dezvoltarea nanoparticulelor de Chitosan ca sistem stabil de livrare a medicamentelor pentru proteine/siRNA

rezumat

nanoparticulele de Chitosan (CS NPs) prezintă proprietăți fizico-chimice bune ca sisteme de livrare a medicamentelor. Scopul acestui studiu este de a determina modularea parametrilor preparativi asupra caracteristicilor fizice și stabilității coloidale a CS NPs. CS NP-urile au fost fabricate prin interacțiunea Ionică cu sulfatul de dextran (DS) înainte de determinarea stabilității lor de stocare. Cele mai mici NPs CS de nm cu o încărcare de suprafață de mV au fost produse atunci când CS și DS au fost amestecate la pH 4 și cu un raport de masă DS : CS de 0,5 : 1. O eficiență de prindere de 98% a fost obținută atunci când BSA/siRNA a fost încărcată în nanoparticule. Rezultatele au arătat, de asemenea, că dimensiunea particulelor și sarcina de suprafață a CS NPs au fost ușor modificate până la 2 săptămâni atunci când au fost stocate la 4 C. Dimensiunea mai mare a particulelor și sarcina de suprafață au fost obținute odată cu creșterea concentrației de DS. În concluzie, NP-urile au fost suficient de stabile atunci când au fost menținute la 4 centi C și capabile să transporte și să protejeze proteinele.

1. Introducere

peptidele endogene, proteinele și oligonucleotidele sunt printre principalele medicamente care atrag multă atenție datorită potențialului lor mare în tratarea bolilor cronice . Cu toate acestea, mediul extrem in vivo al corpului uman a limitat întotdeauna aplicațiile terapeutice ale acestor substanțe . Nanoparticulele polimerice au atras multă atenție ca sisteme de livrare datorită capacității lor de a depăși barierele fiziologice și de a proteja și direcționa substanțele încărcate către celule specifice . Polimerii naturali, cum ar fi chitosanul (CS), au fost studiați pentru a forma nanoparticule . CS este o polizaharidă biodegradabilă și este derivată din deacetilarea chitinei . În afară de biocompatibilitatea sa, toxicitatea scăzută, proprietățile hemostatice și bacteriostatice contribuie, de asemenea, la diferitele sale aplicații în domeniul farmaceutic . Mai mulți anioni au fost investigați pentru a lega CS ca sulfatul de sodiu și sulfatul de dextran (DS) . DS este capabil să modifice eficiența de prindere a proteinelor și a siRNA (ee) fără utilizarea agenților de întărire și să controleze rata de eliberare a medicamentului datorită densității sale ridicate de încărcare . Pe lângă faptul că DS este un material ieftin , produce nanoparticule mecanic mai stabile în comparație cu tripolifosfatul pentasodic (TPP) .

mai multe studii au raportat caracteristicile unice ale nanoparticulelor de chitosan (CS NPs) folosind DS. Cu toate acestea, modularea parametrilor preparativi asupra caracteristicilor lor fizice nu este încă investigată pe deplin, de exemplu, influența obstacolului steric DS asupra atracției electrostatice dintre CS și BSA . În plus, determinantul unui sistem de livrare de droguri de succes depinde de caracteristicile sale fizice și stabilitatea. Prin urmare, obiectivele studiului de față au fost de a modula parametrii preparativi pentru a obține particule nanosizate de CS NPs și de a determina stabilitatea lor coloidală la diferite temperaturi de depozitare și în diferite medii de suspendare.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

chitosan cu greutate moleculară mică (70 kDa cu gradul de deacetilare 75% -85%), acid acetic glacial, soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), albumină serică bovină (BSA, 46 kDa) și reactiv Bradford au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich Inc., SUA. SiRNA dublu catenar (sens: 5′-GAUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisens: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) a fost achiziționat de la Thermoscientific Dharmacon, SUA. Sulfatul de Dextran (DS) a fost achiziționat de la Fisher Scientific, MAREA BRITANIE. Scara de proteine( gama înaltă), tampon de probă Laemmli, tampon de 10x tris/glicină/dodecil sulfat de sodiu, persulfat de amoniu, tetrametilendiamină (TEMED), soluție de bis 2% și soluție de acrilamidă 40% au fost achiziționate de la Bio-Rad, SUA. Tamponul Tris-HCl a fost obținut de la Invitrogen, SUA. Toate celelalte substanțe chimice utilizate au fost de grad analitic.

