Entwicklung von Chitosan-Nanopartikeln als stabiles Drug-Delivery-System für Protein/siRNA

Abstract

Chitosan-Nanopartikel (CS-NPs) weisen gute physikalisch-chemische Eigenschaften als Drug-Delivery-Systeme auf. Ziel dieser Studie ist es, die Modulation präparativer Parameter auf die physikalischen Eigenschaften und die kolloidale Stabilität von CS-NPs zu bestimmen. CS-NPs wurden vor der Bestimmung ihrer Lagerstabilität durch ionische Wechselwirkung mit Dextransulfat (DS) hergestellt. Die kleinsten CS-NPs von nm mit einer Oberflächenladung von mV wurden erzeugt, wenn CS und DS bei pH 4 und mit einem DS: CS-Massenverhältnis von 0,5: 1 gemischt wurden. Eine Einschlusseffizienz von 98% wurde erreicht, wenn BSA / siRNA in die Nanopartikel geladen wurde. Die Ergebnisse zeigten auch, dass Partikelgröße und Oberflächenladung von CS-NPs bei Lagerung bei 4 ° C bis zu 2 Wochen leicht verändert waren. Zusammenfassend waren NPs bei 4 ° C ausreichend stabil und in der Lage, Protein zu transportieren und zu schützen.

1. Einleitung

Endogene Peptide, Proteine und Oligonukleotide gehören zu den wichtigsten Arzneimitteln, die aufgrund ihres großen Potenzials bei der Behandlung chronischer Krankheiten viel Aufmerksamkeit erregen . Die extreme In-vivo-Umgebung des menschlichen Körpers hat jedoch die therapeutischen Anwendungen dieser Substanzen immer eingeschränkt . Polymere Nanopartikel haben aufgrund ihrer Fähigkeit, die physiologischen Barrieren zu überwinden und die geladenen Substanzen zu schützen und auf bestimmte Zellen abzuzielen, viel Aufmerksamkeit als Abgabesysteme auf sich gezogen . Natürlich vorkommende Polymere wie Chitosan (CS) wurden untersucht, um Nanopartikel zu bilden . CS ist ein biologisch abbaubares Polysaccharid und stammt aus der Deacetylierung von Chitin. Neben seiner Biokompatibilität tragen auch die geringen Toxizitäts-, hämostatischen und bakteriostatischen Eigenschaften zu seinen verschiedenen Anwendungen im pharmazeutischen Bereich bei. Mehrere Anionen wurden untersucht, um CS wie Natriumsulfat und Dextransulfat (DS) zu vernetzen . DS ist in der Lage, die Protein- und siRNA-Einschlusseffizienz (EE) ohne Verwendung von Härtungsmitteln zu modifizieren und die Geschwindigkeit der Wirkstofffreisetzung aufgrund seiner hohen Ladungsdichte zu steuern. Abgesehen davon, dass DS ein billiges Material ist, produziert es mechanisch stabilere Nanopartikel als das Pentanatriumtripolyphosphat (TPP) .

Mehrere Studien hatten über die einzigartigen Eigenschaften von Chitosan-Nanopartikeln (CS NPs) unter Verwendung von DS berichtet. Die Modulation präparativer Parameter auf ihre physikalischen Eigenschaften ist jedoch noch nicht vollständig untersucht, beispielsweise der Einfluss der sterischen Behinderung auf die elektrostatische Anziehung zwischen CS und BSA . Darüber hinaus hängt die Determinante eines erfolgreichen Arzneimittelabgabesystems von seinen physikalischen Eigenschaften und seiner Stabilität ab. Daher waren die Ziele der vorliegenden Studie, präparative Parameter zu modulieren, um nanoskalige Partikel von CS NPs zu erhalten und ihre kolloidale Stabilität bei verschiedenen Lagertemperaturen und in verschiedenen Suspensionsmedien zu bestimmen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

Niedermolekulares Chitosan (70 kDa mit dem Deacetylierungsgrad 75% -85%), Essigsäure-Glazial, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Rinderserumalbumin (BSA, 46 kDa) und Bradford-Reagenz wurden von Sigma-Aldrich Inc. gekauft., USA. Doppelsträngige siRNA (sense: 5′-GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisense: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) wurde von Thermoscientific Dharmacon, USA, gekauft. Dextransulfat (DS) wurde von Fisher Scientific, UK, gekauft. Protein Ladder (High Range), Laemmli-Probenpuffer, 10x Tris/Glycin/Natriumdodecylsulfat-Puffer, Ammoniumpersulfat, Tetramethylendiamin (TEMED), 2% bis-Lösung und 40% Acrylamid-Lösung wurden von Bio-Rad, USA, bezogen. Tris-HCl-Puffer wurde von Invitrogen, USA, erhalten. Alle anderen verwendeten Chemikalien waren von analytischer Qualität.

