Cri-Du-Chat Syndrom: Klinický Profil a Chromozomální Microarray Analýzy v Šesti Pacientů

Abstrakt

Cri-du-chat syndrom je chromozomální porucha způsobená vypuštěním krátké rameno chromozomu 5. Závažnost onemocnění, úrovně intelektuálního a vývojového zpoždění a prognóza pacienta souvisely s velikostí a polohou delece. S cílem stanovit korelace genotyp-fenotyp, použili jsme array-CGH k vyhodnocení šesti pacientů nesoucích cytogeneticky detekované delece krátkého ramene chromozomu 5 kteří byli sledováni v genetice komunitní služba. Cytogenetické a klinické profily pacientů byly přehodnoceny. Databáze hodnocení je prováděno předvídat další geny a regulační prvky zodpovědné za charakteristické fenotypových a behaviorálních rysů této poruchy. Analýza Array-CGH umožnila vymezení terminálních delecí, které se pohybovaly ve velikosti od přibližně 11,2 Mb do 28.6 Mb, s zarážkami od 5p15. 2 do 5p13. U jednoho pacienta byla také pozorována další DUP(8)(P23) (3, 5 Mb), považovaná za benigní změnu počtu kopií. Vypočtená hodnota korelačního koeficientu indikovala přítomnost slabého vztahu mezi vývojovým zpožděním a velikostí delece. Genetické pozadí, historii rodiny, epigenetické faktory, kvantitativní znak lokusu polymorfismy, a faktory životního prostředí může také ovlivnit fenotyp pacienta a musí být zohledněny při genotyp-fenotypové korelace.

1. Úvod

Cri-du-chat syndrom (jste stíhán) (OMIM123450) byl poprvé identifikován v roce 1963, kdy sérii tří pacientů s delecí krátkého ramene chromosomu 5 byl popsán . Hlášené fenotypy součástí high-posazený, monotónní, kočičí pláč během prvních let života, poskytující název syndrom, kromě typické obličejové dysmorphisms, intelektuální postižení a vývojové zpoždění. Na 5p odstranění původce tohoto syndromu s incidencí 1: 50 000 živě narozených dětí, a může být terminál (78%), intersticiální (9%), nebo způsobené nevyváženou translokací (5%) . V přibližně 80 procentech případů jsou tyto delece de novo příhody .

kritická oblast umístěná mezi 5p15. 2 a 5p15. 3, která je zodpovědná za fenotyp delece 5p, byla definována Niebuhrem . Bylo hlášeno, že delece 5p15.2 je zodpovědná za pozorovaný dysmorfismus a mentální postižení u těchto pacientů a proximální oblast 5p15.3 byl spojen s” kočičím ” výkřikem a zpožděním řeči . Molekulární studie potvrdily význam těchto regionů do patognomonické příznaky a umožnily upřesnění konkrétních genů, které individuálně ovlivňují různé složky klasického fenotypu .

Wu et al. analyzovány kandidátské geny pro kočičí výkřik v kritické oblasti cri-du-chat pomocí kvantitativní PCR. Byly analyzovány distální zarážky dvou intersticiálních delecí u dvou klinicky odlišných pacientů s CDCS; jeden pacient vykazoval kočičí výkřik a druhý ne. Výsledky ukázaly, kandidát gen, FLJ25076/UBC-E2, mapování mezi zarážky spanning 5p15.3-5p15.2. Tento segment má délku 640 kb a kóduje enzym typu E2 konjugovaný ubiquitinem exprimovaný v hrudních a skalpových tkáních.

Další geny, které byly mapovány, aby jste stíhán kritické oblasti patří semaphorin F (SEMAF) genu , zahrnující alespoň 10% z odstraněné chromozomální oblasti, a δ-catenin (CTNND2) genu , který kóduje specifické neuronové proteiny potenciálně podílejí na vývoji mozku. Tyto geny jsou spojeny s mentálním postižením. Bylo zjištěno, že CTNND2 reguluje morfogenezi páteře a synapse a funguje v hipokampálních neuronech během vývoje a může přispívat k funkčním změnám v nervových obvodech .

