gränser i genetik

alkalisk kometanalys (singelcellgelelektrofores) är den mest använda metoden för att mäta DNA-skador i eukaryota celler (Neri et al., 2015). Den detekterar strängbrott (SBs) och alkalilabila platser vid frekvenser från några hundra till flera tusen raster per cell-ett biologiskt användbart intervall, som sträcker sig från låga endogena skadenivåer till omfattningen av skador som kan påföras experimentellt utan att döda celler. Digestion av nukleoiderna, efter LYS, med vissa lesionsspecifika reparationsendonukleaser möjliggör mätning av andra skador än SBs; i synnerhet har formamidopyrimidine DNA-glykosylas (FPG) använts i stor utsträckning för att detektera förändrade puriner, som omvandlas till raster av enzymet. Nyligen, (Cortubbics-Gutiubbibbirrez et al., 2014) utvecklade en tvådimensionell två-Tailed kometanalys (TT-komet) som kan skilja mellan enkelsträngade (SSB) och dubbelsträngade DNA-raster (Dsb) i samma kometer i spermier.

sedan den första rapporten från Ostling och Johanson (1984) har kometanalysen använts i stor utsträckning vid genotoxicitetstestning av kemikalier, både in vitro och in vivo modeller. En fördel med det senare är att celler från olika vävnader kan studeras, i en mängd olika eukaryota organismer. Under de senaste 15-åren har kometanalysen använts i stor utsträckning i Drosophila melanogaster för att testa kemikaliernas Genotoxicitet (Gaiv Exceptiono och Sierra, 2014). Detta tillvägagångssätt är mycket användbart eftersom Drosophila melanogaster är en värdefull modell för alla typer av processer relaterade till människors hälsa, inklusive DNA-skador.

användningen av växter samt ett brett spektrum av mark-och vattenlevande arter i kometanalysen har ökat dramatiskt under det senaste decenniet (Costa et al., 2014; De Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), särskilt i miljöriskbedömning (ERA). En ny valideringsstudie har visat att in vitro-kometanalysen kombinerad med FPG kan vara en effektiv komplementär bevislinje i ERA även i särskilt utmanande naturliga scenarier som flodmynningsmiljöer (Costa et al., 2014).

under det senaste decenniet har produktionen och användningen av nanostora material ökat avsevärt, och som en följd av detta har mänsklig exponering för dessa typer av material. Att identifiera och förstå farorna med nanomaterial (NMS) i förhållande till människors hälsa är inte en enkel sak. Inte bara är den kemiska sammansättningen av NMs ansvarig för deras Genotoxicitet, men också form, specifik ytarea, storlek, storleksfördelning och zetapotential bestämmer effekterna av dessa material på genomet. Även om det fortfarande finns en debatt om lämpligheten av standard genotoxicitetsanalyser för att studera effekterna av NMs, har hittills den mest använda metoden inom nanogenotoxikologi, tack vare dess robusthet, mångsidighet och tillförlitlighet, varit kometanalysen (Azqueta och Dusinska, 2015). Förutom att undersöka genotoxiciteten hos strålning och olika kemikalier har växtkometanalysen nyligen också använts för att studera den genotoxiska effekten av NPS (Santos et al., 2015).

en ytterligare tillämpning av kometanalysen är som ett värdefullt experimentellt verktyg för human biomonitoring såväl som i kliniska studier. Att samla blod eller vävnader är inte alltid möjligt hos alla människor, och andra källor till celler som kan samlas in icke-invasivt har testats med kometanalysen; till exempel olika typer av epitelceller (Rojas et al., 2014) såväl som spermier (Cort Actusics-Guti Actusirrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

parallellt med utvecklingen av kometanalysen för DNA—skadamätning har analyser för DNA—reparation-ett väsentligt element i det genotoxiska cellulära svaret-utvecklats. Det enklaste sättet att mäta DNA-reparation är att behandla celler med ett DNA-skadligt medel och sedan inkubera dem för att tillåta reparation att fortsätta, mäta mängden skada som återstår med intervaller. Ett alternativt, biokemiskt tillvägagångssätt för att bedöma reparationskapacitet beskrevs 1994 (Collins et al., 1994), och sedan dess har olika modifierade versioner av analysen för att mäta både base excision repair (BER) och nucleotide excision repair (NER) publicerats (granskad av Azqueta et al., 2014). Detta biokemiska tillvägagångssätt har tillämpats för att studera effekterna av miljö, näring, livsstil och yrke på DNA-reparationskapacitet, förutom kliniska undersökningar (Azqueta et al., 2014).

detta alternativa in vitro-tillvägagångssätt för DNA-reparation bedömer reparationsaktiviteten hos ett cellextrakt på ett DNA-substrat som innehåller definierade lesioner. Kometanalysen används för att följa ackumuleringen av DNA-raster (reparera mellanprodukter) med inkubationstid. Nyligen var Slyskova och kollegor de första som tillämpade in vitro-DNA-reparationsanalyserna för BER och NER framgångsrikt på humana vävnadsprover; specifikt kolorektala karcinombiopsier (Slyskova et al., 2012, 2014).

en annan typ av DNA-reparationsanalys, som tillåter celler inbäddade i gelen att reparera före Lys, antogs nyligen för att studera DNA-reparationskinetik mer detaljerat; specifikt för att studera regleringen av BER-proteiner genom post-transkriptionsmodifieringar (Nickson och Parsons, 2014). Ännu ett sätt att studera DNA-reparation, på nivån av specifika gener, är med kometfisktekniken, som använder sig av fluorescerande märkta DNA-prober som hybridiserar till det enkelsträngade DNA i kometsvansen. McAllister et al. (2014) använde denna metod för att studera preferenssträngbrytningsreparation i bulk DNA såväl som i utvalda regioner med aktivt transkriberade gener.