2.2. Prepararea soluției martor și a soluției CS NPS

Cs și DS încărcate cu BSA au fost dizolvate în acid acetic 1% v/v și, respectiv, în apă distilată. pH-ul soluției CS a fost ajustat la pH 4 prin adăugarea a 1 m NaOH sau 1 m HCl. Soluție DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% și 0,25% w / v) a fost adăugat prin picurare în soluție CS (0,1% w/v) sub agitare magnetică (Wisestir Digital multipunct Magnetic agitator MS-MP8, Daihan Scientific, Coreea) la 250 rpm Timp de 15 minute pentru a forma nanoparticule. Toate probele au fost făcute în trei exemplare. Nanoparticulele rezultate au fost spălate și recoltate prin ultracentrifugare (optima L-100 XP Ultracentrifuge cu un rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, SUA) de două ori la 12 500 rpm timp de 15 min la 10 C. pentru asocierea BSA în CS NPs, BSA a fost dizolvată în soluție CS (0,1% g/v, pH 4) pentru a produce o concentrație finală de 1 mg/mL. NP-urile CS încărcate cu BSA au fost apoi preparate prin metoda de mai sus. Pentru asocierea siARN în CS NPs, s-a adăugat la soluția DS 3 unqtl de siARN (15 oqtg/oqtl) în apă deionizată(0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, și 0,25% g/v) înainte de a adăuga această picătură la soluția CS (0,1% g / v).

2.3. Studiul mobilității electroforetice

măsurătorile mobilității electroforetice () ale CS NPs au fost efectuate cu un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) și au fost măsurate în funcție de timpul de așteptare. Fiecare probă a fost analizată în trei exemplare.

2.4. Caracterizarea nanoparticulelor

dimensiunea particulelor, sarcina de suprafață și indicele de polidispersitate (PDI) ale CS NPS proaspăt preparate au fost măsurate folosind un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK), pe baza tehnicilor de spectroscopie de corelație fotonică (PCS). Nu s-au efectuat diluții în timpul analizei. Fiecare probă a fost analizată în trei exemplare. Măsurătorile au fost efectuate la 25 de Centimetre C.

2.5. Analiza morfologică

caracterizarea morfologică a CS NPS descărcate, BSA / siARN încărcate CS NPS (DS: CS raportul greutate de 0,5: 1, 1 : 1) a fost realizată prin utilizarea microscopiei electronice de transmisie (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Olanda).

2.6. Eficiența de prindere BSA / siARN

NP-urile CS încărcate BSA/siARN au fost separate de soluție prin ultracentrifugare (optima L-100 XP Ultracentrifuge cu un rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, SUA) la 14000 rpm Timp de 30 min. Supernatanții recuperați prin centrifugare au fost decantați. Conținutul de BSA din supernatant a fost analizat de un spectrofotometru UV-Vis la 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japonia) folosind testul proteinei Bradford conform instrucțiunilor producătorului. conținutul de siARN în supernatant a fost analizat printr-un spectrofotometru UV-Vis la 260 nm. Probele au fost preparate și măsurate în trei exemplare. Eficiența captării BSA/siARN (ee) a fost calculată folosind următoarea ecuație:

2.7. Stabilitatea CS NPs

CS NPS proaspăt preparat (realizat din 0,05% și 0,1% g/v de soluție DS și CS, resp.) au fost centrifugate la 12 500 rpm timp de 15 minute înainte de depozitare. După ultracentrifugare, peletele obținute au fost omogenizate fie în apă distilată (pH măsurat de 6,6), fie în PBS pH 7,4. Dimensiunea particulelor și sarcina de suprafață au fost măsurate la durate predeterminate ale timpului de stocare (0, 1, 2, 3, 5, 8, și 14 zile), și fie la temperatura ambiantă, fie la 4 ct.

