Depleção de Macrófagos por Clodronate Contendo Lipossomas Reduz a Formação Neointimal Após o Balão de Lesão em Ratos e Coelhos

células Inflamatórias, desempenhar um importante papel no reparo vascular, recrutados imediatamente após a lesão.1, 2 infiltração Macrófaga no tecido da aterectomia e o estado de activação dos monócitos sanguíneos estão correlacionados com um aumento da taxa de restenose.3,4 os efeitos dos macrófagos na restenose provavelmente são causados por sua capacidade de expressar inúmeros fatores de crescimento, citocinas e enzimas que contribuem para o desenvolvimento da restenose.5 Assim, hipotetizamos que a inactivação sistémica dos monócitos e macrófagos pode levar à atenuação da formação neointimal e que os macrófagos desempenham um papel fundamental na patogênese da restenose.A depleção de macrófagos pode ser alcançada com a injecção sistémica de lipossomas contendo clodronato.O Clodronato pertence à família dos bifosfonatos (BPs), agentes de busca óssea que são inibidores potentes dos osteoclastos. Tal como outros BPs, o clodronato tem fraca permeabilidade à membrana celular.Os lipossomas são prontamente absorvidos pelas células do sistema reticuloendotelial, em particular os macrófagos. A administração de clodronato mediada pelos lipossomas inactiva e mata os macrófagos após a fagocitosis8 eficaz, mas não é tóxica para as células não fagocíticas.6

Métodos de

Lipossomas

Clodronate (Sifavitor) e rodamina RE (Avanti Polar Lipids) foram encapsulados em lipossomas compostos por 50 µmol/L distearoyl-phosphatidylglycerol (DSPG) (Avanti), de 100 µmol/L de colesterol (Sigma Chemicals), e 150 µmol/L 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) (Avanti) pela inversa fase técnica de evaporação, como descrito em outro lugar.O tamanho médio dos lipossomas foi de 190±18 nm, 24,5 mmol/L, e 20 mmol / l, clodronato e lípidos, respectivamente.A validação da actividade biológica cl foi determinada em 264 células brutas semelhantes aos macrófagos. LC, mas não livre clodronate reduziu significativamente o número e a proliferação de células viáveis em uma maneira dose dependente e não afetam de células de músculo liso (SMCs) ou de células endoteliais (CE) viabilidade e proliferação em concentrações de até 500 µmol/L (dados não apresentados), de acordo com os dados publicados.8,10

Coelho modelo

Coelho Branco Da Nova Zelândia (Harlan Laboratories, Jerusalém, Israel) com peso entre 2,5 e 3.5 kg foram usados de acordo com as Diretrizes para cuidados com animais da Universidade Hebraica de Jerusalém e Institutos Nacionais de saúde (EUA). Os animais receberam uma dieta aterogênica de 2% de colesterol e 6% de óleo de amendoim, começando 30 dias antes da angioplastia. Foi verificada hipercolesterolemia (colesterol plasmático >1200 mg/dL). Os animais foram anestesiados pela xilazina (7 mg/kg) e cetamina (40 mg/kg). Foram administradas heparina (200 U/kg), atropina (0, 05 mg) e nicotinato de norfloxacina (70 mg). Lesão de balão foi realizada na artéria carótida comum esquerda com um cateter de balão de angioplastia de 3 mm (Cordis, inflação de 2×1 minuto a 8 atm). Os animais foram distribuídos aleatoriamente a clodronato lipossómico intravenoso ou livre (15 mg/kg), lipossomas vazios ou tampão. Um investigador cego ao tipo de grupo experimental realizou as experiências. Após a eutanásia com pentotal, as artérias foram fixadas in situ por perfusão com 150 mL de solução de formaldeído a 4% (pH 7.4), processado para análise morfométrica, e manchado com manchas de Verhoeff elastina, Hematoxilina Mayer e eosina, e Pentacromo Movat modificado.Foram utilizados ratos machos de Sabra (laboratórios Harlan), com peso entre 350 E 420 g,

rato modelo

rato macho (laboratórios Harlan). O modelo de lesão da carótida de rato foi realizado como descrito anteriormente.11, 12 clodronato Lipossómico (15 mg/kg) foi injectado nos dias-1 e +6. Os órgãos foram colhidos no dia 14 e processados como descrito acima.

