Frontiers in Genetics

the alkaline comet assay (single cell gel electroforese) is the most widely used method for measuring DNA damage in eukaryotic cells (Neri et al., 2015). Detecta intervalos de cadeia (Strand breaks-SBs) e locais alkali—labile a frequências de algumas centenas a vários milhares de intervalos por célula-uma gama biologicamente útil, estendendo-se desde baixos níveis de danos endógenos até à Extensão de danos que podem ser infligidos experimentalmente sem matar células. A digestão dos nucleóides, após a lise, com determinadas endonucleases de reparação específicas da lesão, permite a medição de danos diferentes da SBs; notavelmente, a formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG) tem sido amplamente utilizada para detectar purinas alteradas, que são convertidas em quebras pela enzima. Recentemente, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) desenvolveu um ensaio bidimensional de cometas bidimensionais (TT-comet) que pode diferenciar entre o SSB (single-stranded SSB) e o DSB (double-stranded DNA breaks) nos mesmos cometas em esperma.

desde o primeiro relatório de Ostling e Johanson (1984), o ensaio comet tem sido amplamente utilizado em ensaios de genotoxicidade de produtos químicos, tanto em modelos in vitro como in vivo. Uma vantagem com este último é que as células de vários tecidos podem ser estudadas, em uma grande variedade de organismos eucarióticos. Nos últimos 15 anos, o ensaio comet tem sido amplamente utilizado em Drosophila melanogaster para testar a genotoxicidade de produtos químicos (Gaivão e Sierra, 2014). Esta abordagem é muito útil, uma vez que Drosophila melanogaster é um modelo valioso para todos os tipos de processos relacionados com a saúde humana, incluindo respostas aos danos ao DNA.

a utilização de plantas, bem como uma vasta gama de espécies terrestres e aquáticas no ensaio comet, aumentou drasticamente na última década (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), particularmente na avaliação dos riscos ambientais (EEI). Um estudo recente de validação indicou que o ensaio comet in vitro combinado com FPG pode ser uma linha de evidência complementar eficaz na ERA, mesmo em cenários naturais particularmente desafiadores, como ambientes estuários (Costa et al., 2014).

durante a última década, a produção e utilização de materiais nano-dimensionados aumentou significativamente e, consequentemente, a exposição humana a estes tipos de materiais. Identificar e compreender os perigos dos nanomateriais (Smn) em relação à saúde humana não é uma questão simples. Não só a composição química dos NMs é responsável pela sua genotoxicidade, como também a forma, área de superfície específica, Tamanho, distribuição de tamanho e potencial zeta determinam os efeitos destes materiais no genoma. Embora ainda haja um debate sobre a adequação dos testes de genotoxicidade padrão para o estudo dos efeitos do NMs, até agora o método mais utilizado em nanogenotoxicologia, graças à sua robustez, versatilidade e confiabilidade, tem sido o ensaio comet (Azqueta e Dusinska, 2015). Além de investigar a genotoxicidade da radiação e de vários produtos químicos, o ensaio plant comet também foi recentemente utilizado para estudar o impacto genotóxico do NPs (Santos et al., 2015).

a further application of the comet assay is as a valuable experimental tool for human biomonitoring as well as in clinical studies. A coleta de sangue ou tecidos nem sempre é viável em todos os indivíduos humanos, e outras fontes de células que podem ser coletadas de forma não invasiva foram testadas com o ensaio comet; por exemplo, vários tipos de células epiteliais (Rojas et al., 2014), bem como esperma (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

em paralelo com o desenvolvimento do ensaio comet para a medição de danos ao ADN, foram desenvolvidos ensaios para a reparação do ADN—um elemento essencial na resposta genotóxica celular. A abordagem mais simples para a medição de reparo de DNA é tratar as células com um agente prejudicial ao DNA e, em seguida, incubá-las para permitir a reparação para prosseguir, medindo a quantidade de dano restante em intervalos. Uma abordagem bioquímica alternativa para avaliar a capacidade de reparação foi descrita em 1994 (Collins et al., 1994), and since then various modified versions of the assay to measure both base excision repair (BER) and nucleotide excision repair (NER) have been published (reviewed by Azqueta et al., 2014). Esta abordagem bioquímica tem sido aplicada para estudar os efeitos do ambiente, nutrição, estilo de vida e ocupação na capacidade de reparação do DNA, além de Investigações clínicas (Azqueta et al., 2014).

esta abordagem alternativa in vitro à reparação do ADN avalia a actividade de reparação de um extracto celular num substrato de ADN contendo lesões definidas. O ensaio comet é usado para acompanhar a acumulação de quebras de DNA (intermediários de reparo) com o tempo de incubação. Recentemente, Slyskova e colegas foram os primeiros a aplicar os ensaios in vitro de reparação de ADN para RCE e RNE com sucesso em amostras de tecido humano; especificamente, biópsias do carcinoma colorectal (Slyskova et al., 2012, 2014).

foi recentemente adoptado um ensaio diferente de reparação do ADN, permitindo a reparação das células incorporadas no gel antes da lise, para estudar mais pormenorizadamente a cinética de reparação do ADN. ; especificamente, para estudar a regulação das proteínas BER por modificações pós-transcritionais (Nickson e Parsons, 2014). Outra maneira de estudar a reparação de DNA, ao nível de genes específicos, é com a técnica de cometas-peixes, que faz uso de sondas de DNA fluorescentes marcadas que irão hibridizar com o DNA de cadeia única na cauda do cometa. McAllister et al. (2014) used this method to study preferential strand break repair in bulk DNA as well as in selected regions with actively transcribed genes.