2.8. Studiul in Vitro privind eliberarea medicamentului

eliberarea BSA/siARN a fost determinată din CS NPs cu cea mai mare EE (raportul DS : CS 1 : 1, ee = 98% 0,2 și , resp.). CS NP-urile încărcate cu BSA/siARN au fost suspendate în soluție tampon Tris-HCl (pH 7,4, 4 mL) și plasate pe un agitator magnetic cu o viteză de agitare de 100 rpm la 37 ct / min (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Germania) timp de 48 h la 37 ct / min.C. la intervale de timp prestabilite (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, și 48 h), probele au fost centrifugate la 14 000 rpm timp de 30 min la 10 centi C. Apoi, supernatantul a fost decantat și înlocuit cu un volum echivalent de soluție tampon proaspătă. Cantitatea de BSA/siRNA eliberată în supernatant a fost analizată de un spectrofotometru UV-Vis (U. V-1601; Shimadzu, Japonia) la o lungime de undă de 280 și, respectiv, 260 nm.

2.9. Integritatea BSA

integritatea BSA eliberată din CS NPs a fost determinată de SDS-PAGE (12% resorbție și 10% gel de stivuire) utilizând sistemul Mini-Protein (Bio-Rad, SUA). Probele BSA au fost amestecate cu tampon de probă Laemmli în raport 1: 1 și încălzite la 95 centimetric C timp de 5 min. Probele (15 unqql) au fost încărcate în godeuri și gelul a fost rulat folosind o celulă Tetra cu sistem Mini-proteic la o tensiune constantă de 150 V Timp de 90 min cu un tampon de rulare care conține Tris de 25 mM, glicină de 192 mM și 0,1% SDS la pH 8,3. Benzile de probă au fost colorate timp de 40 min cu soluție albastră de Coomassie 0,1% conținând 40% acid acetic și 10% metanol, urmată de colorare peste noapte cu o soluție de 40% acid acetic și 10% metanol.

2.10. Analiza statistică

toate datele au fost prezentate ca deviație standard medie (DS) a valorilor-țintă ale CIF. Analiza statistică (testul ANOVA și analiza posthoc a lui Tukey) a fost realizată prin utilizarea pachetului statistic pentru programul Social (SPSS) versiunea 15. O valoare < 0,05 a arătat o diferență semnificativă între media grupurilor testate.

3. Rezultate

3.1. Dimensiunea particulelor și încărcarea suprafeței

Figura 1(a) demonstrează rezultatele mobilității electrice () în raport cu timpul de așteptare. Din grafic, s-a putut observa că platoul rămas și constant după 30 de minute. Acest lucru demonstrează că formarea unui strat dublu electric stabil (e.d.l.) nu a fost instantanee, ci a necesitat câteva momente. Efectele dintre concentrația CS și concentrațiile finale DS asupra mărimii CS NPs sunt prezentate în Figura 1(b). S-a observat că majoritatea NPs-urilor CS cu dimensiunea mai mică de 500 nm au fost obținute la o concentrație scăzută de CS (0,1% g/v). Concentrația DS a influențat, de asemenea, dimensiunea nanoparticulelor (). O tendință de creștere a dimensiunii particulelor ar putea fi observată odată cu creșterea concentrației DS de la 0,05 la 0,25% g/v. În general, concentrația DS de 0.05% G/v (concentrație scăzută) a produs nanoparticule cu dimensiunea particulelor mai mică de 500 nm. Contrar acestui fapt, nanoparticule mari (>1000 nm) au fost obținute atunci când concentrația ambilor polimeri a fost crescută la 0,25% sau mai mult. Pe baza rezultatelor, concentrațiile DS de la 0,05 la 0,20% g / v au fost selectate pentru următoarele studii. Mai mult, o creștere a raportului de greutate DS : CS (densitate mai mare a sarcinilor negative din DS prezente în sistem) a dus la o creștere a dimensiunii particulelor, dar la o scădere a încărcăturii suprafeței particulelor (Tabelul 1 (de mai sus)). Deoarece greutatea CS a depășit masa DS, s-a obținut o valoare pozitivă de +56,2 XTX 1,5 MV. Cu toate acestea, încărcarea suprafeței particulelor a scăzut la − mV atunci când s-a adăugat mai mult DS încărcat negativ. A scăzut continuu când raportul de greutate DS: CS a ajuns la 2,5: 1. Acest lucru era de așteptat să se datoreze unui exces de molecule DS acumulate pe suprafața nanoparticulelor.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 1

mobilitatea electroforetică în funcție de timp (a) și efectul concentrațiilor finale de CS și DS asupra dimensiunii particulelor nanoparticulelor (b), .

