Desarrollo de Nanopartículas de Quitosano como un Sistema Estable de Administración de Medicamentos para Proteínas/ARNip

Resumen

Las nanopartículas de quitosano (CS NPs) exhiben buenas propiedades fisicoquímicas como sistemas de administración de medicamentos. El objetivo de este estudio es determinar la modulación de los parámetros preparatorios sobre las características físicas y la estabilidad coloidal de las NPs de CS. Las NPS de CS se fabricaron mediante interacción iónica con sulfato de dextrano (DS) antes de determinar su estabilidad de almacenamiento. Los NPs CS más pequeños de nm con una carga superficial de mV se produjeron cuando se mezclaron CS y DS a pH 4 y con una relación de masa DS : CS de 0,5 : 1. Se logró una eficiencia de atrapamiento del 98% cuando se cargó BSA/siRNA en las nanopartículas. Los resultados también mostraron que el tamaño de partícula y la carga de superficie de las NPs de CS se modificaron ligeramente hasta 2 semanas cuando se almacenaron a 4°C. Se obtuvieron mayores tamaños de partícula y carga de superficie al aumentar la concentración de DS. En conclusión, las NPs eran suficientemente estables cuando se mantenían a 4°C y capaces de transportar y proteger proteínas.

1. Introducción

Los péptidos endógenos, las proteínas y los oligonucleótidos se encuentran entre los principales fármacos que atraen mucha atención debido a su gran potencial en el tratamiento de enfermedades crónicas . Sin embargo, el ambiente extremo in vivo del cuerpo humano siempre ha limitado las aplicaciones terapéuticas de estas sustancias . Las nanopartículas poliméricas han atraído mucha atención como sistemas de entrega debido a su capacidad para superar las barreras fisiológicas y proteger y dirigir las sustancias cargadas a células específicas . Polímeros naturales como el quitosano (CS) han sido estudiados para formar nanopartículas . CS es un polisacárido biodegradable, y se deriva de la desacetilación de la quitina . Además de su biocompatibilidad, las propiedades hemostáticas y bacteriostáticas de baja toxicidad también contribuyen a sus diversas aplicaciones en el campo farmacéutico . Se han investigado varios aniones para reticular el CS como el sulfato de sodio y el sulfato de dextrano (DS) . DS es capaz de modificar la eficiencia de atrapamiento de proteínas y ARNip (EE) sin el uso de agentes de endurecimiento y controlar la tasa de liberación de fármacos debido a su alta densidad de carga . Además de que el DS es un material barato, produce nanopartículas mecánicamente más estables en comparación con el tripolifosfato pentasódico (TPP) .

Varios estudios habían reportado las características únicas de las nanopartículas de quitosano (CS NPs) utilizando DS. Sin embargo, la modulación de los parámetros preparativos en sus características físicas todavía no está completamente investigada, por ejemplo, la influencia del obstáculo estérico del DS en la atracción electrostática entre el CS y el ASC . Además, el factor determinante del éxito de un sistema de administración de medicamentos depende de sus características físicas y estabilidad. Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron modular los parámetros preparatorios para obtener partículas nanométricas de NPs de CS y determinar su estabilidad coloidal a diferentes temperaturas de almacenamiento y en diversos medios de suspensión.

2. Materiales y Métodos

2.1. Materiales

Quitosano de bajo peso molecular (70 kDa con un grado de desacetilación del 75% al 85%), ácido acético glacial, solución salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina sérica bovina (BSA, 46 kDa) y reactivo Bradford se compraron a Sigma-Aldrich Inc., USA. siRNA de doble cadena (sentido: 5′ – GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU-3′, antisentido: 3′-UACAUAACCGGACAUAAUCUU-5′) se compró a Thermocientific Dharmacon, EE. El sulfato de dextrano (DS) se compró a Fisher Scientific, Reino Unido. Escalera de proteínas (Gama alta), tampón de muestra Laemmli, tampón de dodecilsulfato de sodio/glicina 10x, persulfato de amonio, tetrametilendiamina (TEMED), solución al 2% bis y solución de acrilamida al 40% se compraron en Bio-Rad, EE. El tampón Tris-HCl se obtuvo de Invitrogen, EE. Todos los demás productos químicos utilizados eran de calidad analítica.