V tomto šetření jsme použili array-CGH analyzovat malý, ale velmi heterogenní skupinu šesti jste stíhán pacientů diagnostikována pomocí konvenční cytogenetické techniky. Tato studie vyvolává nové otázky týkající se fenotyp-genotypové korelace tohoto syndromu. Je uveden přehled funkcí genů/lokusů umístěných v oblasti 5p.

2. Materiály a metody

2.1. Výběr vzorku

jednalo se o kolaborativní longitudinální studii provedenou na 6 pacientech s CDCS. Většina pacientů byla sledována za posledních 20 let ve veřejné komunitní genetické službě ve spolupráci s brazilskou sítí referencí a informací pro syndrom Mikrodelece (RedeBRIM). Pacienti 2, 3, 4 a 5 byli diagnostikováni během prvního roku života, pacient 1 byl diagnostikován ve věku 5 let a nejstarší pacient (pacient 6) byl diagnostikován ve věku 16 let.

pacienti byli pravidelně přehodnocováni po dobu několika let. Hodnocení psychomotorického vývoje byla založena na osobních pozorováních, výkonu školy a informacích rodičů. Byly zaznamenány denní schopnosti a dovednosti, jako je jazyk, sociální interakce, koncentrace/pozornost, impulzivita, motorická kontrola, vnímání a učení a paměť. Podle těchto zjištění a přizpůsobení stupnice vyvinuté Zhang et al. stupeň mentálního postižení u každého pacienta byl stanoven na číselné stupnici od 0 (nepostižených) 7 (hluboce postižených). Pearsonův korelační koeficient () mezi velikostí delece a stupněm mentálního postižení (ID) byl stanoven pro každého pacienta.

2.2. Cytogenetická analýza

karyotypizace byla provedena na metafázových pomazánkách připravených ze vzorků periferní krve. Analýza chromozomů byla provedena po pruhování GTG v rozlišení 550 pásů. Bylo analyzováno nejméně 150 buněk od každého pacienta.

2.3. Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH)

Pro všechny pacienty, vypuštění byla potvrzena pomocí dual-barva komerční sonda pro jste stíhán regionu (Cytocell, UK). Na CTNND2 sonda pro 5p15.2 (červené spektrum) obsahuje sekvence homologní k D5S2883 locus a pokrývá ~159 kb tohoto lokusu. Sonda FLJ2507 pro 5p15. 3 (zelené spektrum) obsahuje sekvence homologní s lokusy D5S1637E a D5S2678 a pokrývá obě tato lokusy (~194 kb). Jako kontrola (zelené spektrum) byla použita sonda NSD1 pro 5q35 (oblast Sotos). Bylo analyzováno nejméně 30 buněk na hybridizaci.

2.4. Array-CGH

delece byly mapovány pomocí whole-genome array-CGH pomocí 60-mer oligonukleotid na bázi microarray s teoretickým rozlišením 40 kb ( K, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Označování a hybridizace byly provedeny podle protokolů poskytnutých společností Agilent, 2011. Pole byla analyzována pomocí skeneru microarray (G2600D) a softwaru pro extrakci funkcí (verze 9.5.1) (oba od společnosti Agilent Technologies). Analýzy obrazu byly provedeny pomocí Agilent Genomic Workbench Lite Edition 6.5.0.18 se statistickým algoritmem ADM-2 při prahu citlivosti 6.0.

2.5. Souhlas

účast na studii byla dobrovolná a studie byla provedena v souladu s etickými standardy Helsinské Deklarace z roku 1964. Studie byla schválena etickou komisí Fakultní nemocnice Edgar Santos, Bahia (protokol 104/012). Písemný informovaný souhlas byl získán od rodičů pacientů.

3. Výsledky a Diskuse

Mezi pacienty, tři (3, 5, a 6) byli muži, ve věkovém rozmezí od 6 do 38 let, a tři (1, 2, a 4) byly ženy, ve věkovém rozmezí od 7 do 20 let (Obrázek 1). Hlavní klinické nálezy u pacientů jsou uvedeny v tabulce 1. Jejich porodní váhy byly 2 SD pod průměrem, s výjimkou Pacientů, u 2 (3,700 g) a 5 (3,410 g). Hypertonie nahradila hypotonii u pacientů starších 15 let, s výjimkou pacienta 1. Pacient 6, kterému bylo v době této studie 38 let, začal mít šedivé vlasy ve věku 20 let; navíc byla během dospívání diagnostikována skolióza. Pacient 3, který byl ve věku 15 let, měl šedivé vlasy a mírný stupeň skoliózy.