Tabelul 1 (de mai jos) arată că DS 0,2% g/v poseda cea mai mare dimensiune a particulelor după încărcarea cu BSA. Dimensiunea particulelor a fost nm. Dimensiunea particulelor pentru DS la concentrații de 0,1 și 0.15% w / v a fost, de asemenea, mai mare decât cele goale (). Pe de altă parte, au fost observate valori pozitive mai mari ale încărcării de suprafață pentru nanoparticulele încărcate cu BSA comparativ cu cele goale. Acest lucru a fost observat pentru toate concentrațiile de DS. Mai mult, valorile EE mai mari ar putea fi obținute prin creșterea raportului de greutate DS : CS peste 0,5 : 1. EE a nanoparticulelor la raportul de greutate DS : CS de 1: 1, 1,5: 1 și 2: 1 a fost%, % și, respectiv,%. Cea mai mare EE a fost obținută la un raport de greutate DS : CS 1 : 1 (Tabelul 1 (de mai jos)).

Tabelul 2 arată că DS 0.2% w / V poseda cea mai mare dimensiune a particulelor (900 60 nm) după ce a fost încărcată cu siARN. siRNA încărcate CS NPs la diferite concentrații DS (0,05, 0,1, 0,15 și 0,2% w/v) au prezentat o dimensiune mai mică a particulelor. EE a nanoparticulelor la raportul de greutate DS : CS al 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, și 2: 1 a fost%,%, % și, respectiv,%.

3.2. Morfologie

imaginile NPs CS au fost obținute prin TEM (Figura 2). Figurile 2(a) și 2(b) arată că NP-urile CS descărcate au prezentat o structură sferică. Imaginile au demonstrat că nanoparticulele generate din siARN(figurile 2(e) și 2 (f)) au prezentat morfologie neregulată; cu toate acestea, nanoparticulele încărcate cu BSA au prezentat morfologii alungite(figurile 2(c) și 2 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 2

imagini TEM de CS NPs. (a) și (b) NPS CS descărcate la 0,5: 1 și 1: 1, (c) și (d) NPS CS încărcate BSA la 0,5 : 1 și 1 : 1, și (e) și (f) siARN încărcate CS NPs la 0,5 : 1 și 1 : 1, respectiv. Toate imaginile au fost realizate la o mărire de 60 kX.

3.3. Stabilitatea stocării CS NPs

ambele nanoparticule obținute din 0,05 și 0,10% g/v DS au crescut în dimensiune în timp, așa cum se arată în Figura 3(A) atunci când sunt depozitate la temperatura ambiantă. O creștere semnificativă a dimensiunii particulelor a fost observată după ziua 14 de depozitare, în special pentru 0,05% g/v DS. Se credea că acest lucru se datorează formării agregatelor. Această constatare coroborată cu rezultatele încărcării de suprafață care au arătat o scădere a încărcării de suprafață la aproape neutru. În schimb, atunci când au fost depozitate la 4 centi C, dimensiunea particulelor și încărcarea lor de suprafață au rămas neschimbate până la 14 zile pentru nanoparticule realizate din 0,10% w/V DS. S-a observat o ușoară modificare pentru 0,05% g/v DS [figurile 4 (a) și 4(b)]. Pe de altă parte, atunci când aceste nanoparticule au fost suspendate în PBS pH 7,4, toate formulările au fost agregate la dimensiuni mai mari de peste 1 centimm cu valori PDI mai mari de 0,5. Sarcinile lor de suprafață a particulelor au fost, de asemenea, aproape neutre, variind de la +0.2 până la +2,5 mV.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

(A) dimensiunea particulelor și (b) încărcarea de suprafață a CS NPS preparată la soluție DS 0,05 și 0,01% g/v și depozitată la 25 C. nanoparticulele au fost suspendate în apă distilată (pH în intervalul 6-7), .

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

(A) dimensiunea particulelor și (b) încărcarea de suprafață a CS NPS preparată la 0,05 și 0,10% G / v și stocată la 4 C. nanoparticulele au fost suspendate în apă distilată (pH în intervalul 6-7), .

