Cri-Du-Chat症候群：6人の患者における臨床プロファイルと染色体マイクロアレイ解析
要約
Cri-du-chat症候群は、5番染色体の短腕の欠失によって引き起こ 疾患の重症度、知的および発達遅延のレベル、および患者の予後は、欠失の大きさおよび位置に関連している。 遺伝子型-表現型相関を確立するために、我々は遺伝学コミュニティサービスで追跡された染色体5の短い腕の細胞遺伝学的に検出された欠失を運ぶ六人の患者を評価するためにアレイCGHを適用しました。 患者の細胞遺伝学的および臨床的プロファイルを再評価した。 データベースレビューは、この障害の特徴的な表現型および行動特性に関与する追加の遺伝子および調節要素を予測するために行われた。 アレイ-CGH分析は、約11.2Mbから28までのサイズの範囲であった末端欠失の描写を可能にした。6Mb、5p15.2から5p13までのブレークポイントがあります。 良性のコピー数の変化であると考えられる追加のdup(8)(p23)(3.5Mb)も一人の患者で観察されました。 計算した相関係数値は，発達遅延と欠失サイズとの間に弱い関係が存在することを示した。 遺伝的背景、家族歴、エピジェネティック因子、定量的形質遺伝子座多型、および環境因子も患者の表現型に影響を与える可能性があり、遺伝子型-表現型相関において考慮されなければならない。
1. はじめに
Cri-du-chat症候群（CDCS）（OMIM123450）は、1963年に染色体5の短腕の欠失を有する一連の患者が記載されたときに初めて同定された。 報告された表現型は、典型的な顔の異形、知的障害、および発達遅延に加えて、症候群の名前を提供し、人生の最初の年の間に甲高い、単調な、猫のような泣 この症候群の原因となる5p欠失は、50,000人中1人の出生率を有し、終末期（78％）、間質性（9％）、または不均衡な転座（5％）によって引き起こされる可能性がある。 症例の約80％において、これらの欠失はde novo事象である。
5p欠失表現型の原因である5p15.2と5p15.3の間に位置する重要な領域は、Niebuhrによって定義されました。 5p15.2の削除はこれらの患者の観察されたdysmorphismそして知的な不能、および5p15の近位領域に責任があるために報告されました。3は、”猫のような”叫びと音声遅延に関連付けられています。 分子研究は、病理学的徴候に対するこれらの領域の重要性を確認し、古典的表現型の異なる成分に個別に影響を与える特定の遺伝子の洗練を可能に
定量的PCRを介してcri-du-chat臨界領域における猫のような叫びの候補遺伝子を解析した。 臨床的に異なるＣＤＣＳ患者における二つの間質欠失の遠位ブレークポイントを解析した。 結果は、候補遺伝子、FLJ25076/UBC-E2、5p15.3-5p15.2にまたがるブレークポイント間のマッピングを明らかにした。 このセグメントの長さは640kbであり、胸部および頭皮組織で発現するユビキチン共役E2型酵素をコードしている。
CDCS臨界領域にマッピングされている他の遺伝子には、欠失染色体領域の少なくとも10％に及ぶセマフォリンF（SEMAF）遺伝子、および脳の発達に潜在的に関 これらの遺伝子は知的障害と関連している。 CTNND2は、脊椎およびシナプスの形態形成を調節し、発達中に海馬ニューロンで機能することが見出されており、神経回路の機能変化に寄与する可能性が
本調査では、アレイCGHを適用して、従来の細胞遺伝学的手法を用いて診断された六つのCDCS患者の小さいが非常に不均一なグループを分析しました。 この研究は、この症候群の表現型-遺伝子型相関に関する新しい疑問を提起する。 5p領域に位置する遺伝子/遺伝子座の機能のレビューが提示されています。
2. 材料および方法
2.1. サンプル選択
これは、6人のCDCS患者を対象に実施された共同縦断研究でした。 患者のほとんどは、微小欠失症候群（RedeBRIM）のための参照および情報のブラジルのネットワークと協力して、公共のコミュニティ遺伝サービスで最後の20年間 患者2、3、4、および5は人生の最初の年の間に診断され、患者1は5歳で診断され、最も古い患者（患者6）は16歳で診断された。
患者は数年にわたって定期的に再評価された。 精神運動発達評価は、個人的な観察、学校のパフォーマンス、および親の情報に基づいていました。 言語，社会的相互作用，集中／注意，衝動性，運動制御，知覚，学習と記憶などの日々の能力とスキルを記録した。 これらの知見とZhangらによって開発されたスケールの適応によると。 、各患者における知的障害の程度は、0（影響を受けない）から7（深く影響を受けた）の範囲の数値スケールで決定された。 削除サイズと知的障害（ID）の程度との間のピアソンの相関係数（）は、各患者について決定された。
2.2. 細胞遺伝学的分析