a análise morfométrica

oito a 10 secções em cada lâmina foram analisadas por meio de análise morfométrica computadorizada (imagem NIH) por um investigador cego ao tipo do grupo experimental. A seção com o maior estreitamento do luminal por neointima foi analisada como descrito anteriormente.11 o lúmen residual, a área delimitada pela lâmina elástica interna (lúmen original), e a área circunscrita pela lâmina elástica externa (área arterial total) foram medidos diretamente. O grau de espessamento neointimal foi expresso como a relação entre a área do neointima e o lúmen original (% estenose) e como a relação entre a área neointimal e a área do meio (N/M). O grau de remodelação, constrictivo (negativo) e expansivo (positivo), e razão de remodelação (RR) foi estimado comparando a razão da área arterial total do segmento lesionado por balão com a de um segmento de referência adjacente, não adulterado.

Citometria de fluxo

o sangue anticoagulante (200 µL) foi incubado durante 30 minutos (4°C, no escuro) com o rato anti-CD14 conjugado com RPE-humano (DAKO). A solução de LISAGEM FACS (diluição 1:20) foi adicionada durante 15 minutos. As células residuais foram lavadas (×1500 RPM, 5 minutos, 4 ° C) em meio FACS (PBS, 1% BSA, 0,02% azida de sódio) e suspensas em meio FACS de 1 mL para Citometria de fluxo. Os monócitos foram identificados de acordo com seu tamanho relativo, dispersão lateral e fluorescência.

distribuição de lipossomas

os coelhos foram injectados com lipossomas marcados com rodamina (0, 4 mg/kg) e CL ou tampão no dia-1 e eutanasiados nos dias +1 e +6. Os monócitos sanguíneos foram separados com o uso de um gradiente Ficoll (Sigma) e centrifugação (×1500 RPM, 5 minutos). Os tecidos colhidos foram enxaguados em solução salina; as secções foram montadas em lâminas e observadas por microscopia confocal (Zeiss LSM 410).

imunohistoquímica

os espécimes explanados foram excisados após uma breve perfusão salina e imediatamente congelados no composto OCT para criosseccionamento (Ted Pella, Inc). As lâminas foram desparafinizadas, incubadas com 1% de H2O2 em metanol (10 minutos) para bloquear a peroxidase endógena e, em seguida, com 10% de PBS no soro do cavalo durante (20 minutos). Os anticorpos primários para o coelho RAM-11 (DAKO) ou PCNA (PC10, DAKO) foram aplicados durante 1 hora a 37 ° C. As secções foram então lavadas com PBS, seguidas por anticorpos secundários biotinilados (IgG anti-rato cavalo, Laboratório Vector) e um complexo de avidin-biotina-peroxidase (ABC Elite kit, Laboratório Vector) durante 30 minutos cada. O desenvolvimento da cor foi alcançado por uma exposição de 5 minutos ao tetracloridrato de 3,3 ‘ – diaminobenzidina (substrato de peroxidase DAB, Sigma Chemical Co) na presença de substrato de peroxidase (Sigma). Os diapositivos foram ligeiramente contrastados com a Hematoxilina No. 3 (Sigma). A coloração positiva foi avaliada ao microscópio (Olimpo, BX40) a 2×/0,25 10×/0.25 molduras de vídeo ampliadas e digitalizadas. A prevalência de macrófagos foi avaliada como a percentagem média de área ocupada por células com manchas positivas em 5 a 6 campos de alta potência.Nestes estudos foram utilizados grupos separados de animais. As artérias e fígados foram homogeneizados em tampão colagenase e extraído IL-1β foi medido utilizando kits ELISA comerciais (sistemas R&D).