2.2. Preparación de NPs CS

en blanco y cargado con BSA, la solución de CS y DS se disolvió en ácido acético al 1% v/v y agua destilada, respectivamente. El pH de la solución de CS se ajustó a pH 4 añadiendo 1 M de NaOH o 1 M de HCl. Solución DS (0,05%, 0,1%, 0.15%, 0,2% y 0,25% p/v) se añadió gota a gota en solución CS (0,1% p/v) bajo agitación magnética (Agitador magnético multipunto Digital WiseStir MS-MP8, DAIHAN Scientific, Corea) a 250 rpm durante 15 min para formar nanopartículas. Todas las muestras se hicieron por triplicado. Las nanopartículas resultantes se lavaron y cosecharon por ultracentrifugación (Ultracentrífuga Optima L-100 XP con rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, EE.UU.) dos veces a 12 500 rpm durante 15 min a 10°C. Para la asociación de BSA en NPs CS, BSA se disolvió en solución CS (0,1% p/v, pH 4) para producir una concentración final de 1 mg/ml. Las NPs CS cargadas con BSA se prepararon por el método anterior. Para la asociación de ARNip en NPs CS, se añadieron 3 µL de ARNip (15 µg/µL) en agua desionizada a la solución DS (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, y 0,25% p/v) antes de agregar esta solución a la solución CS (0,1% p / v).

2.3. Estudio de Movilidad Electroforética

Las mediciones de movilidad electroforética () de NPs de CS se realizaron con un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido) y se midieron en función del tiempo de espera. Cada muestra fue analizada por triplicado.

2.4. Caracterización de nanopartículas

El tamaño de partícula, la carga superficial y el índice de polidispersidad (PDI) de NPs CS recién preparados se midieron utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido), basado en las técnicas de Espectroscopia de Correlación de Fotones (PCS). No se realizaron diluciones durante el análisis. Cada muestra fue analizada por triplicado. Las mediciones se realizaron a 25°C.

2.5. Análisis morfológico

Caracterización morfológica de NPs CS sin carga, NPs CS con carga BSA/siRNA (relación de peso DS: CS de 0,5: 1, 1 : 1) se llevó a cabo utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), Tecnai Spirit, FEI, Eindhoven (Países Bajos).

2.6. Eficiencia de atrapamiento BSA/siRNA

Los NPS CS cargados con BSA/siRNA se separaron de la solución mediante ultracentrifugación (Ultracentrífuga Optima L-100 XP con rotor NV 70.1, Beckman-Coulter, EE.UU.) a 14000 rpm durante 30 min. Los sobrenadantes recuperados de la centrifugación se decantaron. El contenido de BSA en el sobrenadante se analizó mediante un espectrofotómetro UV-Vis a 595 nm (U. V-1601; Shimadzu, Japón) utilizando el ensayo de proteína Bradford según las instrucciones del fabricante. El contenido de siRNA en el sobrenadante se analizó mediante un espectrofotómetro UV-Vis a 260 nm. Las muestras se prepararon y midieron por triplicado. La eficiencia de atrapamiento ASC / ARNi (EE) se calculó mediante la siguiente ecuación:

2,7. Estabilidad de NPs CS

NPs CS recién preparado (hecho de 0,05% y 0,1% p/v de solución DS y CS, resp.) se centrifugaron a 12.500 rpm durante 15 minutos antes del almacenamiento. Después de la ultracentrifugación, los pellets obtenidos se resuspendieron en agua destilada (pH medido de 6,6) o en PBS con pH de 7,4. El tamaño de partícula y la carga de superficie se midieron en duraciones de tiempo de almacenamiento predeterminadas(0, 1, 2, 3, 5, 8, y 14 días), y a temperatura ambiente o a 4°C.

