Cri-du-Chat syndrom: klinisk profil och kromosomal mikroarrayanalys hos sex patienter

Abstrakt

Cri-du-chat syndrom är en kromosomal störning orsakad av en radering av den korta armen av kromosom 5. Sjukdomens svårighetsgrad, nivåer av intellektuell och utvecklingsfördröjning och patientprognos har relaterats till raderingens storlek och position. Syftar till att etablera genotyp-fenotyp korrelationer, vi tillämpade array-CGH för att utvärdera sex patienter som bär cytogenetiskt detekterade deletioner av den korta armen av kromosom 5 som följdes vid en genetik samhällstjänst. Patienternas cytogenetiska och kliniska profiler omvärderades. En databasgranskning utfördes för att förutsäga ytterligare gener och reglerande element som är ansvariga för de karakteristiska fenotypiska och beteendemässiga egenskaperna hos denna störning. Array-CGH-analys möjliggjorde avgränsning av terminalalektionerna, som varierade i storlek från cirka 11,2 Mb till 28.6 Mb, med brytpunkter från 5p15.2 till 5p13. En ytterligare DUP (8) (p23) (3,5 Mb), som ansågs vara en godartad kopianummervariation, observerades också hos en patient. Det beräknade korrelationskoefficientvärdet indikerade närvaron av ett svagt samband mellan utvecklingsfördröjning och borttagningsstorlek. Genetisk bakgrund, familjehistoria, epigenetiska faktorer, kvantitativ egenskap locus polymorfismer, och miljöfaktorer kan också påverka patientens fenotyp och måste beaktas i genotyp-fenotyp korrelationer.

1. Inledning

Cri-du-chat syndrom (CDCS) (OMIM123450) identifierades först 1963 när en serie av tre patienter med deletioner av den korta armen av kromosom 5 beskrevs . De rapporterade fenotyperna inkluderade högfrekvent, monoton, kattliknande gråt under de första åren av livet, vilket gav syndromets namn, förutom typiska ansiktsdysmorfismer, intellektuell försämring och utvecklingsfördröjning. 5P-borttagningarna som orsakar detta syndrom har en förekomst av 1 av 50 000 levande födda och kan vara terminala (78%), interstitiella (9%) eller orsakade av obalanserade translokationer (5%) . I cirka 80 procent av fallen är dessa borttagningar de novo-händelser .

en kritisk region belägen mellan 5p15.2 och 5p15.3 som är ansvarig för 5P-deletionsfenotypen definierades av Niebuhr . Raderingen av 5p15.2 har rapporterats vara ansvarig för den observerade dysmorfismen och den intellektuella funktionsnedsättningen hos dessa patienter och den proximala regionen 5p15.3 har associerats med” catlike ” rop och talfördröjning . Molekylära studier har bekräftat betydelsen av dessa regioner för de patognomoniska tecknen och har möjliggjort förfining av de specifika gener som individuellt påverkar olika komponenter i den klassiska fenotypen .

Wu et al. analyserade kandidatgener för catlike cry i den kritiska regionen cri-du-chat via kvantitativ PCR. De distala brytpunkterna för två interstitiella deletioner i två kliniskt distinkta CDCS-patienter analyserades; en patient uppvisade det kattliknande gråtet och den andra inte. Resultaten avslöjade en kandidatgen, FLJ25076 / UBC-E2, kartläggning mellan brytpunkterna som spänner över 5p15.3-5p15.2. Detta segment är 640 kb långt och det kodar för ett ubiquitin-konjugerat E2-typ enzym uttryckt i bröst-och hårbottenvävnader.

andra gener som har kartlagts till CDCS-kritiska regionen inkluderar semaphorin F (SEMAF)-genen , som spänner över minst 10% av den borttagna kromosomala regionen och delta-catenin (CTNND2) – genen, som kodar för specifika neuronala proteiner som potentiellt är involverade i hjärnans utveckling. Dessa gener är förknippade med intellektuell funktionsnedsättning. CTNND2 har visat sig reglera ryggrad och synapsmorfogenes och att fungera i hippocampala neuroner under utveckling, och det kan bidra till funktionella förändringar i neurala kretsar .

i den aktuella undersökningen tillämpade vi array-CGH för att analysera en liten men mycket heterogen grupp av sex CDC-patienter diagnostiserade med konventionella cytogenetiska tekniker. Denna studie väcker nya frågor angående fenotyp-genotypkorrelationerna av detta syndrom. En översyn av funktionerna hos generna/loci som finns i 5P-regionen presenteras.

