Ensaio de libertação de crómio: a forma antiga de testar células T citotóxicas

existem vários métodos que pode utilizar para verificar se as suas células T são citotóxicas, mas um ensaio de libertação de crómio utilizando radioactiva 51chrómio (51Cr) é um dos mais antigos. Ele dá bons resultados, e é ótimo para laboratórios que não podem pagar ou não têm citometria de fluxo prontamente disponível.

aqui, vou esboçar um método simples para testar a função de matar células T usando 51Cr. Mas antes de iniciar o seu ensaio, não se esqueça de ler sobre as medidas de segurança adequadas ao manusear materiais radioactivos.Escolha o seu alvo e os seus efectores

para fazer um ensaio de libertação de crómio, primeiro incubar as suas células-alvo (T) com 51Cr. Em seguida, incuba as células-alvo com células efectoras (as suas células T; E). Se as células efectoras matarem os alvos, vão libertar o 51Cr, que detectará com um contador gama.

que alvos e efetores você usa é inteiramente dependente de sua aplicação. As células alvo são o que está a testar a função da célula T. Você pode querer matar o seu alvo (medir a citotoxicidade) ou você pode estar olhando para ver se as células T são tolerantes (como testar células fabricadas antes que eles vão para um paciente para a segurança!). Suas células T efetoras também podem ser derivadas de diferentes fontes. Por exemplo, você pode usar linhas de células T fabricadas ou células T recém-isoladas de um animal.Uma vez que você tenha reunido seus alvos e efetores, é hora de começar a cozinhar.

1. conte as suas células. Pode usar um hemocitómetro ou um contador automático de células. O número de células que você precisa depende do número de condições e de quantas réplicas de cada condição você faz. Normalmente, faço os meus testes em triplicado e tenho quatro rácios.(5:1, 10:1, 20:1 e 40:1 E: T). Aliquot suas células alvo (no meu caso 500.000 – cerca de 25.000 por poço) em tubos cónicos de 15ml, mantendo cada condição experimental separada! Assegure-se que suspende as suas células num pequeno volume para que tenham a oportunidade de entrar em contacto com o crómio.

1. adicionar o 51Cr (cerca de 50 µCi) e incubar seus alvos com o crómio por uma hora. Mova os tubos a cada 20 minutos para aumentar as oportunidades para as células absorverem o crómio.

1. enquanto estás a incubar … Esta incubação longa é um grande momento para configurar suas células efetoras. Lavar as células T duas vezes com PBS para remover o excesso de citoquinas que podem distorcer os seus resultados. Em seguida, ressuspendê-los nos meios apropriados.

1. depois de ter terminado as lavagens, você está pronto para colocar seus efetores na placa! Normalmente uso uma placa de 96 poços, uma vez que os volumes são bastante pequenos. Coloque os efetores em diferentes proporções em relação aos alvos para determinar o limiar de occisão. Eu normalmente faço o teste em triplicados, mas depende de quantas células você tem disponível. 40, 20, 10 e 5 para 1 rácios (efetores para alvos) são um bom modelo se você tiver células disponíveis suficientes.

além destes ensaios, estabelecer duas condições de controlo:

• espontâneo de controle de liberação contendo apenas células-alvo (basicamente um controle negativo, porque não deve haver matar sem os processadores de efeitos) e
• um máximo controle de liberação em que você lisar as células-alvo (um controlo positivo, que mostra a quantidade máxima de um cromo tomado pelas células).

1. de volta às células-alvo…assim que as células-alvo terminarem de incubar, lave-as três vezes com meio de cultura celular para remover o excesso de crómio. Rodar suavemente as células a 400 g durante 5 minutos para cada uma destas lavagens. Decantar o sobrenadante num recipiente de resíduos que possa ser transferido para uma zona de decaimento segura em vez de tentar pipetá-lo. Isso ajudará a reduzir a possível contaminação, uma vez que você não terá que lidar com quaisquer dicas.

1. depois da lavagem, ressuspender as células para 5000 células por 100?1. então adicione 100?l de células para cada poço, até os poços espontâneos e máximos. Incubar as células juntas durante um mínimo de 4 horas a 37 ° C, exatamente quanto tempo depende da sua aplicação.

1. quatro horas depois … Tira o prato da incubadora. Adicionar 100?l de uma solução triton-x de 1% para as suas células nos poços máximos para lirar as células e libertar todo o crómio.

1. rodar a placa para baixo às 1250 rpm durante 10 minutos para apalpar as células.

1. transferir o sobrenadante de cada poço para o poço de uma placa absorvente (por exemplo, placas de Luma), tendo o cuidado de não tocar no sedimento no fundo do poço.

1. deixe o prato secar durante a noite. De manhã, coloque – o no leitor de pratos e obtenha os seus resultados.

os resultados que vê dependerão da sua aplicação específica

calculando os resultados do seu ensaio de Libertação de crómio

uma vez que tenha as leituras, terá de efectuar um cálculo simples para determinar a citotoxicidade das suas células.

em primeiro lugar, a média dos seus triplicados para cada condição. Então pega nessas médias e liga-as a esta fórmula.:

(libertação de crómio para condições de interesse – libertação de crómio em poços espontâneos)/ (libertação máxima de crómio – libertação de crómio em poços espontâneos)

multiplique o valor por 100 para obter a sua percentagem de lise.