3.4. Eliberarea BSA in Vitro și integritatea

Figura 5(A) ilustrează faptul că eliberarea BSA ar putea fi împărțită în două etape pe baza ratei de eliberare. În prima etapă, BSA a fost eliberat rapid din CS NPs și a arătat o eliberare de spargere în primele 6 ore. acest lucru a dus la o eliberare cumulativă de 45% 5 de la sută. În a doua etapă, BSA a fost eliberată lent de la 6 ore până la 48 de ore, rezultând o eliberare cumulată de BSA mai mare de 60%. Integritatea BSA eliberată din CS NPS a fost evaluată prin SDS-PAGE și este prezentată în Figura 5(b). Benzile observate au confirmat faptul că BSA care a suportat procesele de încărcare și eliberare la 37 C după zilele 1 și 2 nu au fost diferite de cele ale standardelor BSA proaspăt preparate. Prin urmare, s-ar putea concluziona că BSA a rămas în forma sa nativă în CS NPs în condițiile experimentale.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

(A) profilul de eliberare al CS NPS încărcat BSA la raportul DS : CS de 1 : 1 la pH 7.4, . (b) analiza paginii SDS a BSA eliberată din CS NPs: (M) standardele paginii SDS (BIO-RAD); (a) standardul BSA 1 mg/mL; (B) standardul BSA 0,2 mg/mL; (C) martor; (D) CS NPS descărcate; (E) și (F) BSA eliberată din CS NPs (raportul DS : CS de 1 : 1) în zilele 1 și 2.

3.5. siARN cu eliberare in Vitro

Figura 6 ilustrează faptul că eliberarea siARN ar putea fi împărțită în două etape pe baza ratei de eliberare. În prima etapă, siRNA a fost eliberat rapid din CS NPs și a arătat o eliberare de explozie în primele 6 ore. Acest lucru a dus la o eliberare cumulată de 58% Din 5% a siARN. În a doua etapă, siARN a fost eliberat lent de la 6 ore până la 48 de ore, rezultând o eliberare cumulativă de BSA mai mare de 85%.

Figura 6

profilul de eliberare a siARN încărcate CS NPs la DS : raportul CS de 1: 1 la pH 7,4, .

4. Discuții

metoda utilizată pentru a produce CS NPs în studiul de față este un proces ușor și permite controlul dimensiunii particulelor prin modificarea anumitor parametri, de exemplu, concentrația sărurilor adăugate, vâscozitatea, cantitatea de nonsolvent și greutatea moleculară a polimerului. Acest studiu a fost început cu investigația pentru obținerea de informații privind starea electrică a grupelor ionizabile de CS NPs prin determinarea timpului de stabilizare a e. d.L. această etapă este importantă pentru obținerea unor rezultate fiabile și reproductibile. Datele obținute au sugerat că formarea de e.d.l stabil. în timpul preparării nanoparticulelor necesare câteva momente după oprirea agitare. Aceste momente au fost necesare pentru ca electroliții să pătrundă spre nucleul particulelor. Astfel, timpul de așteptare de 40 min a fost necesar înainte ca CS NPs să poată fi măsurat cu exactitate. Această constatare a fost similară cu CS-tripolifosfat (CS-TPP) NPs care a sugerat același timp de așteptare .

a fost efectuat, de asemenea, un studiu pentru a determina influența concentrației polimerului asupra formării particulelor. Studiul a avut ca scop stabilirea gamei de concentrații de polielectroliți pentru a produce nanoparticule cu dimensiunea dorită. Pentru a studia efectele diferitelor concentrații de CS și DS asupra formării nanoparticulelor, s-au preparat soluții CS și DS de 0,1, 0,25 și 0,5% g/v. Volume variabile ale soluției DS(1, 2, 3, 4, 5, 5.8, și 10 mL) au fost amestecate cu 5 mL din fiecare concentrație de CS (0,1–0,5% g/v). Concentrația finală a CS și DS a fost calculată, iar dimensiunile probelor au fost clasificate fie ca 100-500, 501-1000, fie mai mult de 1000 nm. S-a constatat că dimensiunea particulelor a fost afectată de concentrația DS. Această constatare coroborată cu rezultatele CS-TPP NPs . În general, dimensiunea dorită a nanoparticulelor limitată între 100 și 1000 nm. Cu toate acestea, studiile anterioare au arătat că nanoparticulele încărcate ar produce în mod normal o dimensiune mai mare decât cele goale. Prin urmare, dimensiunea sub 500 nm este favorabilă.