核型決定は、末梢血試料から調製した中期スプレッドに対して行われた。 染色体分析は、550バンド分解能でGTGバンディング後に行った。 各患者から少なくとも１ ５ ０個の細胞を分析した。
2.3. 蛍光In Situハイブリダイゼーション（FISH）
すべての患者について、CDCS領域（Cytocell、英国）のデュアルカラー市販プローブを使用して欠失を確認した。 5p15.2（赤色スペクトル）のためのCTNND2プローブは、D5S2883遺伝子座に相同な配列を含み、この遺伝子座の-159kbをカバーしています。 3（緑色スペクトル）のためのFLJ2507プローブは、D5S1637EおよびD5S2678遺伝子座に相同な配列を含み、これらの遺伝子座（-194kb）の両方をカバーしています。 5q35用のNSD1プローブ（Sotos領域）を対照（緑色スペクトル）として使用した。 ハイブリダイゼーションあたり少なくとも30細胞を分析した。
2.4. アレイ-CGH
欠失は、40kbの理論分解能を有する60merオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイを用いて全ゲノムアレイ-CGHによってマッピングされた(K,Agilent Technologies Inc.、サンタクララ、カリフォルニア州）。 標識化およびハイブリダイゼーションは、Agilent、2011によって提供されるプロトコルに従って実施した。 アレイを、マイクロアレイスキャナ（Ｇ２ ６ ０ ０Ｄ）および特徴抽出ソフトウェア（両方ともＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの）を使用して分析した。 画像解析は、感度しきい値6の統計アルゴリズムADM-2とAgilent Genomic Workbench Lite Edition6.5.0.18を使用して行われました。0.
2.5. 同意
この研究への参加は任意であり、この研究は1964年ヘルシンキ宣言の倫理基準に従って実施された。 この研究は、バイーア州エドガー-サントス大学病院の倫理委員会（プロトコル104/012）によって承認された。 患者の両親から書面によるインフォームドコンセントを得た。
3. 結果と考察
患者のうち、3人（3、5、および6）は男性であり、年齢は6歳から38歳まで、3人（1、2、および4）は女性であり、年齢は7歳から20歳までであった（図1）。 患者の主な臨床所見を表1に示す。 彼らの出生体重は、患者2（3,700g）および5（3,410g）を除いて、平均よりも2SDであった。 高血圧は、患者を除いて、15歳以上の患者で低血圧を置き換えました1. この研究の時点で38歳だった患者6は、20歳で灰色の髪を持ち始め、さらに、彼の青年期に脊柱側弯症と診断された。 患者3は15歳で、灰色の髪と適度な程度の脊柱側弯症を有していた。
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| M,male;F,female;最初の年の間に観察された特徴,現在ではない;+,現在存在する特徴;-,存在しない特徴; NA、利用できない情報;幼児期の間に訂正される変化;polydactyly、clinodactyly、および平らなフィートを含む奇形;中間simian折目。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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認知的側面、言語、移動性、器用さ、および日常活動における自律性の程度を評価した（表2）。 表現力豊かな言語の使用に関しては、患者1、4、および5は文章を定式化することができたが、患者5は彼の年齢のための限られた語彙を持っていた。 他の患者は音だけを発した。 患者（1、4、および5）の三は、バランスと器用さで歩いて、いくつかの細かい運動能力を示した。 患者3は、高緊張の結果として特徴的な不器用な歩行を示し、患者2（7歳）は、サポートとバランスなしで歩いて、自分自身をドラッグすることを好む、立って 患者6は重度の高血圧を有し、めったに歩いていなかった。 知的障害が中等度であった患者1および4のみが括約筋コントロールを示した。 自律性に関しては、患者1、2、4、および5は自分自身を養うことができた。
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| +, 現在;-,不在;ID,知的障害レベル;,小児期の緊張; 明確に複数の単語を話すことができないこと、非語化された発声と基本的なシンボリックジェスチャー。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