()

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Obrázek 1

Obličejové rysy šest pacientů s 5p odstranění. (a)–(c)) pacient 1, ve věku 20 let ; Pacient 2 ve věku 7 let a pacient 3 ve věku 15 let . (d)–(f)) pacient 4 ve věku 15 let; pacient 5 ve věku 6 let; a pacient 8 ve věku 38 let . v letech v době snímku.

byly hodnoceny kognitivní aspekty, jazyk, mobilita, obratnost a stupeň autonomie v každodenních činnostech (Tabulka 2). Pokud jde o použití expresivního jazyka, pacienti 1, 4 a 5 mohli formulovat věty, ale pacient 5 měl omezenou slovní zásobu pro svůj věk. Ostatní pacienti vydávali pouze zvuky. Tři z pacientů (1, 4 a 5) chodili s rovnováhou a obratností a vykazovali jemné motorické schopnosti. Pacient 3 vykazoval charakteristické nemotorný chůze v důsledku hypertonie, a Pacient 2 (7 let) chodil s podporou a bez rovnováhy a měl potíže stojí, raději táhnout sám. Pacient 6 měl těžkou hypertonii a zřídka chodil. Pouze pacienti 1 a 4, jejichž intelektuální porucha byla středně závažná, vykazovali kontrolu svěrače. Pokud jde o autonomii, pacienti 1, 2, 4 a 5 se mohli živit.

Všichni pacienti měli přátelské osobnosti, ale potíže s přijetím omezení, a výbuchy nervozity, když naštvaný, byly hlášeny v průběhu alespoň některých obdobích jejich života. Pacienti 1, 4, a 5 ukázal vynikající schopnost komunikovat se svými vrstevníky, s dobrým porozuměním a schopnost se vyjádřit, včetně vyjadřování prostřednictvím řeči. Byli také schopni provádět každodenní činnosti, jako je oblékání, česání vlasů a stravování. Nemohli číst ani psát, i když se pacientka 1 naučila psát své jméno. U pacientů 2, 3, a 6 prezentovány s nejvíce významné problémy v chování, včetně hyperaktivity, opakující se pohyby, podrážděnost, upevnění na objekty, sebepoškozování (uvedení ruku do krku nebo kousání nebo škrábání se), a potíže v interakci s vrstevníky. Jejich úrovně intelektuálního postižení (ID), odrážející jejich fenotypy chování, se pohybovaly od 3, 5 do 7, 0 (Tabulka 2).

všichni pacienti měli cytogeneticky detekovatelnou deleci 5p. Analýza ryb odhalila, že subjekty neměly translokaci ani mozaiku. Profily array-CGH odhalily překrývající se delece 5p15. 33-p13 u 6 pacientů (Obrázek 2). Kromě toho byl u pacienta 4 detekován 3,5 Mb dup8p23.3-p23.2.

Obrázek 2

Geny na 5p15.33-13 s haploinsufficiency účinky (na základě on-Line Mendelian Inheritance in Man). Zelené vodorovné pruhy ukazují rozsah odstranění.

přehled genů a dalších loci mapovány na odstraněné oblasti byla provedena pomocí lidského genomu databází, jako je například on-Line Mendelian Inheritance in Man (OMIM®) a Encyklopedie Prvků DNA (ENCODE®). V překrývajících se oblastech odstraněných 5p u šesti pacientů byla přítomna řada prvků DNA, včetně genů/lokusů, prvků, které působí na úrovni proteinů a RNA, a regulačních prvků. Rozsah delecí se pohyboval od ~11,260 Mb u pacienta 1 do 28,680 Mb u pacienta 6 (Obrázek 2, Tabulka 3). Ztráta nejmenšího počtu genů (73 genů/lokusů) byla pozorována u pacienta 1. V dalších pacientů, 86 (Pacient 2), 89 (Pacient 3), 90 (Pacient 4) a 98 (Pacienti 5 a 6) geny byly ztraceny.