mai mult, rezultatele au arătat că numai concentrația DS de 0,05% g/v a fost capabilă să producă nanoparticule cu dimensiunea particulelor mai mică de 500 nm, așa cum se arată în tabelul 1. Era de așteptat ca atunci când ambii polimeri erau în concentrații scăzute, adăugarea DS la CS a dus la nuclee coacervate mici. Contrar acestui fapt, coacervatele mari care au depășit dimensiunea de 1000 nm au avut tendința de a se forma atunci când concentrația ambilor polimeri a crescut la 0,25% sau mai mult. Capacitatea chitosanului de a forma spontan coacervat se datorează interacțiunii polielectroliților încărcați opus pentru a forma un complex polielectrolit cu solubilitate redusă. Amestecul de concentrație ridicată de DS cu CS este, prin urmare, mai probabil să afecteze entanglementul lanțurilor CS și solubilitatea complexului rezultat. Ca urmare, se va produce un grad ridicat de complexare și coacervat . Vâscozitatea scăzută la o concentrație mai mică de CS a dus, de asemenea, la o solubilitate mai bună. Acest lucru a permis o interacțiune mai eficientă între CS cationic și ionii încărcați opus și, astfel, a fost produsă o dimensiune mai mică a particulelor . În plus, o creștere și un exces în masa molară a polianionului utilizat a dus la particule mai mari, deoarece s-au format complexe foarte neutralizate și au avut tendința de a flocula . În acest studiu, încărcarea suprafeței particulelor sistemului nanoparticulat a fost dependentă de raportul de greutate al DS și CS. Încărcarea suprafeței particulelor s-a dovedit a fi crescută pe măsură ce raportul a scăzut. Această relație ar putea fi utilă în obținerea densității de încărcare a suprafeței particulelor dorite pentru a facilita proprietățile de aderență și transport ale nanoparticulelor.

în studiul de față, încorporarea BSA în CS NPs a fost realizată prin simpla amestecare a soluției acide CS care conține molecule BSA dizolvate cu soluția DS la temperatura camerei fără adăugarea de stabilizator. BSA este frecvent utilizată ca proteină model, deoarece cuprinde caracteristica generală a altor proteine și este biocompatibilă pentru oameni. S-a constatat că CS NPs avea dimensiuni relativ mai mari după încărcarea cu BSA. Dimensiunea particulelor era de așteptat să crească atunci când BSA a fost încărcată cu succes în nanoparticule. Această tendință se poate datora greutății moleculare și dimensiunii moleculelor BSA adăugate. Aceste dimensiuni mari ale particulelor pot limita utilizarea lor în livrarea de proteine. Nanoparticulele de 150-300 nm se găsesc în principal în ficat și splină . În plus, potrivit unor rapoarte, cerința de dimensiune “ideală” pentru nanoparticule dezvoltate pentru tratamentul cancerului este cuprinsă între 70 și 200 nm . Deși nanoparticulele nu trebuie să fie mai mari de 150 nm pentru a traversa bariera endotelială, literatura raportează întotdeauna penetrarea particulelor mai mari decât limitele fenestrațiilor. Într-adevăr, fenestrarea și vasculatura pot suferi modificări în diferite condiții patologice .

de exemplu, creșterea tumorală va induce dezvoltarea neovasculaturii caracterizată prin endoteliu discontinuu cu fenestrații mari de 200-780 nm . În plus, s-a observat că încărcarea suprafeței particulelor nanoparticulelor încărcate cu BSA a fost mai mare decât cele goale. Acest lucru se poate datora caracteristicii cationice posedate de BSA atunci când este prezentă în stare acidă. Sarcinile pozitive din moleculele CS și BSA au contribuit, prin urmare, la o valoare mai mare a încărcării suprafeței particulelor pentru nanoparticulele încărcate.

polimerii cationici încărcați pozitiv se pot lega și proteja eficient acizii nucleici, cum ar fi ADN-ul , oligonucleotidele și siRNA . În acest studiu, încorporarea siARN în CS NPs a fost realizată prin simpla amestecare a soluției acide CS cu soluția DS care conține siARN la temperatura camerei. S-a constatat că dimensiunea particulelor de CS NPs a fost relativ mai mică după încărcarea cu siRNA. Dimensiunea mai mică a CS NPS încărcată cu siRNA s-ar putea datora neutralizării sarcinilor negative ale acidului nucleic de către polimerul cationic, rezultând nanoparticule condensate de dimensiuni mai mici. Cs NP-urile încărcate cu siRNA au prezentat, de asemenea, un potențial zeta mai mare decât CS NP-urile goale, urmând aceeași tendință ca cea a CS NP-urilor încărcate cu BSA.