2,8. Estudio de Liberación de Fármacos in Vitro

La liberación de ASC / siRNA se determinó a partir de NPs de CS con el mayor EE (relación DS : CS 1 : 1, EE = 98% ± 0,2 y , resp.). Los NPS CS cargados con BSA/siRNA se suspendieron en una solución tampón Tris-HCl (pH 7,4, 4 mL) y se colocaron en un agitador magnético con una velocidad de agitación de 100 rpm a 37°C (MS MP8 Wise Stir Wertheim, Alemania) durante 48 h a 37°C. A intervalos de tiempo predeterminados (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 20, 24, y 48 h), las muestras se centrifugaron a 14 000 rpm durante 30 min a 10°C. Luego, el sobrenadante se decantó y se reemplazó con un volumen equivalente de solución tampón fresca. La cantidad de BSA/siRNA liberada en el sobrenadante se analizó mediante un espectrofotómetro UV-Vis (U. V-1601; Shimadzu, Japón) a una longitud de onda de 280 y 260 nm, respectivamente.

2.9. Integridad de la BSA

La integridad de la BSA liberada de CS NPs se determinó mediante SDS-PAGE (gel de resolución del 12% y apilamiento del 10%) utilizando el sistema Mini-Protein (Bio-Rad, EE.UU.). Las muestras de ASC se mezclaron con tampón de muestras Laemmli en relación 1 : 1 y se calentaron a 95°C durante 5 min. Las muestras (15 µL) se cargaron en los pocillos y el gel se utilizó un Sistema de Miniproteínas Tetra Cell a un voltaje constante de 150 V durante 90 min con un tampón de funcionamiento que contenía 25 mM Tris, 192 mM glicina y 0,1% SDS a pH 8,3. Las bandas de muestra se teñieron durante 40 minutos con una solución azul de Coomassie al 0,1% que contenía ácido acético al 40% y metanol al 10%, seguido de una tinción nocturna con una solución de ácido acético al 40% y metanol al 10%.

2.10. Análisis estadístico

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico (prueba ANOVA y análisis posthoc de Tukey)se realizó utilizando el Paquete Estadístico para el programa Social (SPSS) versión 15. Un valor < 0,05 mostró diferencia significativa entre los promedios de los grupos evaluados.

3. Resultados

3.1. Tamaño de partícula y Carga superficial

La figura 1 (a) muestra los resultados de la movilidad eléctrica () en relación con el tiempo de espera. A partir de la gráfica, se pudo observar que la meseta permaneció y constante después de 30 min. Esto demuestra que la formación de una capa eléctrica estable de doble capa (e.d.l.) no fue instantánea, sino que requirió algunos momentos. Los efectos entre la concentración de CS y las concentraciones finales de DS sobre el tamaño de las NPs de CS se presentan en la Figura 1(b). Se observó que la mayoría de las NPs de CS con un tamaño inferior a 500 nm se obtuvieron a una concentración baja de CS (0,1% p/v). La concentración de DS también influyó en el tamaño de las nanopartículas (). Se observó una tendencia creciente en el tamaño de partícula al aumentar la concentración de DS de 0,05 a 0,25% p/v. En general, la concentración de DS de 0.05% p/v (baja concentración) de nanopartículas producidas con un tamaño de partícula inferior a 500 nm. Contrariamente a eso, se obtuvieron nanopartículas grandes (>1000 nm) cuando la concentración de ambos polímeros se incrementó a 0,25% o más. Sobre la base de los resultados, se seleccionaron concentraciones de DS de 0,05 a 0,20% p/v para los siguientes estudios. Además, un aumento de la relación de peso DS: CS (mayor densidad de cargas negativas de DS presentes en el sistema) condujo a un aumento del tamaño de las partículas, pero a una disminución de la carga superficial de las partículas (Tabla 1 (arriba)). Como el peso del CS excedió la masa del DS, se obtuvo un valor positivo de + 56,2 ± 1,5 mV. Sin embargo, la carga de la superficie de partículas disminuyó a − mV cuando se agregó DS con carga negativa. Estaba disminuyendo continuamente cuando la relación de peso DS : CS había alcanzado 2,5 : 1. Se esperaba que esto se debía a un exceso de moléculas de DS acumuladas en la superficie de las nanopartículas.

(un)

(b)
(b)

(a)(b)
(b)

Figura 1

la movilidad Electroforética como una función del tiempo (a) y el efecto de las concentraciones finales de CS y DS en el tamaño de partícula de las nanopartículas (b), .