para a análise da reacção em cadeia da polimerase em transcrição reversa (RT-PCR), o ARN das artérias carótidas foi extraído com o uso de um kit de isolamento de ARN (Life Technologies). A qualidade, o tamanho e a quantidade de RNA foram examinados, e os valores das bandas foram normalizados para a expressão de mRNA β-actin.13

actividade da metaloproteinase-2 da matriz

o sobrenadante das artérias homogeneizado em tampão colagenase foi analisado para a actividade da colagenase. As amostras foram separadas em gelatina impregnada (1 mg/mL).: Difco) SPS 8% géis de poliacrilamida em condições não redutoras, agitado 30 minutos em 2,5% Triton X-100 (BDH), incubado em tampão de colagenase (16 horas, 37°C), e manchado com 0,5% de Coomassie g 250 (BioRad) em metanol/ácido acético/H2O (30:10:60). A intensidade da banda foi determinada por densitometria computadorizada (Dinâmica Molecular tipo 300A).

as Estatísticas

os dados são expressos em média±DP. Comparações de achados histológicos entre o grupo de controle e tratamento foram feitas pelo teste t do aluno não emparelhado. Foram feitas comparações dos monócitos e citoquinas sanguíneas ao longo do tempo com a análise de ANOVA de 2 vias. As diferenças foram denominadas estatisticamente significativas em P <0, 05.

resultados

prevenção da hiperplasia pós -angioplastia

proliferação maciça de SMCs e formação de matriz extracelular foi observada em animais de controlo após lesão de balão (Figura 1, A e b). Não foram encontradas diferenças significativas entre o tratamento com lipossomas vazios, solução salina ou clodronato livre em solução (resultados agrupados como controlos). A razão N / M foi de 1, 4±0, 44 (figura 1e), e a estenose luminal foi de 75±8%. A CL (15 mg/kg, dias-1 e +6) reduziu a razão N/M para 0,66±0, 2 (Figura 1, c, d E E) e a estenose luminal para 41±8%. Ocorreu remodelação ligeira expansiva em ambos os controlos (RR=1. 22±0, 24) e animais tratados com CL (RR=1, 29±0, 25). A área medial, morfologia óssea e composição mineral não foram afectadas pelo tratamento com CL (dados não apresentados). Não foram observadas infecções evidentes nem efeitos secundários sistémicos detectáveis.

para determinar o efeito da depleção de macrófagos num modelo animal não hiperfolesterolémico (sem células de espuma), foi utilizado o modelo de lesão da carótida de rato.A neointima marcada foi suprimida pelo tratamento com CL, sem alteração significativa na área arterial medial e total (tabela).

Mecanismo de Ação

Redução de Sangue Monócitos e Macrófagos do Tecido

linha de Base monócitos nível foi de 2,8±0,5% dos glóbulos brancos (WBC). Antes da cirurgia, 24 horas após a injecção de CL, os monócitos foram drasticamente reduzidos para <0,2% do total de leucócitos (Figura 2, a e b), enquanto o número de leucócitos permaneceu inalterado. Três dias após a cirurgia, o sangue monócitos foram levemente aumentado 3,5±0,4% no controle de animais e de 0,7±0,7% em LC animais tratados, retornando aos níveis basais após 6 dias (Figura 2c).

os macrófagos do fígado e do baço foram reduzidos em CL (coloração RAM 11) 6 dias após a lesão (Figura 3). O positivamente área manchada no fígado foi reduzido significativamente a partir de 21,5±4% para 14,7±2.9% e no baço de 33,3±1.5% para 11,4±3% no controle e LC-tratados coelhos, respectivamente. Do mesmo modo, observou-se uma diminuição da coloração arterial RAM-11 para macrófagos em coelhos tratados com CL 3 e 6 dias após lesão (Figura 4).

a redução dos monócitos e macrófagos foi também detectada por injecção de lipossomas fluorescentes (FL). Observou-se uma redução acentuada do sinal fluorescente nos monócitos sanguíneos (bem como uma redução do número) e no fígado e baço de animais tratados com CL (Figura 5). FL foram detectados em lesões, mas não em artérias intactas. A co-administração com LC reduziu significativamente o sinal fluorescente na parede arterial ferida (Figura 5).