2.2. Herstellung von Leer- und BSA-beladenem CS NPs

CS- und DS-Lösung wurden in 1% iger v / v-Essigsäure bzw. destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von 1 M NaOH oder 1 M HCl auf pH 4 eingestellt. DS-Lösung (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% und 0,25% w/v) wurde unter magnetischem Rühren (WiseStir Digital Multipoint Magnetic Stirrer MS-MP8, DAIHAN Scientific, Korea) bei 250 U / min für 15 min zu einer CS-Lösung (0,1% w/v) getropft, um Nanopartikel zu bilden. Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt. Die resultierenden Nanopartikel wurden gewaschen und durch Ultrazentrifugation (Optima L-100 XP Ultrazentrifuge mit einem Rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) zweimal bei 12 500 U / min für 15 min bei 10 ° C geerntet. Zur BSA-Assoziation in CS-NPs wurde BSA in CS-Lösung (0,1% w / v, pH 4) gelöst, um eine Endkonzentration von 1 mg / ml zu erhalten. BSA-beladene CS-NPs wurden dann nach dem obigen Verfahren hergestellt. Zur siRNA-Assoziation zu CS-NPs wurden 3 µL siRNA (15 µg/µL) in entionisiertem Wasser zu DS-Lösung gegeben (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, und 0,25% w/v), bevor diese zu CS-Lösung (0,1% w/v) getropft wird.

2.3. Elektrophoretische Mobilitätsstudie

Elektrophoretische Mobilitätsmessungen () von CS NPs wurden mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) durchgeführt und gegen die Wartezeit gemessen. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung analysiert.

2.4. Nanopartikel Charakterisierung

Partikelgröße, Oberflächenladung und Polydispersitätsindex (PDI) von frisch hergestellten CS-NPs wurden unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK) basierend auf den Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) -Techniken gemessen. Während der Analyse wurden keine Verdünnungen durchgeführt. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung analysiert. Die Messungen erfolgten bei 25°C

2,5. Morphologische Analyse

Morphologische Charakterisierung von unbeladenen CS NPs, BSA /siRNA beladenen CS NPs (DS : CS Gewichtsverhältnis von 0,5 : 1, 1 : 1) wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Niederlande) durchgeführt.

2.6. BSA/siRNA-Einschlusseffizienz

BSA/siRNA-beladene CS-NPs wurden durch Ultrazentrifugation (Optima L-100 XP Ultrazentrifuge mit Rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, USA) bei 14000 U/ min für 30 min von der Lösung getrennt. Aus der Zentrifugation gewonnene Überstände wurden dekantiert. Der BSA-Gehalt im Überstand wurde mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bei 595 nm (U.V-1601; Shimadzu, Japan) unter Verwendung des Bradford-Protein-Assays gemäß Herstelleranweisung analysiert. Der siRNA-Gehalt im Überstand wurde mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bei 260 nm analysiert. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt und vermessen. Die BSA/siRNA-Einschlusseffizienz (EE) wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:

2.7. Stabilität von CS NPs

Frisch zubereitetes CS NPs (hergestellt aus 0,05% und 0,1% w/v DS- und CS-Lösung, bzw.) wurden vor der Lagerung 15 min bei 12 500 rpm zentrifugiert. Nach Ultrazentrifugation wurden die erhaltenen Pellets entweder in destilliertem Wasser (gemessener pH-Wert von 6,6) oder PBS pH 7,4 resuspendiert. Die Partikelgröße und die Oberflächenladung wurden bei vorbestimmten Lagerzeitdauern gemessen (0, 1, 2, 3, 5, 8, und 14 Tage) und entweder bei Umgebungstemperatur oder 4°C.

2.8. In Vitro Drug Release Study

Die Freisetzung von BSA/siRNA wurde aus CS-NPs mit dem höchsten EE bestimmt (DS :CS-Verhältnis 1 :1, EE = 98% ± 0,2 bzw.). BSA/siRNA-beladene CS-NPs wurden in Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4, 4 ml) suspendiert und auf einen Magnetrührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 100 upm bei 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Deutschland) für 48 h bei 37°C In vorgegebenen Zeitintervallen (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, und 48 h) wurden die Proben bei 14 000 rpm für 30 min bei 10°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand dekantiert und durch ein äquivalentes Volumen frischer Pufferlösung ersetzt. Die Menge an freigesetzter BSA/siRNA im Überstand wurde mit einem UV-Vis-Spektralphotometer (U.V-1601; Shimadzu, Japan) bei einer Wellenlänge von 280 bzw. 260 nm analysiert.