pacienti s CDCS jsou tradičně diagnostikováni na základě klinických projevů a konvenčních analýz chromozomů a / nebo ryb. Cytogenetická analýza pomocí GTG bandingu v kombinaci s podrobným klinickým hodnocením postačovala k diagnostice zde prezentovaných pacientů. Nicméně, mnohé studie prokázaly význam vymezení hranice a rozsahu odstraněné oblasti pro klinické charakterizace a stanovení prognózy a genotyp-fenotypové korelace . Rafinované molekulární techniky, jako je array-CGH, jsou vyžadovány pro přesnější analýzu hraničních bodů, potvrzení kritických oblastí a vyhodnocení nových změn .

jste stíhán je způsobena chromozomální přestavby vedoucí k odstranění celého krátké rameno chromozomu 5 nebo delece zahrnující 5p15.3 segment (5-40 Mb) . I když se jedná o dobře definovanou genomickou poruchu, jedinci s tímto syndromem vykazují fenotypovou a cytogenetickou variabilitu. Na genotypové heterogenity u pacientů v této studii byla úspěšně zkoumána pomocí array-CGH techniky, která umožnila identifikaci různých zarážky. Navíc, vypuštění velikost je spojena s klinickou prezentaci, s menší delece vedoucí k mírnější fenotypy, jako u Pacienta 1, který vykazoval mírné obličeje dysmorphism a lehkým mentálním postižením. Méně jsou postiženi zejména jedinci s vypuštěním 5p15. 1 nebo kteří vykazují mozaiku .

Haploinsuficience souvislých kandidátských genů v kritické oblasti je nejpravděpodobnější příčinou klasického spektra CDCS . Gu et al. studoval rodinnou 5p smazání syndrom vyplývající z vzácná, matky, komplexní chromozomální přestavby a identifikoval tři intersticiální delece v 5p15.33-p13.3 v nedotčeny dcera. Klinicky nejvýznamnější z těchto intersticiálních delecí byla delece 5p15. 31-p15. 33, která zahrnovala přibližně 2.89 Mb a kryl 11 známých genů, včetně LOC340094, ADAMTS16, KIAA0947, FLJ33360, MED10, UBE2QL1, LOC255167, NSUN2, SRD5A1, PAPD7, a MIR4278. Pouze několik z těchto genů bylo plně charakterizováno s ohledem na jejich funkce a asociace nemocí. Takové mikrodelece mohou představovat nepatogenní benigní varianty počtu kopií nebo vést k nepozorovatelným, menší klinické projevy.

Několik genů v 5p oblasti, jako jsou SEMA5A, CTNND2, a TERC, jsou zvláště zajímavé, protože jejich produkty hrají zásadní roli během embryonálního a neuronální vývoj . Tyto tři geny u našich pacientů chyběly a jejich nepřítomnost nemusí vysvětlovat mírnější kognitivní poškození pozorované u pacienta 1. Tyto geny pravděpodobně představují pouze část fenotypu delece 5p a souběžná ztráta dalších genů v této oblasti jistě hraje důležitou roli v klinických rysech pacientů. Přítomnost obou kopií CTNND2 u pacienta s menší cri-du-chat smazání může vysvětlit mírnější kognitivní poruchou ve srovnání s ostatními pacienty . Malé exonické delece CTNND2 byly také hlášeny u jedinců s nízkým normálním IQ a problémy s učením, s autistickými rysy nebo vývojovým zpožděním nebo bez nich .

použití array-CGH nám také umožnilo detekovat 3, 5 Mb duplikaci chromozomu 8 u pacienta 4, kromě delece terminálu 5p. Několik studií naznačuje, že duplikace 8p23. 3 lze považovat za euchromatické varianty bez fenotypových účinků . Zdvojení tohoto regionu byla již dříve detekovány pomocí RYB v oligoasthenozoospermic člověk a jeho normální matka a bratr a v sedmi dalších osob; nebyl předložen důkaz, že duplikace je normální varianta a zahrnuje stejné 2.5 Mb segmentu jako duplicitní v pacientovi v aktuální studii . Jedním z omezení této studie byla naše neschopnost rozlišovat mezi de novo a zdědil genomické nevyváženosti vzhledem k nedostupnosti buněk v suspenzi nebo DNA od rodičů. Nemohli jsme tedy vyloučit možnou přítomnost nevyvážené translokace zahrnující chromozom 8p23. 3.