すべての患者はフレンドリーな性格を持っていたが、制限を受け入れることが困難であり、イライラしたときの緊張のバーストは、自分たちの生活の少な 患者1、4、および5は、良好な理解とスピーチを通じて自分自身を表現するなど、自分自身を表現する能力を持つ、仲間と対話する優れた能力を示した。 彼らはまた、ドレッシング、髪を梳き、食べるなどの毎日の活動を行うことができました。 彼らは読み書きができませんでしたが、患者1は彼女の名前を書く方法を学びました。 患者2、3、および6は、多動、反復的な動き、過敏性、物体への付着、自己切断（喉に手を入れたり、噛んだり、傷ついたりする）、および仲間との相互作用の難しさを含む最も重要な行動上の問題を提示した。 彼らの行動表現型を反映した彼らの知的障害（ID）レベルは、3.5から7.0の範囲であった（表2）。
すべての患者は細胞遺伝学的に検出可能な5p欠失を有していた。 魚の分析は、被験者が転座またはモザイクを持たないことを明らかにした。 アレイ-CGHプロファイルは、5p15.33-p13の重複欠失を6人の患者で明らかにした（図2）。 さらに、3.5Mbのdup8p23.3-p23.2が患者4で検出された。
欠失領域にマッピングされた遺伝子および他の遺伝子座のレビューを、オンラインＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ（登録商標））およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏ ｆ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ（登録商標））などのヒトゲノムデータベー 遺伝子/遺伝子座、タンパク質およびRNAレベルで作用する要素、および調節要素を含むDNA要素の様々な六つの患者の重複5p欠失領域に存在していた。 欠失の範囲は、患者１の〜１ １，２ ６ ０Ｍｂから患者６の２ ８，６ ８ ０Ｍｂまでの範囲であった（図２、表３）。 遺伝子の最小数（73遺伝子/遺伝子座）の損失は、患者1で観察されました。 他の患者では、86（患者2）、89（患者3）、90（患者4）、および98（患者5および6）の遺伝子が失われた。
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ＣＤＣＳ患者は、臨床症状および従来の染色体および／またはＦＩＳＨ分析に基づいて伝統的に診断される。 詳細な臨床評価と組み合わせたGTGバンディングによる細胞遺伝学的分析は、ここで提示された患者を診断するのに十分であった。 しかし、多くの研究は、ブレークポイントの区切りと臨床特性と予後と遺伝子型-表現型の相関を決定するための削除された領域の程度の重要性を示 このようなアレイCGHのような洗練された分子技術は、ブレークポイントのより正確な分析、臨界領域の確認、および新しい変化の評価のために必要とされ
CDCSは、染色体の再配列によって引き起こされ、染色体5の短腕全体の欠失または5p15.3セグメント（5-40Mb）を含む欠失につながる。 それが明確に定義されたゲノムの無秩序であるが、このシンドロームのショーの表現型および細胞遺伝学の可変性の個人。 本研究で患者で観察された遺伝子型の異質性は、明確なブレークポイントの同定を可能にするアレイ-CGH技術を用いて首尾よく調査された。 また、削除のサイズは、軽度の顔の異形性と軽度の知的障害を示した患者1で観察されるように、軽度の表現型につながる小さな欠失と、臨床的提示に関 特に、5p15.1の欠失を有する個人またはモザイク現象を示す個人は、より少ない影響を受ける。
臨界領域における連続した候補遺伝子のハプロイン不足は、古典的なCDCSスペクトルの最も可能性の高い原因である。 Gu et al. まれな、母体、複雑な染色体再配列から生じる家族性5p欠失症候群を研究し、影響を受けていない娘の5p15.33-p13.3内の三つの間質欠失を同定した。 これらの間質欠失の中で最も臨床的に関連性の高いものは、約2を包含する5p15.31-p15.33の欠失であった。およびＭＩＲ４ ２ ７ ８を含む１ １の既知の遺伝子を保有した。 これらの遺伝子のうちのいくつかだけが、それらの機能および疾患関連に関して完全に特徴付けられている。 このような微小欠失は、非病原性の良性コピー数変異体を表すか、または目立たない、マイナーな臨床症状をもたらす可能性があります。
SEMA5A、CTNND2、TERTなどの5p領域のいくつかの遺伝子は、それらの生成物が胚および神経発達の間に主要な役割を果たすため、特に関心があります。 これらの三つの遺伝子は、私たちの患者で欠落していた、と彼らの不在は、患者1で観察された軽度の認知障害を説明しないかもしれません。 これらの遺伝子はおそらく5p欠失表現型の一部のみを占め、この領域における他の遺伝子の付随する損失は確かに患者の臨床的特徴において重 Cri-du-chat欠失が小さい患者におけるCTNND2の両方のコピーの存在は、他の患者と比較して軽度の認知障害を説明するかもしれません。 CTNND2の小さいexonic欠失はまた自閉症の特徴または発達の遅れの有無にかかわらず低い正常なIQおよび学習問題の個人で、報告されました。