2.9. BSA-Integrität

Die Integrität von aus CS-NPs freigesetztem BSA wurde mittels SDS-PAGE (12% Auflösung und 10% Stapelgel) unter Verwendung des Mini-Protein-Systems (Bio-Rad, USA) bestimmt. BSA-Proben wurden mit Laemmli-Probenpuffer im Verhältnis 1:1 gemischt und 5 min auf 95°C erhitzt. Proben (15 µL) wurden in die Vertiefungen geladen und das Gel wurde unter Verwendung einer Mini-Protein-System-Tetra-Zelle bei einer konstanten Spannung von 150 V für 90 min mit einem laufenden Puffer, der 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% SDS bei pH 8,3 enthielt, betrieben. Die Probenbanden wurden 40 min mit 0,1%iger Coomassie-Blau-Lösung enthaltend 40% Essigsäure und 10% Methanol angefärbt, gefolgt von einer Färbung über Nacht mit einer Lösung aus 40% Essigsäure und 10% Methanol.

2.10. Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Analyse (ANOVA-Test und Posthoc-Analyse von Tukey) wurde unter Verwendung des Statistical Package for the Social (SPSS) -Programms Version 15 durchgeführt. Ein Wert < 0,05 zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen dem Mittelwert der getesteten Gruppen.

3. Ergebnisse

3.1. Partikelgröße und Oberflächenladung

Abbildung 1(a) zeigt die Ergebnisse der Elektromobilität () gegen die Wartezeit. Aus der Grafik konnte beobachtet werden, dass das Plateau nach 30 min konstant blieb. Dies zeigt, dass die Bildung einer stabilen elektrischen Doppelschicht (e.d.l.) nicht augenblicklich erfolgte, sondern einige Momente erforderte. Die Auswirkungen zwischen der CS-Konzentration und den DS-Endkonzentrationen auf die Größe der CS-NPs sind in Abbildung 1 (b) dargestellt. Es wurde beobachtet, dass die meisten CS-NPs mit der Größe von weniger als 500 nm bei einer niedrigen CS-Konzentration (0,1% w / v) erhalten wurden. Die DS-Konzentration beeinflusste auch die Größe der Nanopartikel (). Mit zunehmender DS-Konzentration von 0,05 auf 0,25% w/v konnte ein zunehmender Trend der Partikelgröße beobachtet werden. Im Allgemeinen beträgt die DS-Konzentration 0.05% w / v (niedrige Konzentration) erzeugte Nanopartikel mit einer Partikelgröße von weniger als 500 nm. Im Gegensatz dazu wurden große Nanopartikel (> 1000 nm) erhalten, wenn die Konzentration beider Polymere auf 0,25% oder mehr erhöht wurde. Basierend auf den Ergebnissen wurden DS-Konzentrationen von 0,05 bis 0,20% w / v für die folgenden Studien ausgewählt. Darüber hinaus führte eine Erhöhung des DS: CS-Gewichtsverhältnisses (höhere Dichte negativer Ladungen von DS im System) zu einer Zunahme der Partikelgröße, aber zu einer Abnahme der Partikeloberflächenladung (Tabelle 1 (oben)). Da das CS-Gewicht die Masse von DS überschritt, wurde ein positiver Wert von +56,2 ± 1,5 mV erhalten. Die Partikeloberflächenladung nahm jedoch auf – mV ab, wenn mehr negativ geladenes DS hinzugefügt wurde. Es nahm kontinuierlich ab, als das DS: CS-Gewichtsverhältnis 2,5: 1 erreicht hatte. Es wurde erwartet, dass dies auf einen Überschuss an DS-Molekülen zurückzuführen ist, die sich auf der Oberfläche von Nanopartikeln angesammelt haben.

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 1

Elektrophoretische Mobilität als Funktion der Zeit (ein) und Wirkung der Endkonzentrationen von CS und DS auf die Partikelgröße von Nanopartikeln (b), .

Tabelle 1 (unten) zeigt, dass DS 0,2% w/v nach Beladung mit BSA die größte Partikelgröße besaß. Die Partikelgröße betrug nm. Partikelgröße für DS bei einer Konzentration von 0,1 und 0.15% w / v war auch größer als die leeren (). Auf der anderen Seite wurden höhere positive Werte der Oberflächenladung für BSA-beladene Nanopartikel im Vergleich zu den leeren beobachtet. Dies wurde für alle DS-Konzentrationen beobachtet. Darüber hinaus konnten höhere EE-Werte erreicht werden, indem das DS: CS-Gewichtsverhältnis über 0,5: 1 erhöht wurde. Die EE von nanoparticles an DS: CS Gewichtsverhältnis von 1 :1, 1,5 : 1 und 2: 1 war %, % und % beziehungsweise. Der höchste EE wurde bei einem DS:CS Gewichtsverhältnis 1 :1 erhalten (Tabelle 1 (unten)).