La tabla 1 (a continuación) muestra que el DS 0,2% p / v poseía el mayor tamaño de partícula después de ser cargado con ASC. El tamaño de partícula era nm. Tamaño de partícula para DS a concentraciones de 0,1 y 0.el 15% p / v también era mayor que los vacíos (). Por otro lado, se observaron valores positivos más altos de carga superficial para las nanopartículas cargadas con BSA en comparación con las vacías. Esto se observó para todas las concentraciones de DS. Además, se podrían lograr valores de EE más altos aumentando la relación de peso DS: CS por encima de 0,5: 1. El EE de las nanopartículas con una relación de peso DS : CS de 1 : 1, 1,5 : 1 y 2 : 1 fue%, % y%, respectivamente. La EE más alta se obtuvo con una relación de peso DS: CS 1: 1 (Tabla 1 (a continuación)).

La tabla 2 muestra que DS 0.el 2% p / v poseía el mayor tamaño de partícula (900 ± 60 nm) después de ser cargado con siRNA. Las NPs CS cargadas con siRNA a diferentes concentraciones de DS (0,05, 0,1, 0,15 y 0,2% p/v) mostraron un tamaño de partícula más pequeño. El EE de nanopartículas en la relación de peso DS: CS de 0.5 : 1, 1 : 1, 1.5 : 1, y 2: 1 fue %,%, % y %, respectivamente.

3.2. Morfología

Las imágenes del NPs de CS fueron obtenidas por TEM (Figura 2). Las figuras 2 (a) y 2(b) muestran que las NPS CS descargadas exhibían una estructura esférica. Las imágenes demostraron que las nanopartículas generadas a partir de siRNA(Figuras 2(e) y 2 (f)) presentaban morfología irregular; sin embargo, las nanopartículas cargadas con ASC presentaban morfologías alargadas(Figuras 2(c) y 2 (d)).

(un)

(b)

(c)

d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 2

TEM imágenes de CS NPs. (a) y (b) NPs CS descargadas a 0,5 : 1 y 1: 1, (c) y (d) NPs CS cargadas por BSA a 0,5: 1 y 1 : 1, y (e) y (f) siRNA cargaron NPs CS a 0,5 : 1 y 1 : 1, respectivamente. Todas las imágenes se tomaron con un aumento de 60 kX.

3.3. Estabilidad de almacenamiento de NPS CS

Ambas nanopartículas hechas de 0,05 y 0,10% p/v DS aumentaron de tamaño con el tiempo, como se muestra en la Figura 3(a), cuando se almacenaron a temperatura ambiente. Se observó un aumento significativo del tamaño de partícula después del día 14 de almacenamiento, especialmente para el 0,05% p/v DS. Se pensó que esto se debía a la formación de agregados. Este hallazgo se corroboró con los resultados de la carga de superficie, que mostraron una disminución de la carga de superficie a casi neutral. En contraste, cuando se almacenaron a 4 ° C, su tamaño de partícula y carga de superficie permanecieron sin cambios hasta 14 días para nanopartículas hechas de 0,10% p/v DS. Se observó un ligero cambio para el 0,05% p / v DS(Figuras 4(a) y 4 (b)). Por otro lado, cuando estas nanopartículas se suspendieron en PBS pH 7,4, todas las formulaciones se agregaron a tamaños más grandes de más de 1 µm con valores de PDI superiores a 0,5. Sus cargas superficiales de partículas también eran casi neutras, oscilando entre +0.2 a +2,5 mV.

(a)

(b)

a)
b)

Gráfico 3

(a) Tamaño de partícula y b) carga superficial de las NPs de CS preparadas a 0,05 y 0,01% p/v de solución DS y almacenadas a 25°C. Las nanopartículas se suspendieron en agua destilada (pH en el rango de 6-7),.