アレイCGHの使用はまた、私たちは5p末端欠失に加えて、患者4における染色体8の3.5Mbの重複を検出することができました。 いくつかの研究では、8p23.3の重複は表現型効果のない真色変異体とみなすことができることが示唆されている。 この領域の重複はoligoasthenozoospermic人および彼の正常な母および兄弟および他の七つの個人の魚を使用して前に検出されました;重複が正常な変形であり、現在の調査の患者で重複したそれと同じ2.5Mbの区分を含むこと証拠は示されました。 本研究の一つの制限は、親からの懸濁液またはDNA中の細胞の利用できないために、de novoと継承されたゲノムの不均衡を区別することができないこと したがって、我々は染色体8p23.3を含む不均衡な転座の可能性の存在を排除することができませんでした。
本研究では、開発の異なる段階にある一連の六つのCDCS患者について説明しました。 これらの患者のこの縦断研究は、5p欠失のいくつかの特徴が年齢とともに変化することを示している。 円形の顔は年齢の進歩と長く、狭くなります。 すべての患者において出生時に存在する典型的な猫の叫びは、その後の言語遅延および言語獲得の困難と関連していた。 分かりやすく話す患者1を除いて、他のすべての患者で重度の学習障害が観察された。 この軽度の表現型は、この患者における5p臨界領域のより小さな欠失によるものであった可能性がある。 患者2、3、および5は、最初は低張性であり、後に高張性になり、歩行が困難であった。 すべての患者は繁栄の失敗と低身長を示した。 脊柱側弯症と筋骨格系の欠陥は、シリーズの最も古い患者6で特許され、早期老化、灰色の髪、および不安定に取得された社会的習慣の兆候を示した。 これは最も深刻な影響を受けた患者であり、彼は早期介入をほとんど受けておらず、限られた社会生活を送っていた。
5p14および5p13の近位領域にブレークポイントを有するより大きな欠失を有する患者は、より有意な認知障害を有する傾向がある。 5p15.3のブレークポイントを持つ小さな削除を持っている人は、軽度の顔の異形と知的障害の低い程度を示した患者1に示すように、あまり重要な問 特に、5p15.1欠失を有する個人またはモザイク主義を示す個人は、より少ない影響を受ける。 張ら 常染色体優性的に送信される異なるサイズの5p末端欠失（4.79から13.52Mbの範囲）を運ぶ三つの多世代ファミリーの研究を実施しており、この家族性欠失
テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)をコードする遺伝子は5p15.33に位置し、その欠失はCDCSを持つ子供で観察された表現型の変化に寄与する可能性があります。 この症候群の成人は、長くて狭い顔、発散性斜視、完全な下唇、歯の不正咬合、顕著な眼窩上アーチ、および時期尚早に灰色の髪を示す。 低血圧は、脊柱側弯症の発症に関連する可能性のある加齢とともに高血圧に置き換えられます。 小頭症のような他の特徴は、年齢とともにより明らかになる。 耳の位置や外観も年齢とともに変化する可能性があります。
以前の研究では、5p13.3欠失を有する患者はより重度の筋骨格系障害を示すことが示されている。 患者1（20歳）は高緊張を提示しなかったし、この穏やかな表現型は彼女の削除の小さなサイズに関連付けられていた。 私たちの患者のすべてが知的障害を提示したが、彼らは精神運動と認知発達に大きな変動を示した。 Cerruti Mainardi et al. 、5p monosomyを持つすべての子供は歩くことを学ぶことができ、いくつかは4歳から始まる自分自身を養うことができます。 総運動能力は、これらの子供の約92％に存在し、鉛筆の使用などの細かい運動能力は、約65％に存在する。
言語理解は、観察の過程ですべての患者でかなり改善された。 これらの知見は、コミュニケーション手段としての手話の使用を含む、これらの患者のために毎日学習が奨励されるべきであることを示している。 CornishとPigram(1996)は、CDCS患者の25%が音声を使ってコミュニケーションをとることができ、55%が非言語的な方法を採用していることを確認しています。 マリニエ他 小児期および知的欠損のないスピーチの失行を伴うCDCS（12.85Mbの削除）を有する少女を報告している。 これらの著者らは、知的障害の兆候は、言語や身振りの障害との関連のために過度に解釈される可能性があると結論づけている。
