos significância estatística com o teste da camada de Aço, as diferenças entre as construções não se revelaram significativas (α = 0,05).
Pools of permanent transfected cells are highly heterogeneous mixtures of clones differing in transgene expression and growth rate. Clones altamente produtivos tendem a ter uma taxa de crescimento mais baixa21. Portanto, células de baixa produção, muitas das quais estão presentes na cultura após a transfecção, quase inevitavelmente supergrow os produtores elevados mais cedo ou mais tarde. A fim de minimizar este viés, investigamos as mutações C-179G e C-41G em linhas celulares clonais. Uma vez que visamos avaliar os efeitos na produção de um potencial produto comercial, mudamos para uma proteína de fusão IgG-IL2 como repórter. Assim, foram inseridas variantes Promotoras contendo ambas as mutações isoladamente (CGC ou CCG) ou em combinação (CGG) a montante da cadeia leve e do gene da cadeia pesada de um plasmídeo de expressão IgG-IL2.Os plasmídeos de expressão que transportavam CCG, CGC, CGG ou o HCM-MIE não modificado foram transfectados em células CHO-K1 e os clones transfectados estavelmente foram isolados em placas de 384 alvéolos. Trinta linhas de células clonais por construção foram aleatoriamente selecionadas e expandidas em placas de seis poços. Após as linhas celulares terem mostrado crescimento estável, estudamos sua produtividade por aproximadamente dois meses, do dia 68 ao dia 134 após a transfeção. Algumas linhas celulares foram perdidas devido a contaminação ou viabilidade reduzida, mas 23 a 29 clones por construção foram examinados ao longo de todo o período de tempo.Durante todo o estudo, determinámos concentrações de IgG-IL2 em sobrenadantes de culturas celulares e produtividade por célula e por dia (qP produtividade específica). No início (dia 68) e no fim (dia 134) do estudo, as linhas celulares transfectadas com CGC mostraram títulos significativamente mais elevados do que os transfectantes de controlo (α = 0, 05; Fig. 2a). Linhas celulares com títulos notavelmente altos também foram observadas entre os transfetantes CGG no dia 68 e entre os transfetantes CCG e CGG no dia 134. Quando comparamos produtividades específicas entre linhas celulares transfectadas com diferentes construções, fizemos observações semelhantes(Fig. 2b). Para compensar a imprecisão na contagem de células, nós média específicos produtividades qP de duas passagens no início (dia 68-71 e pp. 83-86 depois de transfeccao representando os primeiros pontos de dados disponíveis) e três passagens no final do longo prazo para o cultivo (dia 124-127, dia 127-131 e day131–134 após transfection). No final do cultivo a longo prazo foram observadas diferenças significativas entre as linhas celulares transfectadas com CGC ou CCC (α = 0, 05).
hCMV-MIE variantes CGC e CCG estabilizar a produção de proteína recombinante em clonal CHO linhas de células.
(a) títulos IgG-IL2 de clones CHO 68 dias (painel esquerdo) e 134 dias (painel direito) após transfecção. b) produtividade específica qP de clones de CHO no início (painel esquerdo) e no fim (painel direito) do cultivo a longo prazo. Os valores iniciais de pq foram calculados calculando os valores de PQ de duas passagens iniciais representando os dois primeiros pontos de Dados (dias 68-71 e dias 83-86 após a transferência). Final do qP valores foram calculados através da média últimos três passagens (dias 124-127, days127–131 dias 131-134 após transfection) (c) variação Percentual específico de produtividades ∆qP durante a longo prazo para o cultivo com base nos dados mostrados em (b) com (painel esquerdo) e sem (painel direito) um outlier identificados por jackknife de análise. Apenas foram considerados os clones que produziam níveis detectáveis de produto no dia 68. a-C) a identidade das variantes do promotor e o número (N) de conjuntos de células independentes são indicados abaixo do eixo dos X. As extremidades superior e inferior das Caixas representam o primeiro e o terceiro quartil de cada grupo. As extremidades dos bigodes representam os valores mais baixos e mais elevados ainda dentro do intervalo interquartil de 1,5 vezes. A linha cinzenta indica a média global da variável-y no diagrama. As diferenças significativas (α = 0,05) entre os grupos de acordo com o ensaio da camada de aço são indicadas pelos valores p.
títulos mais elevados e produtividades específicas das linhas celulares que transportam G-179 ou G-41 sugeriram um efeito estabilizador destas mutações na expressão genética induzida pelo HCM-MIE. Para documentar este efeito, calculamos a alteração percentual de qP durante o cultivo a longo prazo para cada linha celular como a medida mais apropriada de sua estabilidade de produção (Fig. 2c). Claro que isso era viável apenas com linhas celulares ainda produzindo IgG-IL2 no dia 68 após a transfeção. Um transfectante de controle aumentou sua produtividade específica em 500% e foi identificado como um outlier pela jackknife outlier analysis (Fig. 2C, Left plot). Por conseguinte, esta linha celular foi excluída de uma análise mais aprofundada (Fig. 2C, direito plot). As linhas celulares transfectadas com CGC ou CCG foram significativamente mais estáveis do que as linhas celulares de controle transfectadas com CCC (α = 0, 05). Surpreendentemente, a dupla mutante CGG não diferia do controle.