Tabelle 2 zeigt, dass DS 0.2% w/v besaßen nach Beladung mit siRNA die größte Partikelgröße (900 ± 60 nm). siRNA-beladene CS-NPs bei verschiedenen DS-Konzentrationen (0,05, 0,1, 0,15 und 0,2% w / v) zeigten eine kleinere Partikelgröße. Die EE von Nanopartikeln bei DS: CS Gewichtsverhältnis von 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, und 2 : 1 war %, %, % und %.

3.2. Morphologie

Die Bilder der CS-NPs wurden mittels TEM erhalten (Abbildung 2). Die Abbildungen 2 (a) und 2 (b) zeigen, dass unbelastete CS-NPs eine sphärische Struktur aufwiesen. Die Bilder zeigten, dass Nanopartikel, die von siRNA erzeugt wurden (Abbildungen 2 (e) und 2 (f)), unregelmäßige Morphologie zeigten; jedoch zeigten BSA-beladene Nanopartikel längliche Morphologien (Abbildungen 2 (c) und 2 (d)).

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Abbildung 2

TEM Bilder von CS NPs. (a) und (b) Entladene CS-NPs bei 0,5 : 1 und 1 : 1, (c) und (d) BSA geladene CS-NPs bei 0,5: 1 und 1 : 1, und (e) und (f) siRNA geladen CS NPs bei 0,5: 1 und 1 : 1, beziehungsweise. Alle Bilder wurden mit 60 kX Vergrößerung aufgenommen.

3.3. Lagerstabilität von CS NPs

Beide Nanopartikel aus 0,05 und 0,10% w / v DS wurden im Laufe der Zeit vergrößert, wie in Abbildung 3 (a) gezeigt, wenn sie bei Umgebungstemperatur gelagert wurden. Insbesondere bei 0,05% w/v DS wurde nach Tag 14 der Lagerung ein signifikanter Anstieg der Partikelgröße beobachtet. Es wurde angenommen, dass dies auf die Bildung von Aggregaten zurückzuführen ist. Dieser Befund bestätigte sich mit den Ergebnissen der Oberflächenladung, die eine Abnahme der Oberflächenladung auf nahezu neutral zeigten. Im Gegensatz dazu, wenn sie bei 4 ° C gelagert wurden, blieben ihre Partikelgröße und Oberflächenladung für Nanopartikel aus 0,10% w / v DS bis zu 14 Tage unverändert. Eine leichte Veränderung wurde für 0,05% w/v DS beobachtet (Abbildungen 4(a) und 4(b)). Auf der anderen Seite, wenn diese Nanopartikel in PBS pH 7,4 suspendiert wurden, wurden alle Formulierungen zu größeren Größen von mehr als 1 µm mit PDI-Werten von mehr als 0,5 aggregiert. Ihre Partikeloberflächenladungen waren ebenfalls nahezu neutral und reichten von +0.2 bis +2,5 mV.

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 3

( a) Partikelgröße und (b) Oberflächenladung von CS NPs hergestellt bei 0,05 und 0,01% w / v DS-Lösung und gelagert bei 25 ° C. Nanopartikel wurden in destilliertem Wasser suspendiert (pH im Bereich von 6-7), .

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 4

( a) Partikelgröße und (b) Oberflächenladung von CS NPs hergestellt bei 0,05 und 0,10% w / v und gelagert bei 4 ° C. Nanopartikel wurden in destilliertem Wasser suspendiert (pH im Bereich von 6-7), .

3.4. BSA In Vitro Freisetzung und Integrität

Abbildung 5(a) veranschaulicht, dass die Freisetzung von BSA basierend auf der Freisetzungsrate in zwei Stufen unterteilt werden kann. In der ersten Stufe wurde der BSA schnell aus dem CS-NPs freigesetzt und zeigte in den ersten 6 h eine Burst-Freisetzung. Dies führte zu einer kumulativen Freisetzung von BSA von 45% ± 5. In der zweiten Stufe wurde BSA langsam von 6 h bis 48 h freigesetzt, was zu einer kumulativen BSA-Freisetzung von mehr als 60% führte. Die Integrität von BSA, die aus CS NPS freigesetzt wurde, wurde von SDS-PAGE bewertet und ist in Abbildung 5 (b) dargestellt. Die beobachteten Banden bestätigten, dass BSA, die die Beladungs- und Freisetzungsprozesse nach den Tagen 1 und 2 bei 37 ° C überstanden hatten, sich nicht von denen frisch hergestellter BSA-Standards unterschieden. Daher konnte gefolgert werden, dass BSA unter den Versuchsbedingungen in seiner nativen Form im CS-NPs verblieb.