estudar a cinética da reparação dos danos induzidos ajudará a compreender as respostas celulares a produtos químicos genotóxicos. Além disso, a importância da reparação do ADN como agente no processo (anti)carcinogénico pode ser esclarecida através da análise da reparação ao nível de tecidos-alvo específicos para o cancro. A regulação da reparação—e de outros aspectos da resposta celular aos compostos genotóxicos—é susceptível de envolver mecanismos epigenéticos e o ensaio comet foi adoptado com êxito para medir as alterações no padrão global de metilação do ADN em células individuais em várias condições de crescimento (Lewies et al., 2014).

por cento do ADN da cauda é recomendado como o melhor descritor para as frequências de ruptura do ADN, uma vez que os cometas referidos—e extensão dos danos—podem ser facilmente visualizados. No entanto, muitos pesquisadores ainda preferem o uso do momento da cauda (Møller et al., 2014). De facto, os dois descritores são igualmente influenciados pelas condições do doseamento (Azqueta et al., 2011; Ersson e Möller, 2011).

a variabilidade no ensaio comet é uma questão importante, quer se deva ao uso de diferentes protocolos, quer a variações experimentais incontroláveis ou aleatórias. Recomenda—se a inclusão de normas de referência em todas as experiências, especialmente quando um grande número de amostras—de um ensaio de biomonitorização, por exemplo-são analisadas em diferentes ocasiões. Os padrões de referência são células com uma quantidade conhecida de danos ao ADN.; células não tratadas (controlo negativo), células expostas a raios-X (controlo positivo) ou células tratadas com fotossensibilizador mais luz (controlo positivo para os ensaios, incluindo a incubação FPG), preparadas em lote e congeladas como alíquotas. Se uma variação substancial ocorre nos padrões em uma série de experimentos, os resultados da amostra podem ser normalizados (Collins et al., 2014). Se forem trocadas normas de referência entre laboratórios, os resultados desses laboratórios podem ser mais facilmente comparados.

as células-padrão de referência são normalmente fixadas em géis em paralelo com a amostra de géis. Padrões internos-i.e., células padrão no mesmo gel que as células de amostra-seria ideal; mas é, naturalmente, essencial para ser capaz de distinguir os dois tipos de células. As células de peixes que são maiores ou menores em tamanho do genoma em comparação com as células humanas foram adotadas com sucesso para este fim (Brunborg et al., 2015). Estas células de referência podem ser utilizadas em combinação com uma curva padrão ou de calibração (estabelecida com células às quais foram administradas doses diferentes de radiação ionizante), permitindo uma quantificação mais precisa das lesões do ADN expressas como uma frequência de ruptura do ADN em vez de % de ADN da cauda.

as Estatísticas são uma ferramenta importante em todas as aplicações do ensaio comet, para verificar se pequenas diferenças ocorrem por acaso. Foram publicadas descrições concisas da análise estatística e recomendações para testes (Lovell et al., 1999; Lovell and Omori, 2008). Møller and Loft (2014) remind us that to keep the comet assay statistical analysis simple, appropriate study design and statistical power should be carefully considered when planning experiments.

como em todos os ensaios biológicos, a integração de dados é crucial para interpretar os resultados do ensaio comet dentro do quadro geral. A integração da informação fornecida pelo ensaio comet com outros indicadores de danos ao ADN e respostas celulares (por exemplo, stress oxidativo, divisão celular ou morte celular) foi aplicada tanto na ERA (Costa et al., 2014; Santos et al.= = Ligações externas = = * , 2010; Slyskova et al., 2012). Também a inclusão de dados” omics ” ajudará a desvendar o modo de ação dos compostos genotóxicos (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015)—embora valha a pena ressaltar que vários estudos têm mostrado que as medidas fenotípicas de reparo de DNA não necessariamente correlacionam-se com dados genômicos ou transcriptômicos (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); as diferentes abordagens devem ser consideradas complementares.

mesmo após três décadas de desenvolvimento e modificação, o ensaio comet ainda é um ensaio bastante simples, versátil, mas trabalhoso. Várias modificações de alto rendimento do ensaio foram recentemente revistas (Brunborg et al., 2014). Tanto as aplicações in vivo quanto in vitro ganhariam grande vantagem com novas melhorias na eficiência, padronização de protocolo e rendimento. Automação e miniaturização são estratégias comuns em muitas áreas da biologia, permitindo mudanças de ordem de magnitude no número de amostras analisadas por experimento, reduzindo viés subjetivo e aumentando a reprodutibilidade.

so-what can we hope for in the next 30 years? A aceitação do cometa in vitro de ensaio para testes de genotoxicidade, baratos automatizado cometa de pontuação para salvar pesquisadores de intermináveis visualização do microscópio, o protocolo de padronização (talvez) e internos confiáveis padrões de referência, mais humana, a biomonitorização de estudos de reparo de DNA (aceitando-se que fenotípica ensaios têm um lugar importante ao lado de genômica e transcriptomics), monitoramento ambiental usando uma variedade de espécies animais e vegetais; e muitos mais imprevisível desenvolvimentos e aplicações.

Declaração de conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

agradecimentos

gostaríamos de agradecer a todos os autores, bem como revisores e Editores que contribuíram para este tópico de pesquisa fronteiras. A SL beneficia de uma subvenção pós-doutoramento do fundo de investigação AXA e do Prémio de ciência inovadora Cefic-LRI 2013. AA agradece ao Ministerio de Economía y Competitividad (programa “Ramón y Cajal”, 2013) do Governo espanhol pelo apoio pessoal.