v této studii jsme popsali sérii šesti pacientů s CDCS v různých stádiích vývoje. Tato longitudinální studie těchto pacientů ukázala, že některé rysy delece 5p se mění s věkem. Kulaté facie se s postupujícím věkem stávají dlouhými a úzkými. Typický kočičí výkřik přítomný při narození u všech pacientů byl spojen s následným zpožděním jazyka a obtížemi při osvojování jazyka. S výjimkou pacienta 1, který mluví srozumitelně, byla u všech ostatních pacientů pozorována těžká porucha učení. Tento mírnější fenotyp mohl být způsoben menší delecí kritické oblasti 5p u tohoto pacienta. Pacienti 2, 3 a 5 byli zpočátku hypotoničtí a později se stali hypertonickými, s obtížemi při chůzi. Všichni pacienti vykazovali neúspěch a krátkou postavu. Skoliózy a svalové a kosterní vady byly patent na Pacienta 6, který je nejstarší série a vykazovala známky předčasného stárnutí, šedivění vlasů, a nejistě získaných sociálních návyků. Jednalo se o nejvážněji postiženého pacienta a dostal malý včasný zásah a měl omezený společenský život.

Pacientů s větší delecí s breakpointy v proximální oblasti 5p14 a 5p13 mají tendenci mít více významné kognitivní poruchou. Ti, kteří mají menší delece s breakpointy v 5p15.3 vykazují méně významné problémy, jak je znázorněno na Pacienta 1, který vykazoval mírnější obličeje dysmorphisms a nízkým stupněm mentálního postižení. Méně jsou postiženi zejména jedinci s odstraněním 5p15.1 nebo kteří vykazují mozaiku . Zhang et al. provedli studii tří vícegenerační rodiny nesoucí 5p terminální delece různých velikostí (od 4.79 do 13.52 Mb) přenášena v autosomálně dominantním způsobem a zjistili, že to familiární smazání je vzácný prezentace zobrazení intra – a interfamilial fenotypové variability.

gen kódující telomerázy reverzní transkriptázy (hTERT) se nachází v 5p15.33, a jeho odstranění může přispět k fenotypové změny pozorované u dětí s jste stíhán . Dospělí s tímto syndromem vykazují dlouhou a úzkou tvář, divergentní strabismus, plný spodní ret, zubní malocclusion, výrazné nadočnicové oblouky, a předčasně prošedivělými vlasy . Hypotonie je nahrazena hypertonií s postupujícím věkem, což může souviset s vývojem skoliózy . S věkem se projevují další charakteristiky, jako je mikrocefalie. Pozice a vzhled uší se mohou také měnit s věkem .

předchozí studie ukázaly, že pacienti s delecí 5p13. 3 vykazují závažnější muskuloskeletální poruchy . Pacientka 1 (20 let) nevykazovala hypertonii a tento mírnější fenotyp byl spojen s malou velikostí jejího odstranění. Přestože všichni naši pacienti vykazovali mentální postižení, vykazovali velkou variabilitu v psychomotorickém a kognitivním vývoji. Podle Cerruti Mainardi et al. , všechny děti S 5p monosomií se mohou naučit chodit a některé se mohou živit od 4 let věku. Hrubé motorické dovednosti jsou přítomny přibližně u 92% těchto dětí a jemné motorické dovednosti, jako je použití tužky, jsou přítomny přibližně u 65% .

jazykové porozumění se u všech pacientů v průběhu pozorování výrazně zlepšilo. Tato zjištění naznačují, že u těchto pacientů by mělo být denně podporováno učení, včetně používání znakového jazyka jako komunikačního prostředku. Cornish a Pigram (1996) ověřili, že 25% jste stíhán pacienti jsou schopni používat řeč ke komunikaci, a to 55% neverbálním metody. Marignier a kol. hlásili dívku s CDCS (12,85 MB delece) s apraxií řeči během dětství a bez intelektuálního deficitu. Tito autoři dospěli k závěru, že příznaky mentálního postižení mohou být příliš interpretovány kvůli jejich spojení s poruchou jazyka a gestiky.

stereotypní chování bylo hlášeno u pacientů s delecí 5p, kteří vykazovali různé stupně tohoto chování napříč studiemi. Tato chování zahrnují opakující se pohyby, hyperaktivitu, sebepoškozování, agresivitu, tvrdohlavost, podrážděnost, nadměrnou náhlou radost, připoutanost a opakující se pohyby zahrnující objekty .