att studera kinetiken för reparation av inducerad skada kommer att hjälpa till i vår förståelse av cellulära svar på genotoxiska kemikalier. Dessutom kan betydelsen av DNA-reparation som spelare i den (anti)cancerframkallande processen belysas genom att titta på reparation på nivån av specifika cancermålvävnader. Reglering av reparation – och andra aspekter av det cellulära svaret på genotoxiska föreningar—kommer sannolikt att involvera epigenetiska mekanismer och kometanalysen har antagits framgångsrikt för att mäta förändringar i det globala DNA-metyleringsmönstret i enskilda celler under olika tillväxtbetingelser (Lewies et al., 2014).

procent svans—DNA rekommenderas som den bästa deskriptorn för DNA—brytningsfrekvenser, eftersom de kometer som avses-och skadans omfattning-lätt kan visualiseras. Men många forskare föredrar fortfarande användningen av svansmoment (m Obbller et al., 2014). I själva verket påverkas de två beskrivarna på liknande sätt av analysförhållanden (Azqueta et al., 2011; Ersson och M Obbller, 2011).

variabilitet i kometanalysen är en viktig fråga, oavsett om det härrör från användningen av olika protokoll eller från okontrollerbar eller slumpmässig experimentell variation. Införandet av referensstandarder i alla experiment rekommenderas, särskilt när ett stort antal prover—till exempel från en biomonitoreringsstudie—analyseras vid olika tillfällen. Referensstandarder är celler med en känd mängd DNA-skador; antingen obehandlade celler (negativ kontroll), Röntgenexponerade celler (positiv kontroll) eller celler behandlade med fotosensibiliserare plus ljus (positiv kontroll för analyser inklusive FPG-inkubation), batchberedda och frysta som alikvoter. Om väsentlig variation uppstår i standarderna i en körning av experiment, provresultat kan normaliseras (Collins et al., 2014). Om referensstandarder utbyts mellan laboratorier kan resultaten från dessa laboratorier lättare jämföras.

Referensstandardceller sätts normalt i geler parallellt med provgeler. Interna standarder-dvs., standardceller i samma gel som provceller—skulle vara idealiska; men det är naturligtvis viktigt att kunna skilja de två typerna av celler. Fiskceller som antingen är större eller mindre i genomstorlek jämfört med mänskliga celler har framgångsrikt antagits för detta ändamål (Brunborg et al., 2015). Dessa referensceller kan användas i kombination med en standard-eller kalibreringskurva (etablerad med celler som ges olika doser joniserande strålning), vilket möjliggör en mer exakt kvantifiering av DNA-lesioner uttryckta som en DNA-brytfrekvens snarare än % svans-DNA.

statistik är ett viktigt verktyg i alla tillämpningar av kometanalysen, för att kontrollera om små skillnader uppstår av en slump. Kortfattade beskrivningar av statistisk analys och rekommendationer för tester har publicerats (Lovell et al., 1999; Lovell och Omori, 2008). M ubbller och Loft (2014) påminner oss om att för att hålla kometanalysen statistisk analys enkel, lämplig studiedesign och statistisk kraft bör noggrant övervägas när man planerar experiment.

som med alla biologiska analyser är dataintegration avgörande för att tolka kometanalysresultaten inom den större bilden. Integration av information som tillhandahålls av kometanalysen med andra DNA-skadeindikatorer och cellulära svar (t.ex. oxidativ stress, celldelning eller celldöd) har tillämpats både i ERA (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015) såväl som mänskliga (biomonitoring) studier (t.ex. Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Även inklusive “omics” – data kommer att hjälpa till att avslöja verkningssättet för genotoxiska föreningar (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – även om det är värt att påpeka att flera studier har visat att fenotypiska åtgärder för DNA-reparation inte nödvändigtvis korrelerar med genomiska eller transkriptomiska data (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); de olika metoderna bör betraktas som kompletterande.

även efter tre decennier av utveckling och modifiering är kometanalysen fortfarande en ganska enkel, mångsidig men arbetsintensiv analys. Olika hög genomströmningsmodifieringar av analysen granskades nyligen (Brunborg et al., 2014). Både in vivo och in vitro-applikationer skulle få stor fördel av ytterligare förbättringar i effektivitet, standardisering av protokoll och genomströmning. Automatisering och miniatyrisering är vanliga strategier inom många områden av biologi, vilket möjliggör storleksordningar i antalet prover som analyseras per experiment, minskar subjektiv bias och förbättrar reproducerbarheten.

så-vad kan vi hoppas på under de kommande 30 åren? Godkännande av in vitro-kometanalysen för genotoxicitetstestning, billig automatiserad kometpoäng för att rädda forskare från oändlig mikroskopvisning, protokollstandardisering (kanske) och tillförlitliga interna referensstandarder, mer mänskliga biomonitoringstudier av DNA-reparation (accepterar att fenotypiska analyser har en viktig plats tillsammans med genomik och transkriptomik), miljöövervakning med hjälp av en mängd olika djur-och växtarter; och många mer oförutsägbara utvecklingar och tillämpningar.

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

bekräftelser

vi vill tacka alla författare samt granskare och redaktörer som har bidragit till detta forskningsämne för gränser. SL är mottagare av ett postdoktorsstipendium från AXA Research Fund och Cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA tackar den spanska regeringens Ministerio de Economicu y Competitividad (programmet Ramubbicn y Cajal, 2013) för personligt stöd.