2. Material och metoder

2.1. Urval av prov

detta var en samarbetande longitudinell studie utförd på 6 CDCS-patienter. De flesta av patienterna följdes upp under de senaste 20 åren vid en allmän samhällsgenetisk tjänst i samarbete med det brasilianska nätverket för referens och Information för Mikrodeletionssyndrom (RedeBRIM). Patienter 2, 3, 4 och 5 diagnostiserades under det första leveåret, Patient 1 diagnostiserades vid 5 års ålder och den äldsta patienten (Patient 6) diagnostiserades vid 16 års ålder.

patienterna omvärderades regelbundet under flera år. Psykomotoriska utvecklingsbedömningar baserades på personliga observationer, skolprestanda och föräldrainformation. Dagliga förmågor och färdigheter, såsom språk, sociala interaktioner, koncentration/uppmärksamhet, impulsivitet, motorisk kontroll, uppfattning och lärande och minne, registrerades. Enligt dessa resultat och en anpassning av skalan utvecklad av Zhang et al. , graden av intellektuell funktionsnedsättning hos varje patient bestämdes i en numerisk skala från 0 (opåverkad) till 7 (djupt påverkad). Pearsons korrelationskoefficient () mellan borttagningsstorleken och graden av intellektuell funktionsnedsättning (ID) bestämdes för varje patient.

2.2. Cytogenetisk analys

karyotypning utfördes på metafasspridningar framställda från perifera blodprover. Kromosomanalys utfördes efter GTG-bandning vid en 550-bands upplösning. Minst 150 celler från varje patient analyserades.

2.3. Fluorescens in Situ hybridisering (FISH)

för alla patienter bekräftades borttagningen med användning av en kommersiell sond med dubbla färger för CDCS-regionen (Cytocell, Storbritannien). Ctnnd2-sonden för 5p15.2 (rött spektrum) innehåller en sekvens som är homolog med d5s2883 locus och täcker ~159 kb av detta locus. FLJ2507-sonden för 5p15.3 (grönt spektrum) innehåller sekvenser som är homologa med d5s1637e och D5S2678 loci och täcker båda dessa loci (~194 kb). Nsd1-sonden för 5q35 (Sotos-regionen) användes som en kontroll (grönt spektrum). Minst 30 celler per hybridisering analyserades.

2.4. Array-CGH

deletionerna kartlades av helgenom array-CGH med användning av en 60-mer oligonukleotidbaserad mikroarray med en teoretisk upplösning på 40 kb ( K, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Märkning och hybridisering utfördes enligt protokollen från Agilent, 2011. Arraysna analyserades genom att använda en microarray scanner (G2600D) och har extraktion programvara (version 9.5.1) (båda från Agilent Technologies). Bildanalyser utfördes med Agilent genomic Workbench Lite Edition 6.5.0.18 med den statistiska algoritmen ADM-2 Vid en känslighetströskel på 6.0.

2.5. Samtycke

deltagandet i studien var frivilligt och studien genomfördes i enlighet med de etiska normerna i Helsingforsdeklarationen från 1964. Studien godkändes av Etikutskottet vid Edgar Santos Universitetssjukhus, Bahia (protokoll 104/012). Skriftligt informerat samtycke erhölls från patienternas föräldrar.

3. Resultat och diskussion

bland patienterna var tre (3, 5 och 6) män, med åldrar från 6 till 38 år och tre (1, 2 och 4) kvinnor, med åldrar från 7 till 20 år (Figur 1). De viktigaste kliniska resultaten för patienterna presenteras i Tabell 1. Deras födelsevikt var 2 SD under medelvärdet, med undantag för patienter 2 (3 700 g) och 5 (3 410 g). Hypertoni ersatte hypotoni hos patienter äldre än 15 år, exklusive Patient 1. Patient 6, som var 38 år vid tidpunkten för denna studie, började ha grått hår vid 20 års ålder; dessutom diagnostiserades skolios under hans ungdom. Patient 3, som var 15 år, hade grått hår och en måttlig grad av skolios.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 1

ansiktsdrag hos de sex patienterna med 5P-radering. ((A)–(c)) Patient 1, vid 20 års ålder ; Patient 2, vid 7 års ålder; och Patient 3, vid 15 års ålder . (d)–(f)) Patient 4, vid 15 års ålder ; Patient 5, vid 6 års ålder ; och Patient 8, vid 38 års ålder . i år vid tidpunkten för bilden.