v této studii vedla některá maladaptivní chování ke spojení s poruchou autistického spektra, jak bylo pozorováno u pacienta 3. Ve skutečnosti, tento pacient je léčen na Sdružení Rodičů a Přátel Výjimečné Děti (APAE) a ukázal pokrok s ohledem na pozornost a vytvoření citové vazby. Nedávné celogenomové analýzy byla zjištěna genetická varianta v 5p14.1 (rs4307059), který je spojen s rizikem poruchy autistického spektra a sociální komunikace spektrum fenotypů v populaci . Další, další genomu-široký sdružení studie odhalila další polymorfní regiony v 5p spojených s kognitivní vývoj, deficit pozornosti, hyperaktivitou a autismem-jako chování .

hyperaktivita se vyskytuje častěji u mladších pacientů (přibližně 67% 10-až 15letých) a může se snižovat se zralostí a terapeutickým zásahem . Podobně lze minimalizovat další problémy s chováním včasnou a vhodnou léčbou.

Zhang et al. vyhodnotili klinické rysy velké kohorty pacientů s CDCS s proměnnou velikostí delece a typy chromozomálních aberací. Tito autoři navrhli, že přítomnost delecí ve třech oblastech 5p (MRI až MRIII) má různé účinky na výskyt mentálního postižení. Porovnali jsme nálezy u pěti pacientů z tohoto šetření (pacienti 1 až 5) s podobnými údaji u dříve hlášených pacientů . Pacient 6 byl z této analýzy vyloučen kvůli nedostatku podobných hraničních bodů jako u pacientů hlášených ve studii Zhang et al. . Na základě výsledků pro pacienty 4 a 5, kteří spadají mimo fenotypové spektrum popsané Zhangem et al. , je zřejmé, že jiné proměnné mohou ovlivnit fenotypy těchto pacientů (Tabulka 4).

i když 5p smazání je klinicky a geneticky dobře popsaný syndrom, fenotypová variabilita u pacientů naznačuje, že další modifikující faktory, včetně genetických a faktory životního prostředí, může mít vliv na pacienta klinické projevy . Dále, i když klinické prezentace spojené s kauzální abnormalit detekovaných u pacientů v naší studii byly pečlivě vyhodnoceny, je možné, že následné podrobné fyzikální vyšetření by mohla mít za následek identifikaci jemné fenotypové změny, které byly patrné u pacientů současné fázi vývoje.

důvody pro tyto paradoxní zjištění, zůstávají nejasné, ale nové přístupy zahrnující genomu-široký sdružení studie a bioinformatika-založené předpovědi genů a regulačních prvků a i epigenetické události, může povolit, aby pro lepší objasnění genotyp-fenotypové korelace v jste stíhán.

4. Závěry

překážky spojené s stanovení genotypu-fenotypu korelace v hodnocení komplex vlastností, jako je dysmorphisms a kognitivní a psychomotorický vývoj, ukazují, že genetické/epigenetické pozadí a faktory životního prostředí, musí být považovány pro všechny proměnné. Haploinsuficience genů CDCS může vést k vývojovým změnám ve specifických tkáních a může být užitečné vyšetřování expresních profilů kandidátských genů ve fetálních tkáních. Další výzkum expresních profilů těchto genů může odhalit ty, které se podílejí na vývoji fenotypu cri-du-chat a zlepšují korelace genotyp-fenotyp.

Další Body

Internetové zdroje jsou následující: Encyklopedie Prvků DNA, http://genome.ucsc.edu/ENCODE/ (20. prosince 2015), a on-Line Mendelovské Dědičnosti u Člověka (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/ (20. prosince 2015).

Konkurenční Zájmy

autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Poděkování

autoři by rádi poděkovali Suely Damasceno pro odběr krve, Marise Barbosa pro kontaktování pacientů, a rodinám za jejich spolupráci ve všech fázích této studie. Tato práce byla podpořena Brazilské Sítě Referenčních a Informace v Microdeletion Syndromes (RedeBRIM) (CNPq, Brazílie, Grant 402012/2010-0 a Grant 476783/2013-5) a Fundação de Amparo à Pesquisa dělat Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Brazílie, Grant 13/2028-6). Mariluce Riegel je částečně financována z grantu CNPq č. 305454/2014-5.