(a)

(b)

a)
b)

Gráfico 4

(a) Tamaño de partícula y b) carga superficial de las NPS de CS preparadas a 0,05 y 0,10% p/v y almacenadas a 4°C. Las nanopartículas se suspendieron en agua destilada (pH en el rango de 6-7),

3.4. Liberación e Integridad in Vitro de ASC

La figura 5 (a) ilustra que la liberación de ASC podría dividirse en dos etapas en función de la tasa de liberación. En la primera etapa, el ASC se liberó rápidamente de la NPs de CS y mostró una liberación de ráfaga en las primeras 6 h. Esto resultó en una liberación acumulada de ASC del 45% ± 5. En la segunda etapa, el ASC se liberó lentamente de 6 h a 48 h, lo que resultó en una liberación acumulada de ASC de más del 60%. La integridad de la ASC liberada de las NPS de CS fue evaluada por SDS-PAGE y se muestra en la Figura 5(b). Las bandas observadas confirmaron que el ASC que había soportado los procesos de carga y liberación a 37°C después de los días 1 y 2 no era diferente de los estándares de ASC recién preparados. Por lo tanto, se puede concluir que el ASC se mantuvo en su forma nativa en la fuente de alimentación nuclear del CS en las condiciones experimentales.

(un)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

(a) El perfil de liberación de BSA cargado CS NPs en DS : CS ratio de 1 : 1 a pH 7.4, . (b) análisis de SDS-PAGE de BSA liberado de CS NPs: (M) SDS-PAGE normas (BIO-RAD); (A) BSA estándar de 1 mg/mL; (B) la BSA estándar de 0,2 mg/mL; (C) en blanco; (D) descargado CS NPs; (E) y (F) de la BSA liberado de CS NPs (DS : CS ratio de 1 : 1) en los días 1 y 2.

3.5. Liberación in vitro de siRNA

La figura 6 ilustra que la liberación de siRNA se puede dividir en dos etapas en función de la velocidad de liberación. En la primera etapa, el siRNA se liberó rápidamente desde el NPs CS y mostró una liberación de ráfaga en las primeras 6 h. Esto resultó en una liberación acumulativa del 58% ± 5 de ARNip. En la segunda etapa, el siRNA se liberó lentamente de 6 h a 48 h, lo que resultó en una liberación acumulada de BSA de más del 85%.

Figura 6

El perfil de liberación de siRNA cargado CS NPs en DS : CS ratio de 1 : 1 a pH 7.4, .

4. Discusiones

El método utilizado para producir NPs de CS en el presente estudio es un proceso suave, y permite el control del tamaño de partícula variando ciertos parámetros, por ejemplo, la concentración de sales añadidas, la viscosidad, la cantidad de no disolvente y el peso molecular del polímero. Este estudio se inició con la investigación para obtener información sobre el estado eléctrico de grupos ionizables de NPs de CS mediante la determinación del tiempo de estabilización de l.d.e. Este paso es importante para obtener resultados confiables y reproducibles. Los datos obtenidos sugirieron que la formación de e.d.l.estable. durante la preparación de nanopartículas se requirieron algunos momentos después de detener la agitación. Estos momentos eran necesarios para que los electrolitos penetraran hacia el núcleo de las partículas. Por lo tanto, se necesitó un tiempo de espera de 40 minutos antes de que las NPs de CS pudieran medirse con precisión. Este hallazgo fue similar al NPs CS-tripolifosfato (CS-TPP) que sugería el mismo tiempo de espera .

También se realizó un estudio para determinar la influencia de la concentración de polímeros en la formación de partículas. El objetivo del estudio era establecer el rango de concentración de polielectrolitos para producir nanopartículas con el tamaño deseado. Para estudiar los efectos de las concentraciones variables de CS y DS en la formación de nanopartículas, se prepararon soluciones de CS y DS de 0,1, 0,25 y 0,5% p/v. Volúmenes variables de solución DS (1, 2, 3, 4, 5, 5.8, y 10 ml) se mezclaron con 5 ml de cada concentración de CS (0,1–0,5% p / v). Se calculó la concentración final de CS y DS, y los tamaños de las muestras se clasificaron como 100-500, 501-1000 o más de 1000 nm. Se encontró que el tamaño de partícula se veía afectado por la concentración de DS. Este hallazgo se corroboró con los resultados de las NPs CS-TPP . En general, el tamaño deseado de nanopartículas confinadas entre 100 y 1000 nm. Sin embargo, estudios anteriores han demostrado que las nanopartículas cargadas normalmente producirían un tamaño más grande que las vacías. Por lo tanto, el tamaño de menos de 500 nm es favorable.