kognitiva aspekter, språk, rörlighet, fingerfärdighet och graden av autonomi i dagliga aktiviteter bedömdes (Tabell 2). När det gäller användningen av uttrycksfullt språk kunde patienter 1, 4 och 5 formulera meningar, men patient 5 hade ett begränsat ordförråd för sin ålder. De andra patienterna avgav bara ljud. Tre av patienterna (1, 4 och 5) gick med balans och fingerfärdighet och visade några fina motoriska förmågor. Patient 3 uppvisade en karakteristisk klumpig promenad som ett resultat av hypertoni, och Patient 2 (7 år) gick med stöd och utan balans och hade svårt att stå och föredrog att dra sig själv. Patient 6 hade svår hypertoni och gick sällan. Endast patienter 1 och 4, vars intellektuella försämring var måttlig, fick sphincterkontroll. När det gäller autonomi kunde patienterna 1, 2, 4 och 5 mata sig själva.

alla patienter hade en vänlig personlighet men svårigheter med att acceptera gränser, och utbrott av nervositet när irriterade rapporterades under åtminstone vissa perioder av deras liv. Patienter 1, 4 och 5 visade en utmärkt förmåga att interagera med sina kamrater, med god förståelse och förmågan att uttrycka sig, inklusive att uttrycka sig genom tal. De kunde också utföra dagliga aktiviteter, som att klä sig, kamma håret och äta. De kunde inte läsa eller skriva, även om Patient 1 hade lärt sig att skriva hennes namn. Patienter 2, 3 och 6 presenterade de mest signifikanta beteendeproblemen, inklusive hyperaktivitet, repetitiva rörelser, irritabilitet, anknytning till föremål, självstympning (sätta en hand i halsen eller bita eller skrapa sig) och svårigheter att interagera med kamrater. Deras intellektuella funktionshinder (ID) nivåer, som återspeglar deras beteendefenotyper, varierade från 3,5 till 7,0 (Tabell 2).

alla patienter hade en cytogenetiskt detekterbar 5P-deletion. FISKANALYS avslöjade att ämnena inte hade någon translokation eller mosaicism. Array-CGH-profilerna avslöjade överlappande raderingar av 5p15.33-p13 hos de 6 patienterna (Figur 2). Dessutom detekterades en 3, 5 Mb dup8p23.3-p23.2 hos Patient 4.

Figur 2

gener på 5p15.33-13 med haploinsufficienseffekter (baserat på Online Mendelian arv hos människa). De gröna horisontella staplarna visar omfattningen av borttagningarna.

en genomgång av generna och andra loci mappade till den borttagna regionen utfördes med hjälp av humana genomdatabaser, såsom Online Mendelian arv i människan (omim brasilian) och Encyclopedia of DNA Elements (koda brasilian). En mängd olika DNA-element, inklusive gener / loci, element som verkar vid protein-och RNA-nivåerna och regulatoriska element, var närvarande i de överlappande 5P-raderade regionerna hos de sex patienterna. Omfattningen av borttagningarna varierade från ~11 260 Mb hos Patient 1 till 28 680 Mb hos Patient 6 (figur 2, Tabell 3). Förlust av det minsta antalet gener (73 gener/loci) observerades hos Patient 1. Hos de andra patienterna förlorades 86 (Patient 2), 89 (Patient 3), 90 (Patient 4) och 98 (patienter 5 och 6) gener.

CDCS-patienter diagnostiseras traditionellt baserat på kliniska manifestationer och konventionella kromosom-och/eller FISKANALYSER. Cytogenetisk analys genom GTG banding i kombination med en detaljerad klinisk utvärdering var tillräcklig för att diagnostisera de patienter som presenterades här. Många studier har dock visat vikten av avgränsning av brytpunkterna och omfattningen av den borttagna regionen för klinisk karakterisering och bestämning av prognos och genotyp-fenotypkorrelationer . Raffinerade molekylära tekniker, såsom array-CGH, krävs för mer exakt analys av brytpunkter, bekräftelse av kritiska regioner och utvärdering av nya förändringar .