PCNA, IL-1β, e a Matriz de Metaloproteinase-2

área corados positivamente para PCNA em 6 dias após a lesão foi significativamente reduzida de 5,6±2,6% em animais de controle para 1,7±1,3%, em LC tratados coelhos (Figura 6 a e b). Neointima mal foi observado neste ponto inicial em que a proliferação de SMC é máxima.

Análise de IL-1β níveis arteriais de tecido após a lesão revelou um padrão convexo atingindo o máximo de 6 dias após a lesão e retornando aos níveis basais após 30 dias (Figura 7a), e uma diminuição significativa de IL-1β níveis foi observado após 3 e 6 dias de LC-animais tratados. Nos animais de controlo, a transcrição do mRNA IL-1β foi mais forte no dia 3 do que a expressão mais fraca 1 dia após a lesão, mas ambos foram significativamente reduzidos pelo tratamento com CL (figura 7b). Os níveis IL-1β no fígado também foram reduzidos após uma única injecção de CL no dia-1, inclinando-se para níveis basais a 30 dias (Dados Não apresentados).

a actividade da metaloproteinase da matriz Arterial (MMP-2) aumentou após lesão, apresentando um padrão em forma de sino que atinge um máximo de 6 dias (292±46) e regressa aos níveis basais a 14 dias (figura 7c). A CL aliviou significativamente a actividade do MMP – 2, e no dia 6 era apenas 52±17.

discussão

este estudo mostra, pela primeira vez, que a inactivação dos macrófagos pela administração sistémica de clodronato encapsulado de lipossomas inibe a perda de luminal após lesão no balão no rato e no coelho hipercolesterolémico. Estes resultados validam a nossa hipótese de que os macrófagos desempenham um papel fundamental na patogênese das arteriopatias aceleradas. O aumento observado na área do luminal foi obtido principalmente através da redução da hiperplasia neointimal. Foi também demonstrado um ligeiro aumento na remodelação expansiva, mas a sua contribuição para a diferença na área luminal foi mínima.

o Clodronato pertence à família de BPs, fármacos utilizados clinicamente em doenças ósseas incluindo osteoporose. Sendo altamente hidrofílico e carregado negativamente, BPs livres são quase incapazes de atravessar membranas celulares.7 a captação de BP por osteoclastos resistentes aos ossos (provenientes de macrófagos de monócitos sanguíneos) ocorre quando as células engolem osso revestido com fármacos.Nem o clodronato livre, nem a CL inibiram o SMC, nem a proliferação CE ou a formação neointimal. A endocitose eficaz e selectiva do clodronato nos macrófagos é obtida através do encapsulamento do clodronato nos lipossomas.9, 10, 14 após fagocitose, a ação lisossómica perturba as camadas gordas do lipossoma e o clodronato livre é liberado para a célula, causando danos funcionais irreversíveis e apoptose.A administração de 8,15

CL provavelmente abortou a resposta de fase inicial à lesão, a qual é mediada pela migração de macrófagos em resposta à expressão MCP-1.Injecção de CL antes da lesão monócito sanguíneo (Figura 2) e número de macrófagos e actividade no fígado, baço e parede arterial ferida (Figuras 3, 4 e 5). A redução dos monócitos disponíveis no momento da lesão reduziu a hiperplasia intima, talvez semelhante aos efeitos observados com a desactivação dos monócitos sanguíneos pela IL-10.17, bloqueando a migração de monócitos/macrófagos para o vaso ferido a partir do lúmen e/ou adventícia (Figura 5), impediu os efeitos destas células na migração e proliferação de SMC.Os níveis de

IL-1β e MMP-2 foram reduzidos nos segmentos arteriais feridos após o tratamento com CL. Estes principais produtos de macrófagos ativados, secretados após lesão arterial, contribuem para o processo de proliferação neointimal.No entanto, uma vez que a CL não afecta os SMC e os ECs e não tem qualquer efeito sobre os fibroblastos 9,o macrófago é provavelmente o principal objectivo para a CL. A inibição da hiperplasia intima no modelo de rato, sem células de espuma na artéria, suporta ainda a depleção sistémica de macrófagos, uma vez que o mecanismo impulsionador reduziu a proliferação de SMC e a formação neointimal. Em conjunto, este efeito imunomodulatório e anti-inflamatório Sistémico transitório reduziu a migração e proliferação de CMS e a restenose arterial.