în mod ideal, un sistem de livrare de succes ar trebui să aibă un grad ridicat de asociere a medicamentelor. Cs NPS încărcat cu siRNA a arătat o eficiență mai mare de prindere (<90%) pentru toate raporturile de greutate DS : CS. Eficiența de prindere a nanoparticulelor la raportul de greutate DS : CS de 1: 1, 1,5 : 1, și 2: 1 a fost mai mare decât raportul de greutate de 0,5 : 1. Acest fenomen s-a datorat cel mai probabil proporției mai mari de DS prezentate în nanoparticule. După cum a adăugat mai multe DS, ar facilita mai mult BSA să fie prins în nanoparticule. Acest lucru ar putea fi explicat prin faptul că BSA este o moleculă zwitterionică. La pH–ul mediului de formulare de 3,5-4,0, solubilitatea BSA ar putea fi foarte crescută datorită încărcărilor pozitive crescute pe care le posedă . Astfel, BSA ar putea să se atașeze electrostatic și să se încarce stabil în nanoparticule. În soluție acidă, BSA ar putea avea sarcină pozitivă și ar putea concura cu CS pentru a interacționa cu DS electrostatic. Această constatare a fost coroborată cu creșterea încărcărilor pozitive de suprafață ale CS NPS încărcate cu BSA în comparație cu cele descărcate. Mai mult, există situri multi-ionice pe BSA, iar această caracteristică ar putea facilita încorporarea BSA în nanoparticule. Această constatare diferă de constatarea cu CS-TPP NPs .

în studiu, interacțiunea electrostatică a fost prezentă între BSA și CS, în loc de BSA și TPP. De asemenea, s-a sugerat că BSA ar trebui să se dizolve într-o soluție cu pH mai mare decât punctul său izoelectric pentru ca BSA să posede sarcină negativă și să interacționeze cu moleculele CS încărcate pozitiv. Prin urmare, această constatare a demonstrat că interacțiunea electrostatică este principalul factor care contribuie la promovarea încorporării BSA în nanoparticule fie prin interacțiunea CS-proteină, fie prin interacțiunea DS-proteină.

TEM permite vizualizarea nanometrică a nanoparticulelor individuale și oferă informații atât despre dimensiune, cât și despre morfologie. Morfologia particulelor este un factor important pentru stabilitatea coloidală și chimică, precum și pentru bioactivitatea nanoparticulelor. cs NPS încărcat cu siRNA a prezentat morfologie neregulată; cu toate acestea, CS NPS încărcat cu BSA a prezentat morfologie alungită. Acest lucru s-ar putea datora dimensiunii mai mari a BSA, care poate încurca sau acționa ca un scut pentru CS, limitând astfel expunerea generală a CS în cadrul structurii.