(ein)

(b)

(a)
(b)

Abbildung 5

( a) Das Freisetzungsprofil von BSA-CS-NPs bei DS : CS-Verhältnis von 1: 1 bei pH 7.4, . (b) SDS-PAGE-Analyse von aus CS-NPs freigesetztem BSA: (M) SDS-PAGE-Standards (BIO-RAD); (A) BSA-Standard 1 mg / ml; (B) BSA-Standard 0,2 mg / ml; (C) leer; (D) unbeladenes CS-NPs; (E) und (F) Aus CS-NPs freigesetztes BSA (DS: CS-Verhältnis von 1: 1) an den Tagen 1 und 2.

3.5. siRNA-In-vitro-Freisetzung

Abbildung 6 veranschaulicht, dass die Freisetzung von siRNA basierend auf der Freisetzungsrate in zwei Stufen unterteilt werden kann. In der ersten Stufe wurde die siRNA schnell aus dem CS-NPs freigesetzt und zeigte in den ersten 6 h eine Burst-Freisetzung. Dies führte zu einer kumulativen Freisetzung von siRNA von 58% ± 5%. In der zweiten Stufe wurde siRNA langsam von 6 h bis 48 h freigesetzt, was zu einer kumulativen BSA-Freisetzung von mehr als 85% führte.

Abbildung 6

Das Freisetzungsprofil von siRNA beladenen CS-NPs bei DS:CS-Verhältnis von 1:1 bei pH 7,4, .

4. Diskussionen

Das Verfahren zur Herstellung von CS-NPs in der vorliegenden Studie ist ein mildes Verfahren und ermöglicht die Kontrolle der Partikelgröße durch Variation bestimmter Parameter, z. B. Konzentration der zugesetzten Salze, Viskosität, Menge des Nichtlösungsmittels und Molekulargewicht des Polymers. Diese Studie wurde mit der Untersuchung begonnen, um Informationen über den elektrischen Zustand ionisierbarer Gruppen von CS-NPs zu erhalten, indem die Stabilisierungszeit von e.d.l. Dieser Schritt ist wichtig, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass die Bildung von stabilem e.d.l. während Nanopartikel Herstellung erforderlich einige Momente nach dem Rühren zu stoppen. Diese Momente wurden benötigt, damit die Elektrolyte in Richtung des Teilchenkerns eindringen konnten. Somit war eine Wartezeit von 40 min erforderlich, bevor der CS-NPs genau gemessen werden konnte. Dieser Befund ähnelte dem CS-Tripolyphosphat (CS-TPP) -NPs, der die gleiche Wartezeit nahelegte .

Es wurde auch eine Studie durchgeführt, um den Einfluss der Polymerkonzentration auf die Partikelbildung zu bestimmen. Die Studie zielte darauf ab, den Bereich der Polyelektrolytkonzentration zu bestimmen, um Nanopartikel mit der gewünschten Größe herzustellen. Um die Auswirkungen der unterschiedlichen Konzentrationen von CS und DS auf die Bildung von Nanopartikeln zu untersuchen, wurden CS- und DS-Lösungen von 0,1, 0,25 und 0,5% w / v hergestellt. Variable Volumina der DS-Lösung (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, und 10 ml) wurden mit je 5 ml CS–Konzentration (0,1-0,5% w/v) versetzt. Die endgültige Konzentration von CS und DS wurde berechnet, und die Probengrößen wurden entweder als 100-500, 501-1000 oder mehr als 1000 nm kategorisiert. Es wurde festgestellt, dass die Partikelgröße durch die DS-Konzentration beeinflusst wurde. Dieser Befund bestätigte sich mit den Ergebnissen von CS-TPP NPs . Im Allgemeinen liegt die gewünschte Größe von Nanopartikeln zwischen 100 und 1000 nm. Frühere Studien haben jedoch gezeigt, dass die beladenen Nanopartikel normalerweise eine größere Größe als die leeren erzeugen würden. Die Größe von unter 500 nm ist daher günstig.

Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass nur eine DS-Konzentration von 0,05% w / v in der Lage war, Nanopartikel mit einer Partikelgröße von weniger als 500 nm herzustellen, wie in Tabelle 1 gezeigt. Es wurde erwartet, dass bei niedrigen Konzentrationen beider Polymere die Zugabe von DS zu den CS zu kleinen Koazervatkernen führte. Im Gegensatz dazu tendierten große Koazervate, die größer als 1000 nm waren, zur Bildung, wenn die Konzentration beider Polymere auf 0,25% oder mehr anstieg. Die Fähigkeit von Chitosan, spontan Koazervat zu bilden, beruht auf der Wechselwirkung entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte, um einen Polyelektrolytkomplex mit verringerter Löslichkeit zu bilden. Die Mischung aus hoher Konzentration von DS mit CS beeinflusst daher eher die Verschränkung der CS-Ketten und die Löslichkeit des resultierenden Komplexes. Infolgedessen wird ein hohes Maß an Komplexierung und Koazervat erzeugt . Die verringerte Viskosität bei einer niedrigeren Konzentration von CS führte auch zu einer besseren Löslichkeit. Dies ermöglichte eine effizientere Wechselwirkung zwischen den kationischen CS und entgegengesetzt geladenen Ionen, und somit wurde eine kleinere Partikelgröße erzeugt . Darüber hinaus führte eine Zunahme und ein Überschuß der Molmasse des eingesetzten Polyanions zu größeren Partikeln, da hochneutralisierte Komplexe gebildet wurden, die zur Ausflockung neigten. In dieser Studie war die Partikeloberflächenladung des nanopartikulären Systems vom Gewichtsverhältnis von DS und CS abhängig. Es wurde festgestellt, dass die Partikeloberflächenladung mit abnehmendem Verhältnis zunimmt. Diese Beziehung könnte nützlich sein, um die gewünschte Partikeloberflächenladungsdichte zu erhalten, um die Adhäsions- und Transporteigenschaften der Nanopartikel zu erleichtern.

In der vorliegenden Studie wurde der Einbau von BSA in CS-NPs durch einfaches Mischen der sauren CS-Lösung mit gelösten BSA-Molekülen mit der DS-Lösung bei Raumtemperatur ohne Zusatz von Stabilisator erreicht. BSA wird häufig als Modellprotein verwendet, da es die allgemeinen Eigenschaften anderer Proteine umfasst und für den Menschen biokompatibel ist. Es wurde festgestellt, dass CS-NPs nach Beladung mit BSA vergleichsweise größer waren. Es wurde erwartet, dass die Partikelgröße zunimmt, wenn BSA erfolgreich in Nanopartikel geladen wird. Dieser Trend kann möglicherweise auf das Molekulargewicht und die Größe der zugesetzten BSA-Moleküle zurückzuführen sein. Diese großen Partikelgrößen können ihre Verwendung bei der Abgabe von Protein einschränken. Nanopartikel von 150-300 nm finden sich hauptsächlich in der Leber und der Milz . Berichten zufolge liegt die “ideale” Größenanforderung für Nanopartikel, die für die Krebsbehandlung entwickelt wurden, zwischen 70 und 200 nm . Obwohl Nanopartikel nicht größer als 150 nm sein sollten, um die Endothelbarriere zu überwinden, wird in der Literatur immer über das Eindringen von Partikeln berichtet, die größer als die Grenzen der Fenster sind. In der Tat können die Fensterung und das Gefäßsystem unter verschiedenen pathologischen Bedingungen modifiziert werden .

Zum Beispiel induziert Tumorwachstum die Entwicklung von Neovaskulaturen, die durch diskontinuierliches Endothel mit großen Fenestrationen von 200-780 nm gekennzeichnet sind . Außerdem wurde beobachtet, dass die Partikeloberflächenladung von mit BSA beladenen Nanopartikeln höher war als die der leeren. Dies kann auf die kationische Eigenschaft zurückzuführen sein, die BSA besitzt, wenn es in saurem Zustand vorliegt. Die positiven Ladungen von CS- und BSA-Molekülen haben daher zu einem höheren Wert der Partikeloberflächenladung für die beladenen Nanopartikel beigetragen.

Positiv geladene kationische Polymere können effektiv an Nukleinsäuren wie DNA, Oligonukleotide und siRNA binden und diese schützen . In dieser Studie wurde der Einbau von siRNA in CS-NPs durch einfaches Mischen der sauren CS-Lösung mit der DS-Lösung, die siRNA enthält, bei Raumtemperatur erreicht. Es wurde festgestellt, dass die Partikelgröße von CS-NPs nach Beladung mit siRNA vergleichsweise kleiner war. Die kleinere Größe von CS-NPs, die mit siRNA beladen sind, könnte auf die Neutralisierung negativer Ladungen von Nukleinsäure durch kationisches Polymer zurückzuführen sein, was zu kondensierten kleineren Nanopartikeln führt. Die siRNA-geladenen CS-NPs zeigten auch ein höheres Zetapotential als leere CS-NPs, dem gleichen Trend folgend wie der von BSA-geladenen CS-NPs.