nossos achados são concomitantes com os efeitos benéficos observados após modulação da função macrófago por várias modalidades. A formação reduzida de neointima após lesão foi atingida em coelhos através do bloqueio do Mac-122 e em ratinhos com deficiência de Mac-1.23 Assim, de acordo com relatórios recentes, 9, 17, 22, 23 o processo inflamatório desempenha um papel fundamental na cascata da formação neointima. A depleção de macrófagos também reduz a hiperplasia dos enxertos venosos.24 Não obstante a diferente patologia em termos de gatilho, vaso afetado, a placa subjacente na artéria angioplástica, a composição do tecido estenótico, e a duração do processo, o efeito positivo no modelo do enxerto venoso sugere um papel comum dos macrófagos na estimulação da hiperplasia vascular íntima.

implicações e limitações

o clodronato livre não permeia as células e tem uma semi-vida curta na circulação sistémica.O Clodronato que vaza de macrófagos e lipossomas mortos não se acumula de forma significativa em tecidos que não o osso. Não se observou qualquer efeito no crescimento somático ou no conteúdo mineral sérico após o tratamento com CL, uma vez que o resultado da formulação lipossómica, tal como com a maioria dos outros lipossomas e sistemas de administração de partículas do fármaco, foi no sistema reticuloendotelial. Além disso, duas injecções de clodronato livre de 15 mg/kg não devem ter qualquer efeito no osso normal.A inactivação de macrófagos acarreta o perigo de imunossupressão e infecção. No entanto,tal como nos estudos sobre a mice26 e ratos com deficiência em Mac-1, não foi observada qualquer infecção evidente no nosso estudo com depleção transitória de macrófagos. Os monócitos sanguíneos totalmente recuperados neste estudo 6 dias após a injecção e as concentrações de IL-1β voltaram aos níveis basais. Outros demonstraram que a recuperação da função macrófaga 4 a 6 dias após a depleção induzida pela CL não induz efeitos tóxicos a longo prazo.As implicações clínicas da depleção transitória e parcial dos macrófagos hepáticos e esplénicos com CL sistémica devem ser examinadas em ensaios com seres humanos.

um grande número de notificações de tentativas farmacológicas para inibir a hiperplasia intimal em animais não se traduziu numa inibição subsequente da restenose no ser humano. O estudo atual usa a CL como uma ferramenta investigativa para elucidar o papel da inflamação na reparação vascular e o possível valor de modular a imunidade inata na redução da hiperplasia intimal pós-juríria. Que o benefício foi observado em dois modelos animais, o rato e o hypercholesterolemic coelho, com diferentes lesões e diferentes graus de inflamação, suporta o importante papel dos monócitos e macrófagos vascular reparação e aumenta o valor preditivo para a inibição de reestenose em seres humanos.As áreas ricas em macrófagos são prevalentes em lesões ateroscleróticas de doentes com angina instável e enfarte agudo do miocárdio,3 e os macrófagos provavelmente mediam a ruptura da placa aterosclerótica e o início súbito de síndromes coronárias agudas.São necessários mais estudos para examinar se a depleção macrófaga por bifosfonatos lipossómicos pode conferir uma estratégia para estabilizar outras Vasculopatias e cardiomiopatias mediadas por inflamações, incluindo síndromes coronárias agudas.

em conclusão, a administração de CL inibiu a proliferação neointimal após lesão por balão no rato e nos modelos de coelho hipercolesterolémico. O mecanismo sugerido é a modulação sistémica selectiva e transitória da actividade monocitária/macrófaga. Os macrófagos, embora relativamente escassos no tecido neointimal, desempenham um papel importante no processo de proliferação neointimal. Portanto, a modulação precoce e a inactivação dos macrófagos durante 1 semana após a lesão diminuem significativamente o estreitamento arterial pós -angioplastia posteriormente.

notas de Rodapé