ステレオタイプの行動は、5p欠失を有する患者において報告されており、これらの行動の程度は研究間で様々である。 これらの行動には、反復的な動き、多動、自己切断、攻撃性、頑固さ、過敏性、過度の突然の喜び、愛着、およびオブジェクトを含む反復的な動きが含まれます。
本研究では、患者3で観察されたように、いくつかの不適応行動が自閉症スペクトラム障害との関連をもたらした。 実際、この患者は例外的な子供の親そして友人の連合（APAE）で扱われ、注意および感情的な結束を確立することに関して進歩を示しました。 最近のゲノムワイド解析は、自閉症スペクトラム障害のリスクと一般集団における社会的コミュニケーションスペクトル表現型と関連している5p14.1(rs4307059)の遺伝的変異体を同定しました。 さらに、別のゲノムワイド関連研究は、認知発達、注意欠陥、多動性障害、および自閉症のような行動に関連する5pの追加の多型領域を明らかにした。
多動は若年患者（10歳から15歳の約67％）でより頻繁に起こり、成熟および治療介入とともに減少する可能性がある。 同様に、他の行動上の問題は、早期かつ適切な治療によって最小限に抑えることができる。
可変欠失サイズおよび染色体異常のタイプを有するCDCS患者の大規模なコホートの臨床的特徴を評価した。 これらの著者らは、三つの5p領域（MRIからMRIII）における欠失の存在が知的障害の発生に異なる影響を与えることを示唆している。 我々は、この調査から五人の患者（患者1-5）の所見を以前に報告された患者の同様のデータと比較した。 患者６は、Ｚｈａｎｇらによる研究で報告された患者のものと同様のブレークポイントの欠如のために、この分析から除外された。 . Ｚｈａｎｇらによって記載された表現型スペクトルの外にある患者４および５の結果に基づいて、患者４および５は、Ｚｈａｎｇらによって記載された表現型スペク 他の変数がこれらの患者の表現型に影響を及ぼし得ることは明らかである（表４）。
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| +, Ｉｄレベル、Ｚｈａｎｇらによる知的障害レベル。 . | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5p欠失は臨床的および遺伝的によく記述された症候群であるが、患者の間で観察された表現型の変動は、遺伝的および環境的要因を含む追加の改 さらに，患者で検出された原因異常に関連する臨床プレゼンテーションを慎重に評価したが，その後の詳細な身体検査により，患者の現在の発達段階では明らかではなかった微妙な表現型の変化が同定された可能性がある。
これらの逆説的な発見の理由は不明であるが、ゲノムワイドな関連研究や遺伝子や調節要素、さらにはエピジェネティックなイベントのバイオインフォマティクスに基づく予測を含む新しいアプローチは、CDCにおける遺伝子型-表現型相関のより良い解明を可能にする可能性がある。
4. 結論
異形性や認知-精神運動発達などの複雑な形質の評価における遺伝子型-表現型相関の決定に関連する障害は、遺伝的/エピジェネティックな背景と環境要因がすべての変数について考慮されなければならないことを示している。 ＣＤＣＳ遺伝子のハプロイン不足は特定の組織における発達変化をもたらす可能性があり，胎児組織における候補遺伝子の発現プロファイルの調査が有用である可能性がある。 これらの遺伝子の発現プロファイルのさらなる研究は、cri-du-chat表現型の開発に関与しているものを明らかにし、遺伝子型-表現型相関を改善することが
追加点
インターネットリソースは、Encyclopedia of DNA Elements,http://genome.ucsc.edu/ENCODE/(2015年12月20日)およびOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM),http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/(2015年12月20日)です。
競合する利益
著者らは、競合する利益を持たないと宣言している。
謝辞
著者らは、この研究のすべての段階での血液採取のためのSuely Damasceno、患者に連絡したMarise Barbosa、および家族に親切な協力に感謝したいと思います。 この研究は、微小欠失症候群におけるブラジルの参照情報ネットワーク（RedeBRIM）（CNPq、ブラジル、助成金402012/2010-0および助成金476783/2013-5）およびFundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul（FAPERGS、ブラジル、助成金13/2028-6）によってサポートされていた。 Mariluce RiegelはCNPqの補助金no.305454/2014-5によって部分的に資金を供給される。