Idealerweise sollte ein erfolgreiches Verabreichungssystem einen hohen Grad an assoziierenden Arzneimitteln aufweisen. Die mit siRNA beladenen CS-NPs zeigten eine höhere Einschlusseffizienz (< 90%) für alle DS: CS-Gewichtsverhältnisse. Die Einschlusseffizienz von Nanopartikeln bei DS: CS Gewichtsverhältnis von 1: 1, 1,5 : 1 und 2: 1 war höher als das Gewichtsverhältnis von 0,5: 1. Dieses Phänomen war höchstwahrscheinlich auf einen höheren Anteil an DS in den Nanopartikeln zurückzuführen. Wenn mehr DS hinzugefügt wird, würde es mehr BSA erleichtern, in nanoparticles eingeschlossen zu werden. Dies könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass BSA ein zwitterionisches Molekül ist. Bei dem pH-Wert des Formulierungsmediums von 3,5-4,0 könnte die Löslichkeit von BSA aufgrund erhöhter positiver Ladungen, die es besitzt, stark erhöht werden. Somit wäre BSA in der Lage, die Nanopartikel elektrostatisch zu befestigen und stabil zu laden. In saurer Lösung könnte BSA eine positive Ladung besitzen und mit CS konkurrieren, um elektrostatisch mit DS zu interagieren. Dieser Befund wurde durch die erhöhten positiven Oberflächenladungen von mit BSA beladenen CS-NPS im Vergleich zu unbelasteten bestätigt. Darüber hinaus gibt es multiionische Stellen auf BSA, und diese Eigenschaft könnte den Einbau von BSA in Nanopartikel erleichtern. Dieser Befund unterscheidet sich von dem Befund mit CS-TPP NPs .

In der Studie war die elektrostatische Wechselwirkung zwischen BSA und CS anstelle von BSA und TPP vorhanden. Es wurde auch vorgeschlagen, dass sich BSA in einer Lösung mit einem höheren pH-Wert als seinem isoelektrischen Punkt auflösen sollte, damit BSA eine negative Ladung besitzt und mit den positiv geladenen CS-Molekülen interagiert. Dieser Befund zeigte daher, dass die elektrostatische Wechselwirkung der Hauptfaktor ist, der den Einbau von BSA in Nanopartikel entweder über CS-Protein-Interaktion oder DS-Protein-Interaktion fördert.

TEM erlaubt nanoskalige Sichtbarmachung von einzelnen nanoparticles und liefert Informationen der Größe und der Morphologie. Die Partikelmorphologie ist ein wichtiger Faktor für die kolloidale und chemische Stabilität sowie die Bioaktivität von Nanopartikeln. siRNA-beladene CS-NPs zeigten eine unregelmäßige Morphologie; BSA-beladene CS-NPs zeigten jedoch eine längliche Morphologie. Dies könnte auf eine größere Größe von BSA zurückzuführen sein, die CS verwickeln oder wie ein Schild wirken kann, wodurch die Gesamtexposition von CS innerhalb der Struktur begrenzt wird.

Das Stabilitätsprofil von CS-NPs bei Lagerung ist ebenfalls wichtig. Diese Informationen könnten einen Überblick über die Stabilität von Nanopartikeln unter verschiedenen Medien und Temperaturen geben. Die Stabilität von nanoparticles wurde nachgeforscht, indem man ihre Veränderung in der mittleren Teilchengröße und in der Oberflächenladung im Laufe der Zeit feststellte. Zuerst wurden die Nanopartikel in destilliertem Wasser bei pH 6,6 resuspendiert, das durch 0,2 µm Filter gefiltert wurde, um mögliche Verunreinigungen im Wasser zu entfernen. Für diese Studie wurden nur Nanopartikel aus 0,05 und 0,10% w / v DS getestet. Andere DS-Konzentrationen wurden aufgrund der erhöhten Partikelgröße nach Zentrifugation nicht bestimmt. Die Partikelgröße betrug bis zu nm und nm für 0,15% bzw. 0,20% w/v DS. Die Zunahme der Partikelgröße kann aufgrund von CS NPs selbst erodieren und ihre Kugelform in einer wässrigen Umgebung verlieren, und folglich würde der mittlere Durchmesser der Partikel als Reaktion auf diese Erosion ansteigen . Darüber hinaus nahmen die Partikeloberflächenladungen für die Nanopartikel aus beiden Konzentrationen im Laufe der Zeit ab. Es wurde vermutet, dass CS in wässrigen Medien abgebaut werden kann, wenn auch in Abwesenheit von Lysozymen. Die Ergebnisse zeigten, dass CS-NPs bei Lagerung bei 4 ° C stabiler waren, da ihre Partikelgröße und Oberflächenladung bis zu 14 Tage unverändert oder geringfügig verändert waren. Die Ergebnisse deuteten auch darauf hin, dass CS-NPs nicht bei Umgebungstemperatur gelagert werden sollten, da sie anfällig für Abbau sind. Die Ergebnisse legen daher nahe, dass CS-NPs, die bei Raumtemperatur gelagert werden, anfälliger für Abbau sind als solche, die in kühler Umgebung gelagert wurden. Es war wahrscheinlich auf die kühle Umgebung zurückzuführen, die die kinetische Bewegung von Nanopartikeln verlangsamen kann. Somit könnten die Nanopartikel ihre Kugelform beibehalten und es wäre weniger wahrscheinlich, dass Erosion auftritt. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass diese Nanopartikel in PBS bei pH 7,4 aggregiert wurden. Dies kann auf eine geringere Partikeloberflächenladung von Nanopartikeln in PBS zurückzuführen sein, die nahezu neutral ist. Die Partikeloberflächenladung, die auf Null abfiel, kann darauf hinweisen, dass CS NPs durch Phosphatgruppen von PBS einer Ladungsunterdrückung unterzogen wurde. Der neutrale geladene Zustand dieser Nanopartikel kann zum Verlust von intra- und intermolekularen Kräften führen, was wichtig ist, um die Nanopartikel einzeln zu erhalten. Infolgedessen können diese ungeladenen Nanopartikel beginnen, das kolloidale System zu aggregieren und zu destabilisieren. Im Gegensatz zu PBS kann destilliertes Wasser zahlreiche Wasserstoffionen bereitstellen, um Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden, die bei der Aggregation von Nanopartikeln durch Wechselwirkung mit ionisierbaren Gruppen von CS-NPs helfen können.