Además, los resultados revelaron que solo una concentración de DS de 0,05% p / v era capaz de producir nanopartículas con un tamaño de partícula inferior a 500 nm, como se muestra en la Tabla 1. Se esperaba que cuando ambos polímeros estaban en bajas concentraciones, la adición de DS al CS daba lugar a pequeños núcleos de coacervados. Contrariamente a eso, los coacervados grandes que superaban los 1000 nm de tamaño tendían a formarse cuando la concentración de ambos polímeros aumentaba a 0,25% o más. La capacidad del quitosano de formar coacervado espontáneamente se debe a la interacción de polielectrolitos con carga opuesta para formar un complejo de polielectrolitos con solubilidad reducida. Por lo tanto, es más probable que la mezcla de alta concentración de DS con CS afecte el enredo de las cadenas de CS y la solubilidad del complejo resultante. Como resultado, se producirá un alto grado de complejación y coacervado . La disminución de la viscosidad a una concentración más baja de CS también resultó en una mejor solubilidad. Esto permitió una interacción más eficiente entre el CS catiónico y los iones con carga opuesta, y por lo tanto se produjo un tamaño de partícula más pequeño . Además, un aumento y exceso en la masa molar del polianión utilizado resultó en partículas más grandes porque se formaron complejos altamente neutralizados y tendieron a flocular . En este estudio, la carga superficial de partículas del sistema de nanopartículas dependía de la relación de peso de DS y CS. Se encontró que la carga de la superficie de las partículas aumentaba a medida que disminuía la relación. Esta relación podría ser útil para obtener la densidad de carga de superficie de partículas deseada para facilitar la adhesión y las propiedades de transporte de las nanopartículas.

En el presente estudio, la incorporación de BSA en NPs de CS se logró simplemente mezclando la solución de CS ácida que contiene moléculas de BSA disueltas con la solución de DS a temperatura ambiente sin adición de estabilizador. El ASB se utiliza con frecuencia como proteína modelo porque abarca la característica general de otras proteínas y es biocompatible para los seres humanos. Se encontró que las NPS de CS eran comparativamente más grandes después de la carga con BSA. Se esperaba que el tamaño de las partículas aumentara cuando el ASB se cargara con éxito en nanopartículas. Esta tendencia puede deberse posiblemente al peso molecular y al tamaño de las moléculas de ASC añadidas. Estos grandes tamaños de partículas pueden limitar su uso en la entrega de proteínas. Las nanopartículas de 150-300 nm se encuentran principalmente en el hígado y el bazo . Además, según algunos informes, el requisito de tamaño” ideal ” para las nanopartículas desarrolladas para el tratamiento del cáncer es de entre 70 y 200 nm . Aunque las nanopartículas no deben ser mayores de 150 nm para cruzar la barrera endotelial, la literatura siempre reporta la penetración de partículas mayores que los límites de las fenestraciones. De hecho, la fenestración y la vasculatura pueden sufrir modificaciones bajo diversas condiciones patológicas .

Por ejemplo, el crecimiento tumoral inducirá el desarrollo de neovasculatura caracterizada por endotelio discontinuo con fenestraciones grandes de 200-780 nm . Además, se observó que la carga superficial de partículas de nanopartículas cargadas con BSA era mayor que las vacías. Esto puede deberse a la característica catiónica que posee el ASC cuando está presente en estado ácido. Por lo tanto, las cargas positivas de las moléculas CS y BSA han contribuido a un mayor valor de carga de superficie de partículas para las nanopartículas cargadas.

Los polímeros catiónicos cargados positivamente pueden unirse y proteger eficazmente a ácidos nucleicos como ADN, oligonucleótidos y ARNip . En este estudio, la incorporación de siRNA en NPs de CS se logró simplemente mezclando la solución de CS ácida con la solución de DS que contiene siRNA a temperatura ambiente. Se encontró que el tamaño de partícula de las NPs de CS era comparativamente menor después de la carga con siRNA. El tamaño más pequeño de las NPs de CS cargadas con siRNA podría deberse a la neutralización de las cargas negativas de ácido nucleico por el polímero catiónico, lo que resulta en nanopartículas condensadas de menor tamaño. Las NPS CS cargadas con siRNA también mostraron un mayor potencial zeta que las NPs CS en blanco, siguiendo la misma tendencia que las NPs CS cargadas con BSA.