CDCS orsakas av kromosomala omarrangemang som leder till radering av hela den korta armen av kromosom 5 eller en radering som omfattar 5p15.3-segmentet (5-40 Mb) . Även om det är en väldefinierad genomisk störning, visar individer med detta syndrom fenotypisk och cytogenetisk variation. Den genotypiska heterogeniteten som observerades hos patienterna i denna studie undersöktes framgångsrikt genom användning av array-CGH-tekniken, vilket möjliggjorde identifiering av distinkta brytpunkter. Dessutom är deletionsstorleken associerad med den kliniska presentationen, med mindre deletioner som leder till mildare fenotyper, som observerats hos Patient 1, som uppvisade mild ansiktsdysmorfism och mild intellektuell funktionsnedsättning. I synnerhet påverkas individer med en radering av 5p15.1 eller som uppvisar mosaicism mindre .

Haploinsufficiens hos angränsande kandidatgener i den kritiska regionen är den mest troliga orsaken till det klassiska CDCS-spektrumet . Gu et al. studerade ett familjärt 5P-deletionssyndrom till följd av en sällsynt, moderlig, komplex kromosomal omläggning och identifierade tre interstitiella deletioner inom 5p15.33-p13.3 hos en opåverkad dotter. Den mest kliniskt relevanta av dessa interstitiella deletioner var en deletion av 5p15.31-p15.33 som omfattade ungefär 2.89 Mb och innehöll 11 kända gener, inklusive LOC340094, ADAMTS16, KIAA0947, FLJ33360, med10, UBE2QL1, LOC255167, NSUN2, SRD5A1, PAPD7 och MIR4278. Endast ett fåtal av dessa gener har karakteriserats fullt ut med avseende på deras funktioner och sjukdomsföreningar. Sådana mikrodeletioner kan representera icke-patogena godartade kopianummervarianter eller resultera i obemärliga, mindre kliniska manifestationer.

flera gener i 5P-regionen, såsom SEMA5A, CTNND2 och TERT, är av särskilt intresse eftersom deras produkter spelar stora roller under embryonal och neuronal utveckling . Dessa tre gener saknades hos våra patienter, och deras frånvaro kan inte förklara den mildare kognitiva försämringen som observerats hos Patient 1. Dessa gener står förmodligen för endast en del av 5P-deletionsfenotypen, och samtidig förlust av andra gener i denna region spelar verkligen en viktig roll i patienternas kliniska egenskaper. Närvaron av båda kopiorna av CTNND2 hos patienten med den mindre cri-du-chat-raderingen kan förklara den mildare kognitiva försämringen jämfört med de andra patienterna . Små exoniska deletioner av CTNND2 har också rapporterats hos individer med låg normal IQ och inlärningsproblem, med eller utan autistiska egenskaper eller utvecklingsfördröjning .

användningen av array-CGH gjorde det också möjligt för oss att upptäcka en 3,5 Mb duplicering av kromosom 8 hos Patient 4, förutom 5P-terminalavlägsnandet. Flera studier har föreslagit att dubbleringar av 8p23 .3 kan betraktas som eukromatiska varianter utan fenotypiska effekter. En dubblering av denna region upptäcktes tidigare med hjälp av fisk i en oligoasthenozoospermisk man och hans normala mor och bror och hos sju andra individer; bevis presenterades att dupliceringen är en normal variant och involverar samma 2,5 Mb-segment som det som dupliceras i patienten i den aktuella studien . En begränsning av den aktuella studien var vår oförmåga att skilja mellan de novo och ärvda genomiska obalanser på grund av otillgängligheten av celler i suspension eller DNA från föräldrarna. Således kunde vi inte utesluta den möjliga närvaron av en obalanserad translokation som involverar kromosom 8p23.3.