Die in vitro Freisetzungsstudie von BSA und siRNA aus CS NPs wurde in Tris-HCL Puffer durchgeführt. Die Freisetzung von BSA und siRNA könnte basierend auf der Freisetzungsrate in zwei Stufen unterteilt werden. In der ersten Phase wurde das Medikament schnell aus CS NPs freigesetzt. Die Freisetzung von BSA und siRNA in diesem Stadium könnte die Diffusion von an der Partikeloberfläche gebundener BSA / siRNA beinhalten. In der zweiten Stufe wurde BSA/siRNA aufgrund von Quellung oder Abbau des Polymers langsam freigesetzt. Die verbleibende BSA / siRNA in CS-NPs würde erst vollständig freigesetzt, wenn die Partikel vollständig erodiert oder im Freisetzungsmedium gelöst wären. Dies könnte auf die Wechselwirkung zwischen der verbleibenden BSA / siRNA und der freien Aminogruppe auf den CS-Segmenten zurückzuführen sein . Darüber hinaus stellte das synthetisierte System, das zuvor als unter milden Bedingungen formulierbar beschrieben wurde, sicher, dass die Stabilität der in CS NPs geladenen Proteine intakt war, wie durch SDS-PAGE bestimmt.

5. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die CS- und DS-Konzentration sowie der pH-Wert die Parameter waren, die die Partikelgröße und Oberflächenladung von CS-NPs kontrollierten. Nanopartikel kleiner als 500 nm konnten bei DS:CS Gewichtsverhältnis von 0,5 :1 bei pH 4 erhalten werden. Im Falle des BSA-Einschlusses besaßen Nanopartikel mit höheren DS: CS-Gewichtsverhältnissen höhere Einschlusswirkungsgrade von mehr als 88%. Der höchste Prozentsatz der erzielten Einschlusseffizienz lag bei 0,10% w / v DS (DS: CS-Verhältnis von 1: 1). Mit siRNA beladene CS-NPs zeigten jedoch eine hohe Einschlusseffizienz (> 90%) für alle DS: CS-Verhältnisse. Es wurde festgestellt, dass Lagertemperatur und Suspensionsmedium die Faktoren sind, die die Stabilität von CS-NPs beeinflussen können. CS-NPs waren labil und neigen dazu, sich bei Umgebungstemperatur zu destabilisieren, halten dieses labile Verhalten jedoch zurück, wenn eine kühle Umgebung (2-4 ° C) bereitgestellt wurde. Darüber hinaus hatte CS NPs eine bessere Stabilität in destilliertem Wasser als in PBS, was auf Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen sein könnte, die sich zwischen Wassermolekülen und ionisierbaren Gruppen von CS NPs bildeten.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass in der aktuellen Forschung kein persönlicher oder finanzieller Interessenkonflikt besteht.

Danksagung

Die Autoren danken dem “Dana Lonjakan Penerbitan” der Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM-DLP-2011-001) für die Finanzierung und Unterstützung des aktuellen Forschungsprojekts.