Idealmente, un sistema de administración exitoso debe tener un alto grado de asociación de medicamentos. Los NPs CS cargados con siRNA mostraron una mayor eficiencia de atrapamiento (<90%) para todas las relaciones de peso DS : CS. La eficiencia de atrapamiento de nanopartículas en relación de peso DS : CS de 1: 1, 1.5 : 1 y 2 : 1 fue mayor que la relación de peso de 0,5: 1. Este fenómeno se debió probablemente a una mayor proporción de DS presente en las nanopartículas. A medida que se agregue más DS, facilitaría que se atrapara más BSA en nanopartículas. Esto podría explicarse por el hecho de que el ASC es una molécula zwitterionica. Al pH del medio de formulación de 3,5-4,0, la solubilidad del ASC podría aumentar considerablemente debido al aumento de las cargas positivas que posee . Por lo tanto, el BSA podría unirse electrostáticamente y cargarse de manera estable en las nanopartículas. En solución ácida, el BSA podría poseer carga positiva y competir con el CS para interactuar con el DS electrostáticamente. Este hallazgo se corroboró con el aumento de las cargas positivas en superficie de las NPS de CS cargadas con BSA en comparación con las descargadas. Por otra parte, hay multi-iónico sitios en BSA, y esta característica podría facilitar la incorporación de la BSA en nanopartículas. Este hallazgo difiere del hallazgo con NPs CS-TPP .

En el estudio, la interacción electrostática estuvo presente entre ASC y CS, en lugar de ASC y TPP. También se sugirió que el ASC debería disolverse en una solución con un pH más alto que su punto isoeléctrico para que el ASC posea carga negativa e interactúe con las moléculas CS cargadas positivamente. Por lo tanto, este hallazgo demostró que la interacción electrostática es el principal factor que contribuye a promover la incorporación de BSA en las nanopartículas, ya sea a través de la interacción CS-proteína o la interacción DS-proteína.

TEM permite la visualización a nanoescala de nanopartículas individuales y proporciona información de tamaño y morfología. La morfología de las partículas es un factor importante para la estabilidad coloidal y química, así como para la bioactividad de las nanopartículas. El NPs de CS cargado con siRNA mostró morfología irregular; sin embargo, el NPs de CS cargado con ASC mostró morfología alargada. Esto podría deberse a un mayor tamaño de ASC que puede enredarse o actuar como un escudo para CS, limitando así la exposición general de CS dentro de la estructura.

