Kromfrisättningsanalys: det gamla Skolsättet att testa cytotoxiska T-celler
det finns flera metoder du kan använda för att se om dina T-celler är cytotoxiska, men en kromfrisättningsanalys med radioaktivt 51kromium (51Cr) är en av de äldsta. Det ger bra resultat och är bra för laboratorier som inte har råd med eller inte har flödescytometri lätt tillgänglig.
här kommer jag att beskriva en enkel metod för att testa t-celldödande funktion med 51Cr. Men innan du börjar din analys, var noga med att läsa upp lämpliga säkerhetsåtgärder vid hantering av radioaktiva material.
Välj ditt mål och effektorer
för att göra en kromfrisättningsanalys inkuberar du först dina målceller (T) med 51Cr. Du inkuberar sedan målcellerna med effektorceller (dina T-celler; E). Om effektorcellerna dödar målen kommer de att släppa 51Cr, som du kommer att upptäcka med en gamma-räknare.
vilka mål och effektorer du använder är helt beroende av din applikation. Dina målceller är vad du testar t-cellfunktion mot. Du kanske vill döda ditt mål (mäta cytotoxicitet) eller du kan se om T-cellerna är toleranta (som att testa tillverkade celler innan de går in i en patient för säkerhet!). Dina effektor T-celler kan också härledas från olika källor. Till exempel kan du använda tillverkade t-cellinjer eller T-celler som nyligen isolerats från ett djur.
Låt oss bli radioaktiva
när du har samlat dina mål och effektorer är det dags att laga mat.
- räkna dina celler. Du kan använda en hemocytometer eller en automatisk cellräknare. Antalet celler du behöver beror på antalet villkor och hur många replikat av varje tillstånd du gör. Vanligtvis kör jag mina analyser i tre exemplar och har fyra förhållanden (5:1, 10:1, 20:1 och 40: 1 E: T). Alikvot dina målceller (i mitt fall 500 000 – cirka 25 000 per brunn) i till 15 ml koniska rör, vilket håller varje experimentellt tillstånd separat! Se till att du stänger av dina celler i en liten volym så att de har chansen att komma i kontakt med krom.
- Lägg till 51Cr (cirka 50 usci) och inkubera dina mål med krom i en timme. Flick rören om varje 20 minuter för att öka möjligheterna för celler att uppta krom.
- medan du inkuberar….Denna långa inkubation är en bra tid att ställa in dina effektorceller. Tvätta T-cellerna två gånger med PBS för att ta bort överskott av cytokiner som kan skeva dina resultat. Sedan resuspendera dem i lämpliga medier.
- när du är klar med tvättarna är du redo att sätta dina effektorer på tallriken! Jag använder vanligtvis en 96 brunnsplatta eftersom volymerna är ganska små. Platta effektorerna i olika förhållanden till målen för att bestämma tröskeln för dödande. Jag kör vanligtvis analysen i triplikat men det beror på hur många celler du har tillgängliga. 40, 20, 10 och 5 till 1 förhållanden (effektorer till mål) är en bra mall om du har tillräckligt med tillgängliga celler.
utöver dessa test, Ställ in två kontrollförhållanden:
- en spontan frisättningskontroll som innehåller bara målceller (i grunden en negativ kontroll eftersom det inte borde finnas något dödande utan effektorerna) och
- en maximal frisättningskontroll där du lyserar målcellerna (en positiv kontroll som visar det maximala beloppet ett krom som tas upp av cellerna).
- tillbaka till de målcellerna … när dina målceller är färdiga, tvätta dem tre gånger med cellodlingsmedium för att ta bort överskott av krom. Snurra cellerna försiktigt vid 400g i 5 min för var och en av dessa tvättar. Dekantera supernatanten i en avfallsbehållare som kan överföras till ett säkert sönderfallsområde snarare än att försöka pipettera ut det. Detta hjälper till att minska eventuell förorening eftersom du inte behöver ta itu med några tips.
- efter tvättarna, resuspendera dina celler till 5000 celler per 100?l. lägg sedan till 100?l av celler till varje brunn, även de spontana och maximala brunnarna. Inkubera cellerna tillsammans i minst 4 timmar vid 37 kcal C, exakt hur länge beror på din ansökan.
- fyra timmar senare….Ta din tallrik ur inkubatorn. Lägg till 100?l av en 1% triton-x-lösning till dina celler i de maximala brunnarna för att lysera cellerna och släppa allt krom.
- snurra plattan ner vid 1250 RPM i tio minuter för att pelletera cellerna.
- överför supernatanten från varje brunn till brunnen på en absorberande platta (t.ex. Luma-plattor) var försiktig så att du inte vidrör pelleten längst ner på brunnen.
- låt plattan torka över natten. På morgonen, pop det i plattan läsaren och få dina resultat.
resultaten du ser beror på din specifika applikation
beräkna resultaten av din Kromfrisättningsanalys
när du har avläsningarna måste du utföra en enkel beräkning för att bestämma cytotoxiciteten hos dina celler.
först, genomsnittliga dina triplikat för varje tillstånd. Ta sedan dessa medelvärden och anslut dem till denna formel:
(Kromfrisättning för tillstånd av intresse – kromfrisättning i spontana brunnar)/ (max kromfrisättning – Kromfrisättning i spontana brunnar)
multiplicera värdet med 100 för att få din procentlys.