profilul de stabilitate al CS NPs la stocare este de asemenea important. Aceste informații ar putea oferi o imagine despre stabilitatea nanoparticulelor sub diferite medii și temperaturi. Stabilitatea nanoparticulelor a fost investigată prin evaluarea variației lor în dimensiunea medie a particulelor și încărcarea suprafeței în timp. La început, nanoparticulele au fost resuspendate în apă distilată la pH 6,6, care a fost filtrată cu un filtru de 0,2 mm pentru a îndepărta eventualii contaminanți prezenți în apă. Pentru acest studiu, au fost testate numai nanoparticule obținute din 0,05 și 0,10% G/v de DS. Alte concentrații de DS nu au fost determinate datorită măririi dimensiunii particulelor după centrifugare. Dimensiunea particulelor a fost de până la nm și nm pentru 0,15% și, respectiv, 0,20% w/V DS. Creșterea dimensiunii particulelor se poate datora CS NPs ei înșiși erodează și își pierd forma sferică într-un mediu apos și, în consecință, diametrul mediu al particulei ar crește ca răspuns la această eroziune . Mai mult, sarcinile de suprafață ale particulelor pentru nanoparticule obținute din ambele concentrații au scăzut în timp. S-a suspectat că CS poate fi degradat în medii apoase, chiar dacă în absența lizozimelor. Rezultatele au arătat că NP-urile CS au fost mai stabile atunci când au fost stocate la 4 CTC, deoarece dimensiunea particulelor și sarcina lor de suprafață au fost neschimbate sau ușor modificate până la 14 zile. Rezultatele au sugerat, de asemenea, că CS NPs nu trebuie păstrat la temperatura ambiantă, deoarece acestea sunt predispuse la degradare. Prin urmare, rezultatele au sugerat că CS NPS stocate la temperatura camerei sunt mai predispuse la degradare decât cele care au fost stocate în mediu rece. Probabil s-a datorat mediului rece care ar putea încetini mișcarea cinetică a nanoparticulelor. Astfel, nanoparticulele și-ar putea menține forma sferică, iar eroziunea ar fi mai puțin probabilă. Mai mult, s-a observat că aceste nanoparticule au fost agregate în PBS la pH 7,4. Acest lucru se poate atribui unei încărcări mai mici a suprafeței particulelor de nanoparticule în PBS, aproape de neutru. Încărcarea suprafeței particulelor care a scăzut la zero poate indica faptul că CS NPs a suferit anularea sarcinii de către grupările fosfat de PBS. Starea încărcată neutră a acestor nanoparticule poate provoca pierderea forțelor intra – și intermoleculare, importante pentru menținerea individuală a nanoparticulelor. Ca urmare, aceste nanoparticule neîncărcate pot începe să agregeze și să destabilizeze sistemul coloidal. Spre deosebire de PBS, apa distilată poate furniza numeroși ioni de hidrogen pentru a forma legături de hidrogen care pot ajuta la ruperea agregării nanoparticulelor prin interacțiunea cu grupuri ionizabile de CS NPs.

studiul in vitro privind eliberarea BSA și siARN din CS NPs a fost efectuat în tampon Tris-HCL. Eliberarea BSA și siRNA ar putea fi împărțită în două etape pe baza ratei de eliberare. În prima etapă, medicamentul a fost eliberat rapid din CS NPs. Eliberarea BSA și siARN în această etapă ar putea implica difuzia BSA / siARN legat la suprafața particulelor. În a doua etapă, BSA/siARN a fost eliberat lent din cauza umflării sau degradării polimerului. Restul BSA/siARN din CS NPs nu ar fi complet eliberat până când particulele nu au fost complet erodate sau dizolvate în mediu de eliberare. Acest lucru s-ar fi putut datora interacțiunii dintre grupul BSA/siARN rămas și grupul amino liber pe segmentele CS . În plus, sistemul sintetizat care a fost descris anterior ca fiind capabil să fie formulat în condiții ușoare a asigurat că stabilitatea proteinelor încărcate în CS NPs a fost intactă, determinată de SDS-PAGE.

5. Concluzii

în rezumat, acest studiu arată că concentrația CS și DS, precum și pH-ul au fost parametrii care controlează dimensiunea particulelor și sarcina de suprafață a CS NPs. Nanoparticulele mai mici de 500 nm ar putea fi obținute la raportul de greutate DS : CS de 0,5 : 1 la pH 4. În cazul prinderii BSA, nanoparticulele cu raporturi de greutate DS : CS mai mari au avut o eficiență mai mare de prindere de peste 88%. Cel mai mare procent de eficiență a captării realizat a fost de 0,10% g/v DS (raport DS : CS de 1 : 1). Cu toate acestea, CS NPS încărcat cu siARN a arătat o eficiență ridicată de prindere (>90%) pentru toate rapoartele DS : CS. Temperatura de depozitare și mediul de suspendare s-au dovedit a fi factorii care ar putea influența stabilitatea CS NPs. CS NP-urile au fost labile și tind să se destabilizeze la temperatura ambiantă, dar rețin acest comportament labil atunci când a fost furnizat un mediu rece (2-4 c). În plus, CS NPs a avut o stabilitate mai bună în apa distilată decât în PBS, care s-ar putea datora legăturilor de hidrogen care s-au format între moleculele de apă și grupurile ionizabile de CS NPs.

Conflict de interese

autorii declară că nu există niciun conflict de interese personal sau financiar în cercetarea actuală.

recunoaștere

autorii recunosc cu recunoștință “Dana Lonjakan Penerbitan” de Universiti Kebangsaan Malaezia (UKM-DLP-2011-001) pentru finanțarea și sprijinirea proiectului de cercetare curent.