El perfil de estabilidad de CS NPs durante el almacenamiento también es importante. Esta información podría proporcionar una visión sobre la estabilidad de las nanopartículas bajo diferentes medios y temperaturas. La estabilidad de las nanopartículas se investigó evaluando su variación en el tamaño medio de las partículas y la carga superficial a lo largo del tiempo. Al principio, las nanopartículas se resuspendieron en agua destilada a un pH de 6,6 que se filtró con un filtro de 0,2 µm para eliminar los posibles contaminantes presentes en el agua. Para este estudio, solo se probaron nanopartículas hechas de 0,05 y 0,10% p/v de DS. No se determinaron otras concentraciones de DS debido al aumento del tamaño de las partículas después de la centrifugación. El tamaño de partícula fue de hasta nm y nm para 0,15% y 0,20% p / v DS, respectivamente. El incremento del tamaño de partícula puede debido a las propias NPs de CS erosionarse y perder su forma esférica en un ambiente acuoso, y en consecuencia el diámetro medio de la partícula aumentaría como respuesta a esta erosión . Además, las cargas superficiales de las partículas para las nanopartículas producidas a partir de ambas concentraciones fueron disminuyendo con el tiempo. Se sospechó que el CS puede degradarse en medios acuosos aunque en ausencia de lisozimas. Los resultados mostraron que las NPs de CS eran más estables cuando se almacenaban a 4°C, ya que su tamaño de partícula y carga de superficie no se modificaban o cambiaban ligeramente hasta 14 días. Los resultados también sugirieron que el CS NPs no debe ser almacenado a temperatura ambiente ya que son propensos a la degradación. Por lo tanto, los resultados sugirieron que las NPS de CS almacenadas a temperatura ambiente son más propensas a la degradación que las que se almacenaron en un ambiente fresco. Probablemente se debió al ambiente frío que puede ralentizar el movimiento cinético de las nanopartículas. Por lo tanto, las nanopartículas podrían mantener su forma esférica y la erosión sería menos probable que ocurriera. Además, se observó que estas nanopartículas se agregaban en PBS a un pH de 7,4. Esto puede atribuirse a una carga superficial de partículas más baja de nanopartículas en PBS, casi neutra. La carga superficial de partículas que cayó a cero puede indicar que las NPS de CS habían sufrido cancelación de carga por grupos fosfatados de PBS. El estado de carga neutra de estas nanopartículas puede causar la pérdida de fuerzas intra e intermoleculares, importante para mantener las nanopartículas individualmente. Como resultado, estas nanopartículas sin carga pueden comenzar a agregarse y desestabilizar el sistema coloidal. A diferencia del PBS, el agua destilada puede proporcionar numerosos iones de hidrógeno para formar enlaces de hidrógeno que pueden ayudar a romper la agregación de nanopartículas al interactuar con grupos ionizables de NPs CS.

El estudio de liberación in vitro de ASC y siRNA a partir de NPs de CS se llevó a cabo en tampón Tris-HCL. La liberación de BSA y siRNA podría dividirse en dos etapas basadas en la tasa de liberación. En la primera etapa, el fármaco se liberó rápidamente de las NPs de CS. La liberación de BSA y siRNA en esta etapa podría implicar la difusión de BSA/siRNA unidos a la superficie de la partícula. En la segunda etapa, BSA / siRNA se liberó lentamente debido a la hinchazón o degradación del polímero. El resto de ASC / siRNA en las NPs de CS no se liberaría completamente hasta que las partículas se erosionaran completamente o se disolvieran en el medio de liberación. Esto podría deberse a la interacción entre el resto de ASC/siRNA y el grupo amino libre en los segmentos CS . Además, el sistema sintetizado que se ha descrito anteriormente como capaz de formularse en condiciones suaves aseguró que la estabilidad de las proteínas cargadas en CS NPs estaba intacta según lo determinado por SDS-PAGE.

5. Conclusiones

En resumen, este estudio muestra que la concentración de CS y DS, así como el pH, fueron los parámetros que controlan el tamaño de partícula y la carga superficial de las NPs de CS. Se podían obtener nanopartículas inferiores a 500 nm con una relación de peso DS : CS de 0,5 : 1 a pH 4. En el caso de atrapamiento de ASC, las nanopartículas con proporciones de peso DS : CS más altas han poseído eficiencias de atrapamiento más altas de más del 88%. El porcentaje más alto de eficiencia de atrapamiento alcanzado fue de 0,10% p/v DS (relación DS : CS de 1 : 1). Sin embargo, las NPs CS cargadas con siRNA mostraron una alta eficiencia de atrapamiento (>90%) para todas las relaciones DS : CS. Se encontró que la temperatura de almacenamiento y el medio de suspensión eran los factores que podían influir en la estabilidad de las fuentes de energía nuclear de CS. Las NPs de CS eran lábiles y tendían a desestabilizarse a temperatura ambiente, pero retenían este comportamiento lábil cuando se proporcionaba un ambiente fresco (2-4°C). Además, las NPS de CS tenían mejor estabilidad en el agua destilada que en el PBS, lo que podría deberse a los enlaces de hidrógeno que se formaron entre las moléculas de agua y los grupos ionizables de NPs de CS.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses personales o financieros en la investigación actual.

Reconocimiento

Los autores agradecen a “Dana Lonjakan Penerbitan” de Universiti Kebangsaan Malasia (UKM-DLP-2011-001) por financiar y apoyar el proyecto de investigación actual.