i den aktuella studien har vi beskrivit en serie av sex CDCS-patienter i olika utvecklingsstadier. Denna longitudinella studie av dessa patienter har visat att vissa funktioner i 5P-radering förändras med åldern. De runda faciesna blir långa och smala med stigande ålder. Det typiska kattropet som var närvarande vid födseln hos alla patienter var förknippat med efterföljande språkfördröjning och svårigheter med språkförvärv. Med undantag för Patient 1, som talar begripligt, observerades allvarlig inlärningssvårighet hos alla andra patienter. Denna mildare fenotyp kan ha bero på den mindre borttagningen av 5P-kritiska regionen hos denna patient. Patienter 2, 3 och 5 var initialt hypotoniska och blev senare hypertoniska, med svårigheter att gå. Alla patienter uppvisade misslyckande att trivas och kort statur. Skolios och muskuloskeletala defekter var patenterade hos Patient 6, som är den äldsta i serien och visade tecken på för tidigt åldrande, grått hår och osäkert förvärvade sociala vanor. Detta var den mest drabbade patienten, och han hade fått lite tidigt ingripande och hade ett begränsat socialt liv.

patienter med större deletioner med brytpunkter i de proximala regionerna 5p14 och 5p13 tenderar att ha mer signifikant kognitiv försämring. De som har mindre raderingar med brytpunkter i 5p15.3 uppvisar mindre signifikanta problem, som visas i Patient 1, som uppvisade mildare ansiktsdysmorfismer och en låg grad av intellektuell funktionsnedsättning. I synnerhet påverkas individer med en 5p15.1-radering eller som uppvisar mosaicism mindre . Zhang et al. har genomfört en studie av tre multigenerationsfamiljer som bär 5P-terminala deletioner av olika storlekar (från 4, 79 till 13, 52 Mb) överförda på ett autosomalt dominerande sätt och har observerat att denna familjära deletion är en sällsynt presentation som visar intra – och interfamilial fenotypisk variabilitet.

genen som kodar för telomeras omvänt transkriptas (hTERT) ligger i 5p15.33, och dess radering kan bidra till de fenotypiska förändringar som observerats hos barn med CDC . Vuxna med detta syndrom uppvisar ett långt och smalt ansikte, en divergerande strabismus, en full underläpp, tandmaloklusion, framträdande supraorbitala bågar och för tidigt grått hår . Hypotoni ersätts med hypertoni med stigande ålder, vilket kan relateras till utvecklingen av skolios . Andra egenskaper blir tydligare med åldern, såsom mikrocefali. Öronens positioner och utseende kan också förändras med åldern .

tidigare studier har visat att patienter med 5p13 .3 deletion uppvisar allvarligare muskuloskeletala störningar. Patient 1 (20 år gammal) presenterade inte hypertoni, och denna mildare fenotyp var associerad med den lilla storleken på hennes radering. Även om alla våra patienter uppvisade intellektuell funktionsnedsättning uppvisade de stor variation i psykomotorisk och kognitiv utveckling. Enligt Cerruti Mainardi et al. , alla barn med 5P monosomi kan lära sig att gå, och vissa kan mata sig från och med 4 års ålder. Grovmotorik finns hos cirka 92% av dessa barn, och finmotorik, såsom användning av en penna, finns i cirka 65% .

språkförståelsen förbättrades avsevärt hos alla patienter under observationerna. Dessa resultat tyder på att lärande bör uppmuntras dagligen för dessa patienter, inklusive användning av teckenspråk som ett kommunikationsmedel. Cornish och Pigram (1996) har verifierat att 25% av CDCS-patienterna kan använda tal för att kommunicera och att 55% använder icke-verbala metoder. Marignier et al. har rapporterat en tjej med CDCS (12,85 Mb radering) med apraxi av tal under barndomen och utan intellektuellt underskott. Dessa författare har dragit slutsatsen att tecknen på intellektuell funktionsnedsättning kan övertolkas på grund av deras föreningar med språk-och gestikulär försämring.

stereotypa beteenden har rapporterats hos patienter med 5P-radering, som har visat varierande grader av dessa beteenden över studier. Dessa beteenden inkluderar repetitiva rörelser, hyperaktivitet, självstympning, aggressivitet, envishet, irritabilitet, överdriven plötslig glädje, anknytning och repetitiva rörelser som involverar föremål .

i den aktuella studien ledde vissa maladaptiva beteenden till en association med autistisk spektrumstörning, som observerats hos Patient 3. Faktum är att denna patient behandlas vid Association of Parents and Friends of Exceptional Children (APAE) och har visat framsteg med avseende på uppmärksamhet och upprättande av affektiva band. En ny genomanalys har identifierat en genetisk variant i 5p14 .1 (rs4307059) som är associerad med risken för autismspektrumstörning och med social kommunikationsspektrumfenotyper i den allmänna befolkningen. Vidare har en annan genomövergripande associeringsstudie avslöjat ytterligare polymorfa regioner i 5p associerade med kognitiv utveckling, uppmärksamhetsunderskott, hyperaktivitetsstörning och autismliknande beteende .

hyperaktivitet förekommer oftare hos yngre patienter (cirka 67% av 10 – till 15-åringar) , och det kan minska med mognad och terapeutisk intervention . På samma sätt kan andra beteendeproblem minimeras genom tidig och lämplig behandling.

Zhang et al. har utvärderat de kliniska egenskaperna hos en stor kohort av CDCS-patienter med varierande deletionsstorlekar och typer av kromosomavvikelser. Dessa författare har föreslagit att förekomsten av borttagningar i tre 5P-regioner (Mr till MRIII) har olika effekter på förekomsten av intellektuell funktionsnedsättning. Vi jämförde resultaten för fem patienter från denna undersökning (patienter 1 till 5) med liknande data för tidigare rapporterade patienter . Patient 6 uteslöts från denna analys på grund av bristen på liknande brytpunkter som de patienter som rapporterades i studien av Zhang et al. . Baserat på resultaten för patienter 4 och 5, som faller utanför det fenotypiska spektrum som beskrivs av Zhang et al. , är det uppenbart att andra variabler kan påverka fenotyperna hos dessa patienter (Tabell 4).

även om 5P-radering är ett kliniskt och genetiskt väl beskrivet syndrom, tyder den fenotypiska variationen som observerats bland patienter på att ytterligare modifierande faktorer, inklusive genetiska och miljömässiga faktorer, kan påverka patienternas kliniska manifestationer . Vidare, även om de kliniska presentationerna associerade med de kausala abnormiteter som upptäcktes hos patienterna i vår studie utvärderades noggrant, är det möjligt att efterföljande detaljerade fysiska undersökningar kunde ha resulterat i identifiering av subtila fenotypiska förändringar som inte var uppenbara vid patientens nuvarande utvecklingsstadium.

orsakerna till dessa paradoxala fynd är fortfarande oklara, men nya tillvägagångssätt som involverar genomövergripande associeringsstudier och bioinformatikbaserade förutsägelser av gener och regulatoriska element och till och med epigenetiska händelser kan möjliggöra bättre belysning av genotyp-fenotypkorrelationer i CDC.

4. Slutsatser

de hinder som är förknippade med bestämning av genotyp-fenotypkorrelationer vid utvärdering av komplexa egenskaper, såsom dysmorfismer och kognitiv och psykomotorisk utveckling, indikerar att den genetiska/epigenetiska bakgrunden och miljöfaktorerna måste beaktas för alla variabler. HAPLOINSUFFICIENCY av CDCS-gener kan resultera i utvecklingsförändringar i specifika vävnader, och undersökning av expressionsprofilerna för kandidatgener i fostervävnader kan vara användbar. Ytterligare forskning om uttrycksprofilerna för dessa gener kan avslöja de som är involverade i utvecklingen av cri-du-chat-fenotypen och förbättra korrelationer mellan genotyp och fenotyp.

ytterligare poäng

Internetresurser är följande: Encyclopedia of DNA Elements, http://genome.ucsc.edu/ENCODE/ (20 December 2015) och Online Mendelian arv i människan (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/ (20 December 2015).

konkurrerande intressen

författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

bekräftelser

författarna vill tacka Suely Damasceno för blodinsamling, Marise Barbosa för att kontakta patienterna och familjerna för deras vänliga samarbete i alla stadier av denna studie. Detta arbete stöddes av det brasilianska nätverket av referens – och Information i Mikrodeletionssyndrom (RedeBRIM) (CNPq, Brasilien, Grant 402012/2010-0 och Grant 476783/2013-5) och Funda Exceptiono de Amparo Ukrainian pesquisa do Estado do Rio Grande Do Sul (fapergs, Brasilien, Grant 13/2028-6). Mariluce Riegel finansieras delvis av CNPq Grant no. 305454/2014-5.